Article de méthode

Profilage anti-Neu5Gc IgG dans les sérums humains avec un dosage de microarray de sialoglycan

DOI :

10.3791/56094

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13 juillet 2017

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1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un dosage de microarray de sialoglycane peut être utilisé pour évaluer les anticorps anti-Neu5Gc dans des sérums humains, ce qui en fait un test de diagnostic potentiel à haut débit pour le cancer et d'autres maladies chroniques à médiation par inflammation chronique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules sont recouvertes d'un manteau de chaînes de glucides (glycans) qui est couramment modifié dans le cancer et qui comprend des variations dans l'expression de l'acide sialique (Sia). Ce sont des sucres acides qui ont un squelette à 9 atomes de carbone et qui captent des glycans vertébrés sur les surfaces cellulaires. Deux des principales formes de Sia chez les mammifères sont l'acide N- acétylneuraminique (Neu5Ac) et sa forme hydroxylée, l'acide N- glycolylneuraminique (Neu5Gc). Les humains ne peuvent pas produire Neu5Gc endogène en raison de l'inactivation du gène codant pour l'hydroxylase de la cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). L'étranger Neu5Gc est acquis par les cellules humaines grâce à la consommation alimentaire de viande rouge et de produits laitiers et apparaît par la suite sur des glycans divers sur la surface de la cellule, s'accumulant principalement sur les carcinomes. Par conséquent, les humains ont des anticorps anti-Neu5Gc circulants qui jouent divers rôles dans le cancer et d'autres maladies chroniques menées par l'inflammation et qui deviennent potentiellement diagnostiques et thérapeutiquesRgets. Ici, nous décrivons un dosage de microarray de sialoglycane à haut débit pour évaluer ces anticorps anti-Neu5Gc dans les sérums humains. Les glycans contenant Neu5Gc et leurs paires de témoins appariés (glycans contenant Neu5Ac), chacun avec une amine primaire centrale, sont liés de manière covalente aux glissières en verre revêtues d'époxy. Nous illustrons l'impression de 56 diapositives dans un format de 16 puits à l'aide d'une nano-imprimante spécifique capable de générer jusqu'à 896 tableaux par impression. Chaque diapositive peut être utilisée pour cribler 16 échantillons de sérums humains différents pour l'évaluation de la spécificité, de l'intensité et de la diversité des anticorps anti-Neu5Gc. Le protocole décrit la complexité de cet outil robuste et fournit une ligne directrice de base pour ceux qui cherchent à étudier la réponse à l'antigène carbohydrate alimentaire de Neu5Gc dans divers échantillons cliniques dans un format de tableau.

Introduction

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Sias sont des sucres acides couvrant les chaînes de glycan sur les glycoprotéines de la surface cellulaire et les glycolipides chez les vertébrés. L'expression de Sia est modifiée dans les cellules cancéreuses 1 et est en corrélation avec la progression et / ou la métastase 2 , 3 . Deux des principales formes de Sia chez les mammifères sont Neu5Ac et sa forme hydroxylée, Neu5Gc 2 . Les humains ne peuvent pas synthétiser Neu5Gc en raison d'une inactivation spécifique du gène codant pour l'enzyme CMAH. Ce Sia non-humain incorpore métaboliquement dans les cellules humaines comme «soi», provenant d'aliments riche en vitamines Neu5Gc ( p. Ex., Viande rouge) 4 , 5 . Neu5Gc est présent à des niveaux faibles sur les surfaces cellulaires de l'épithélium humain et de l'endothélium, mais il s'accumule surtout dans les carcinomes. Neu5Gc est reconnu comme étranger par le système immunitaire humoral humain 2 , 6 .La complexité antigénique de Neu5Gc-glycans peut apparaître à plusieurs niveaux, y compris la modification de Neu5Gc, la liaison, les glycans sous-jacents et les échafaudages, et leur densité, tout en étant réfléchi par la complexité de la réponse des anticorps anti-Neu5Gc chez l'homme 6 . Certains de ces anticorps servent de biomarqueurs de carcinome et d'immunothérapies potentielles 7 . L'apparition de la synthèse chimio-enzymatique de différents sialoglycans 8 a ouvert la voie à une analyse plus approfondie de ces anticorps, facilitée par l'utilisation de la technologie de microarray glycan 9 , 10 . Ainsi, avec la préparation et la manipulation facilitées de grandes bibliothèques de glucides naturels et synthétiques, les microarrays de glycan sont devenus une puissante technologie à haut débit pour étudier les interactions des glucides avec une myriade de biomolécules 10 , 11 , 12 , 13 . Dans un format de tableau, des quantités minimales de matériaux sont utilisées, et cet affichage multivalent de glycans biologiquement pertinents permet d'étudier des milliers d'interactions de liaison dans une seule expérience. Il est important de noter que cette technologie peut également être appliquée à la découverte de biomarqueurs et à la surveillance des réponses immunitaires dans divers échantillons 7 , 12 .

La fabrication réussie de microarray de glycan exige la prise en compte de trois aspects importants: le type de robot de l'imprimante, la chimie de la conjugaison du glycan et l'optique de détection. En ce qui concerne la considération de l'instrument d'impression, deux techniques sont disponibles: les imprimantes sans contact et sans contact. Dans l'impression par contact, 1 à 48 broches en acier sont plongés dans une plaque source multi-puits contenant une solution de glycan et sont repérés sur des lames de verre fonctionnalisées en contactant directement la surface de glissement en verre. La quantité de la solution est deLié à la glissière est une fonction de la durée persistante sur la surface de la glissière. Habituellement, les échantillons sont d'abord pré-tachés sur un bloc de verre (pour atteindre des taches homogènes) avant d'être imprimés sur la surface de glissement. Dans les imprimantes sans contact ( par exemple, l'imprimante piézo-électronique), les glycanes sont imprimés à partir d'un capillaire en verre à l'aide de signaux électriques contrôlés. Le signal électrique peut être étalonné finement pour obtenir une impression plus précise par rapport à l'impression par contact. La taille et la morphologie des taches sont également relativement plus homogènes. Un avantage supplémentaire est le recyclage de l'échantillon à la plaque source après l'impression. Néanmoins, l'inconvénient majeur des imprimantes piézoélectriques est la limitation de l'impression (4 ou 8), ce qui donne une durée d'impression très longue, ce qui nécessite une attention particulière à la stabilité du glissement, à la température, à l'humidité et à l'évaporation de l'échantillon. L'imprimante jet d'encre sans contact nécessite des volumes d'échantillons plus importants 14 .

Contrairement aux options disponibles limitées pour les méthodes d'impression, la chimie de la conjugaison du glycan est une considération plus complexe, avec de nombreuses options à choisir. La chimie d'immobilisation sélectionnée doit tenir compte à la fois des groupes actifs sur les glycanes et de la réactivité de la surface coulissante. Les glycanes à immobiliser sur une surface de microarray spécifique, synthétisée synthétiquement ou naturellement isolée, nécessitent tous un groupe réactif identique. De plus, les glycans doivent être purs et homogènes. D'autre part, la surface d'immobilisation et la chimie devraient fournir une reproductibilité et une densité d'attache fiables. Des méthodes d'immobilisation multiples ont été développées avec des attaches 10 , 11 , 12 , 13 covalentes ou non covalentes (absorption physique). Pour des informations très détaillées sur la technologie de microarray glycan imprimée pour les non-initiésD enquêteur, se référer à ces excellentes critiques 13 , 15 . Il est important de noter que les récentes informations minimales requises pour une initiative Glycomics Experiment (MIRAGE) décrivent les lignes directrices pour la préparation des échantillons 16 et pour la déclaration des données des analyses de microarrays glycaniques 17 pour améliorer les normes dans ce domaine en pleine croissance.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la fabrication de microarrays de sialoglycane à l'aide d'une nano-imprimante de contact spécifique au format 16 puits. Chacun des glycanes possède une amine primaire qui sert de médiation à leur liaison covalente aux glissières en verre à activation époxydique. Nous décrivons également le développement et l'analyse d'une diapositive en utilisant divers échantillons de sérums humains, des anticorps et des lectines de plantes liant le Sia. Les tests de microarray de sialoglycane comportent plusieurs étapes importantes qui incluent la fabrication, le traitement, le développement et l'analyse de la matrice. La fabrication de tableau exige la planification de l'arLa disposition des rayons, la préparation des glycans et de la plaque d'origine, la programmation de la nano-imprimante et l'impression des diapositives. Par la suite, les diapositives sont traitées, développées et analysées ( figure 1 ).

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Protocole

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Des échantillons de sérums humains ont été obtenus auprès de la Banque de sang israélienne et ont été utilisés conformément à la déclaration d'Helsinki et au Conseil d'examen institutionnel de l'Université de Tel Aviv.

1. Planification et mise en page de la fabrication de matrice

  1. Déterminez la disposition des diapositives.
    REMARQUE: Chaque diapositive contient 16 sous-tableaux divisés en 16 blocs identiques numérotés B1 à B16 ( Figure 1B , Figure complémentaire 1A ).
  2. Déterminez la disposition des broches. Utilisez quatre broches, chaque impression de quatre sous-arrays (blocs) par diapositive:
    La broche 1 imprime les blocs 1, 2, 9 et 10;
    La broche 2 imprime les blocs 3, 4, 11 et 12;
    La broche 3 imprime les blocs 5, 6, 13 et 14; et
    La broche 4 imprime les blocs 7, 8, 15 et 16 ( figure supplémentaire 1A ).
  3. Déterminer le bloc et la disposition des plaques de 384 puits.
    REMARQUE: L'ordre dans lequel les glycans apparaissent dans chaque bloc nécessite une planification minutieuse. Dans cet exemple, arrAy, imprimez chaque échantillon à quatre répétitions, concevez des taches de marqueur fluorescent pour être situées dans le coin inférieur droit (pour faciliter l'analyse spot) et imprimez des taches d'IgG à courbe standard (STD) à six concentrations croissantes ( figure supplémentaire 1B ).
    1. Pour chaque point imprimé, déposez d'abord le matériau dans quatre puits (un pour chaque broche) dans une plaque de 384 puits.
      REMARQUE: L'ordre des matériaux dans la plaque de 384 puits repose sur la disposition des blocs conçus ( figure complémentaire 1B-C ).

2. Préparation des Glycans et de la Source Plate

  1. Préparer un tampon d'impression au glycan (50 ml de tampon phosphate 300 mM, pH 8,4). Peser 58,5 mg de phosphate monosodique monohydraté (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) et 3,9 g de phosphate disodique heptahydraté (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) dans 40 mL d'eau désionisée (DIW). Titrer à pH 8,4 en utilisant NaOH 4 M. Réglez le volume à 50 mL etD filtre à travers une membrane de 0,2 μm pour la stérilisation.
  2. Préparer le tampon marqueur (50 ml de tampon phosphate 187 mM, pH 5). Pesez 289 mg de phosphate monosodique monohydraté (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) et 1,94 g de phosphate disodique heptahydraté (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) dans 40 mL de DIW. Titrer à pH 5 en utilisant HCl 1 M. Réglez le volume à 50 ml et filtrer dans une membrane de 0,2 μm pour la stérilisation.
  3. Préparer un tampon de courbe STD (50 ml de PBS-glycerol: solution salée tamponnée au phosphate, pH 7,4, additionné de 10% de glycérol à partir d'un stock de glycérol à 100%) et le filtrer à travers une membrane de 0,2 μm pour la stérilisation.
  4. Préparez chaque solution stock de glycan à 10 mM dans le DIW. Vérifier les concentrations de glycan sialylées par détection de fluorescence sur analyse par chromatographie liquide haute pression à haute température 18 .
  5. Diluer chaque glycan à 100 μM dans un volume total de 100 μL de tampon d'impression glycanDans des tubes à microcentrifugeuse.
  6. Préparer un colorant fluorescent contenant une amine primaire. Solubiliser Alexa 555-hydrazide à 1 mg / mL avec un tampon marqueur puis diluer à 1 μg / mL dans un volume total de 1 ml.
    NOTE: Tout autre colorant contenant une amine primaire peut être utilisé avec une longueur d'onde appropriée selon le scanner à glissière.
    REMARQUE: les points de marqueur facilitent l'alignement de la grille dans chaque bloc pendant l'analyse.
  7. Préparer les dilutions de la courbe des MST des IgG humaines: préparer 0,5 ml d'une solution stock d'IgG humaine à 160 ng / μL dans le tampon de la courbe STD. Diminuer en série le stock 1: 1 six fois pour obtenir 80, 40, 20, 10, 5 et 2,5 ng / μL, tous dans un tampon de courbe STD à un volume total de 200 μL chacun.
    NOTE: D'autres isotypes d'Ig peuvent être utilisés si approprié à l'expérience ( p. Ex., IgA humaine, IgM, IgE ou une Ig d'un organisme différent).
  8. Placez la plaque de 384 puits sur de la glace. En utilisant une multi-pipette électronique, une aliquote de 7 μL de chaque glycan, marqueur et courbe STD IgG-quatre répliqueS de chacun - selon la disposition des plaques ( figure supplémentaire 1C ). Pour une meilleure précision, charger 35 μL de chaque échantillon et une aliquote de 7 μL dans chacun des quatre puits de l'échantillon. Placez les 7 μL restants de chaque glycan dans leur tube d'origine.
  9. Couvrez la plaque avec du parafilm et faites tourner pendant 2 min à 250g et 12 ° C. Placez la plaque à température ambiante (RT), protégée de la lumière. Ne découvrez pas la plaque avant que l'humidité dans la pièce atteigne 60-70%.

3. Programmation de la Nano-imprimante

  1. Ouvrez le logiciel "Microarray Manager". Utilisez la fenêtre "Propriétés de la méthode".
  2. Configurez la disposition de la table de travail: choisissez la "configuration 56 diapositive".
    REMARQUE: il s'agit d'une configuration prédéfinie qui permet l'impression de 56 diapositives. Calibrez pour chaque type de plaque, de broche et de format d'impression ( Figure complémentaire 2 , étape 1).
  3. Sélectionnez "Configuration des broches"| "Pin Tool 1x4 9 mm".
    REMARQUE: il s'agit d'une configuration prédéfinie pour l'utilisation de quatre broches ( figure complémentaire 2 , étape 2).
  4. Définissez le "type de broche". Calculez et créez le type de broche qui convient à l'impression.
    REMARQUE: Cette étape définit le nombre de taches que l'on imprimera avant d'effectuer une nouvelle imitation dans l'échantillon 384-puits et devrait être optimisé pour les différents types de broches et la chimie de la surface de glissement.
    REMARQUE: Lors de l'utilisation de broches 946MP3, considérez deux problèmes importants: 1) chaque broche peut imprimer jusqu'à 140 taches homogènes et 2) le pré-repérage est essentiel pour évacuer l'excès de liquide de l'extrémité de la broche avant d'imprimer sur les diapositives. Par conséquent, programmez chaque broche pour imprimer 20 pré-spots sur un bloc de préimpression (optimisé pour les broches 946MP3 sur les lames recouvertes d'époxy).
    1. Calculez le nombre total de spots imprimés par échantillon.
      REMARQUE: Ici, chaque broche imprime 4 points par sous-tableau (bloc); Un total de 4 sous-arrays par diapositives = 16 spots / slIde. Après 7 diapositives, chaque broche imprime 16 x 7 = 112 points. En outre, 20 pré-taches avant impression donnent 132 spots / plongée. Par conséquent, le type de broche est défini comme "946MP3-132 spots" (4 spots par échantillon par bloc x 4 blocs x 7 diapositives + 20 pré-taches = 132).
    2. Créez le "type de broche" ( figure supplémentaire 2 , étape 3). Appuyez sur "Configuration" (panneau gauche du logiciel) | "Micro Spotting Pins" | "Nouveau nom" (946MP3-132 spots). Définir le nombre de taches par immersion (132), le diamètre de la tache (100 μm), l'absorption (0,25 μL), la livraison (0,7 nL) et l'espacement minimal des taches (100 μm). Appuyez sur "OK" | "D'ACCORD."
    3. Dans la fenêtre "Propriétés de la méthode", sélectionnez le type de broche créé: "946MP3-132 spots".
  5. Définir les conditions de lavage. Réglez "Laver avant le démarrage" et "Laver après la finition" à "Lavage normal" ( Figure 2 supplémentaire , étape 4).
  6. Définissez la "liste des plaques".
    REMARQUE: il s'agit du modèle d'échantillonnage de la plaque (l'ordre des creux de la plaque de 384 puits) selon la disposition des plaques. Pour télécharger la plaque dans la liste des plaques, configurez un modèle d'échantillonnage de la plaque.
    1. Créez la plaque "Modèle d'échantillonnage". Accédez à "Modèles" ( figure supplémentaire 3 ) | "Patterns d'échantillonnage". Donnez un nouveau nom ( p. Ex ., Tableau JoVE) et sélectionnez "Insérer" | "Remplir en haut en bas" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Sélectionnez l'ordre des micros de puits selon la disposition de la plaque prédéfinie ( Figure complémentaire 1A ). Appuyez sur "OK" | "D'ACCORD."
    2. Chargez le schéma d'échantillonnage des plaques. Cliquez sur le côté droit de la cellule "Liste des plaques" ( figure supplémentaire 3 ) | "Ajouter une assiette" et sélectionnez le modèle d'échantillonnage de plaque correct (le "tableau JoVE" décrit à l'étape 3.6.1). Sélectionnez "Normal Wash". presse"OK" | "D'ACCORD."
  7. Accédez aux "Plaques d'échantillonnage" et modifiez le décalage de position sur 1 (ce qui détermine l'endroit où se trouve la plaque sur le plateau de l'archeyer).
    REMARQUE: La position décalée de 0 est plus proche du bain sonicateur.
  8. Définissez le "Microarray Print Design". Calculez les distances et l'espacement entre blocs et blocs.
    1. Considérons les dimensions de l'outil de développement qui divise la glissière en 16 puits de 7 x 7 mm, avec des espaces de 2 mm entre les sous-réseaux (un total de 9 mm entre les blocs, Figure supplémentaire 4 ).
    2. Considérons les dimensions du sous-tableau.
      REMARQUE: l'espacement entre les points est de 0,275 mm et il y a 12 colonnes et 18 lignes dans cette conception d'impression; Les dimensions totales sont: largeur (11 x 0,275 mm = 3,025 mm) et hauteur (17 x 0,275 mm = 4,675 mm). Calculez l'espacement horizontal: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Calculez l'espacement vertical: 9 mm - (17 x 0,275) = 4,325 mm. Calculez dÀ partir du côté gauche de la glissière: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Calculez la distance du côté supérieur de la glissière: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm ( Figure complémentaire 4 ).
    3. Définissez les «dessins imprimés» ( figure complémentaire 5 ). Sélectionnez "Modèles" | "Dessins imprimés" | "Nouveau."
      1. Sélectionnez "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 spots". Dans l'onglet "Général", modifiez le "Nom de l'impression Microarray" ( c.-à-d. "Ensemble JoVE"). Sélectionnez "Spot Speed" | "Numéro répliqué" (4) | "Hauteur du point tactile" (0 mm) | "Hauteur tactile" (3 mm) | «Impression sur toutes les positions disponibles» ( figure complémentaire 5A ).
      2. Dans l'onglet "Microarray", choisissez l'espacement horizontal et vertical (5.9 mm et 4.325 mm de l'étape 3.8.2) et le nombre de microarrays horizontaux et verticaux (2). Sélectionnez "ImprimerMicroarray Horizontalement "|" Print Dupliquer Microarray "( Figure complémentaire 5B ).
      3. Dans l'onglet du sous-tableau, choisissez le nombre maximal de colonnes (12), le nombre maximum de lignes (18) et la distance entre les colonnes et les lignes (275 μm) ( Figure complémentaire 5C ).
      4. Dans l'onglet Mesures, choisissez la distance du côté gauche de la glissière (5,5 mm), la distance du haut de la glissière (3,5 mm, calculée à l'étape 3.8.2), la largeur de la diapositive d'impression (25 mm) , Et la hauteur de la diapositive d'impression (75 mm) ( Figure complémentaire 5D ). Appuyez sur "OK" | "D'ACCORD."
  9. Cliquez sur le côté droit de la cellule "Microarray Print Designs" et sélectionnez la conception définie (le "tableau JoVE" à partir de l'étape 3.8.3, Figure complémentaire 6 ).
  10. Définissez le "Comptage des diapositives" (56) et modifiez le "Décalage de position" (0). Cela détermine le poDe la première diapositive à imprimer sur le pont arrayer ( figure supplémentaire 6 ).
  11. Définissez la "Pré-impression Microarray" ( Figure 6 supplémentaire ). Sélectionnez "Verre Bloc" | "Pre-Print 1 x 4 mm Pin Tool".
    REMARQUE: Ce réglage de localisation permet 46 464 pré-spots (pour tous les 4 broches) sur le bloc de verre, donc 46 464/4 = 11 616 points pré-spots par broche. Lorsque l'espace sur le bloc de préimpression a été épuisé, l'imprimante s'arrête et le bloc doit être retourné.
    REMARQUE: pour calculer après combien d'échantillons le bloc de pré-impression est plein, considérez ce qui suit: chaque échantillon sera prélevé par 8 piqûres dans la plaque de 384 puits pour compléter 56 diapositives (7 diapositives par immersion) et chaque plongée Dispose de 20 pré-spots supplémentaires, ce qui donne un total de 160 pré-taches par échantillon. Par conséquent, 11 616/160 = 72,6 échantillons. Ainsi, le bloc de verre pré-imprimé devrait être retourné après 72 échantillons (pour évaluer le temps de basculement, mesure hSinon il faut un échantillon pour compléter une course complète sur 56 diapositives, puis multipliez par 72).
  12. Sélectionnez "Utiliser la conception PrePrint" | "Oui" | "Numériser les codes à barres" (Non) | "Print Single Replicate" (Non) ( Figure complémentaire 6 ).
  13. Cliquez sur "Valider" ( complémentaire Figure 6 ).
  14. Cliquez sur "Enregistrer" et enregistrez la méthode comme un fichier arr ( par exemple, "JoVE array.arr", Figure complémentaire 6 ).

4. Impression de tableaux conçus

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une salle blanche avec une humidité de 60 à 70% et avec des gants et des vêtements appropriés pour la protection

  1. Allumez la machine à nano-imprimante et l'humidificateur.
  2. Pour le tampon de lavage et l'humidification, remplir avec de l'eau DI. Videz la bouteille de lavage (vidange) et le carburage d'humidification ( figure supplémentaire 7A ).
  3. Réglez l'humidificateur à70% d'humidité et commencer l'humidification.
  4. Nettoyez toutes les broches avant d'imprimer. Préparez 50 ml d'une solution de nettoyage à pointeau (65 ° C) (15 g de réactif de nettoyage à broche et 50 ml d'eau à 65 ° C, mélangée jusqu'à ce que le réactif solide se dissout complètement).
    1. Appliquer la solution de nettoyage sur chaque pointe de broche en immergeant la brosse à broche (fine) dans la solution de nettoyage des broches et en brossant la surface de chaque extrémité de broche.
      REMARQUE: La solution de nettoyage à pointe est corrosive et toxique. Veillez à porter des gants et des lunettes de sécurité en tout temps lors de l'utilisation de cette solution. Les goupilles de trempage dans la solution de nettoyage à pointeau pendant plus de quelques minutes peuvent entraîner des dommages permanents aux broches.
    2. Remplissez le bain à ultrasons avec 1 L d'eau distillée et placez les goupilles dans un support de nettoyage à épingle flottant dans le bain. Sonicate pendant 5 min et retirez les broches. Laisser sécher et essuyer doucement avec des lingettes spéciales pour salle blanche.
  5. Ouvrez l'impression "Microarray Manager"Logiciel er; Lors de la connexion, le voyant de l'imprimante s'allume (rouge / vert). Appuyez sur "Arrêter" | "Clair" | "Init" ( figure supplémentaire 7B , étapes 1 à 3); Le bras de la tête d'impression réinitialise les alignements X, Y, Z.
  6. Pour charger les broches dans la tête d'impression, appuyez sur "Charger" ( Figure 7B supplémentaire , étape 4) et placez les broches dans la tête d'impression selon la configuration définie de la disposition de l'outil d'impression / broche ( Figure supplémentaire 7C ); Cette disposition utilise 4 broches, chaque impression de 4 sous-tableaux sur chaque diapositive pour obtenir au total 16 sous-tableaux par diapositive ( Figure 1A supplémentaire ). Après avoir placé les broches, appuyez à nouveau sur "Init".
  7. Assemblez les diapositives sur le plateau de l'arche. Ouvrez la glissière et nettoyez chaque glissière en soufflant d'azote à haute pureté. Placez le nombre souhaité de diapositives sur la plate-forme de tableau. Tenez les diapositives avec deux doigts dans les coins inférieurs, puis placez la glissière dans sonposition. Tenez les deux coins droits et enfoncez doucement les coins gauche jusqu'à ce que la glissière s'accroche à sa position. Pousse doucement vers le coin gauche vers le bas pour assurer un ajustement serré ( figure supplémentaire 7D ).
  8. Nettoyez le verre pré-bloc avec de l'eau distillée, 70% d'éthanol et 100% d'éthanol et laissez-le sécher à l'air libre (utilisez uniquement des lingettes dédiées à la salle de nettoyage). Placez le verre pré-bloc dans sa position sur le pont.
  9. Remplissez un bain sonicateur ( figure supplémentaire 7B ). Appuyez sur "Remplir" pour 55 s, puis appuyez sur "OK". Vidange le sonicateur en cliquant "Dégagement" pendant 20 s, puis en appuyant sur "OK". Répétez le remplissage et le drainage une fois de plus, puis rallumez encore pendant 55 s.
  10. Remplissez le bain de lavage ( Figure supplémentaire 7B ): appuyez sur "Prime" pendant 40 s, puis appuyez sur "OK".
  11. Placez la plaque de 384 puits avec des échantillons aliquotes dans son emplacement sur le pont de l'arraiseur et retirez le cache du parafilm.
  12. Commencez à imprimer.
  13. Une fois l'impression terminée, égoutter le bain sonicateur ( figure supplémentaire 7B ) et éteindre l'humidificateur.
  14. Laissez les glissières sécher sur le pont arrayer pendant 16-24 h sans humidification.
  15. Numérotez les diapositives avec un stylo de marquage résistant aux alcools / solvants et rangez-les dans une boîte étanche au vide dans l'obscurité.

5. Traitement et développement des tableaux

  1. Retirez une glissière de la boîte étanche au vide et placez-la dans un capot chimique pendant 5 minutes, faites face vers le haut, pour évaporer l'excès de liquide.
  2. Numérisez la diapositive au gain le plus élevé (950 PMT) pour vous assurer que toutes les taches ont été imprimées.
  3. Procéder au blocage chimique des groupes époxy sur la glissière
    1. Préparer 50 ml d'une solution bloquant de l'éthanolamine (Tris-HCl 0,1 M, pH 8 et éthanolamine 0,05 M). Mélanger 140 mL de DIW avec 8,8 ml de Tris-HCl (1,7 M, pH 8) et 0,45 ml d'éthanolamine (16,6 M). Transférer à un 5Tube de coloration de 0 ml ( Figure complémentaire 8A ) et chaud à 50 ° C.
    2. Hydratez la glissière. Placez la glissière dans un tube de coloration rempli de DIW, recouvrez-le avec du papier d'aluminium et incupez pendant 5 minutes avec un secousses lent et doux à la température ambiante.
    3. Bloquez les groupes réactifs d'époxy sur la glissière. Trempez la glissière dans le tube de coloration de 50 ml rempli d'une solution de blocage d'éthanolamine préchauffée, recouvrez-la avec du papier d'aluminium et incupez pendant 30 minutes avec un tremblement lent et doux à la température ambiante.
    4. Jeter la solution de blocage de l'éthanolamine dans le récipient de détritus biohazard approprié et placer le coulisseau dans un nouveau tube de coloration propre rempli de 50 ° C DIW. Couvrir avec du papier d'aluminium et incuber pendant 10 minutes avec un tremblement lent et doux à la température ambiante.
    5. Jeter l'eau et transférer les glissières sur un support de teinture en verre ( Figure supplémentaire 8B ). Placez le support de vitre dans un support de plaque pivotante et centrifugez le séchage pendant 5 minutes à 200 xg et à la RT.
  4. Mettre en place un diviseur et procéder au blocage biologique.
    1. Placez la glissière sur un diviseur à 16 puits ( figure supplémentaire 8C ).
    2. Préparer une solution de lavage PBST: 50 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
    3. Préparer une solution de blocage biologique (PBS-OVA): 5 ml de PBS, pH 7,4 + 1% d'ovalbumine de poulet (10 mg / mL).
      NOTE: Le choix du réactif de blocage est essentiel pour le succès de la détection des anticorps anti-Neu5Gc. L'ovalbumine est fabriquée dans des poulets qui, comme les humains, ne peuvent pas synthétiser Neu5Gc, provoquant un manque d'expression de ce Sia. Pour la détection de Neu5Gc, même les contaminants mineurs peuvent réduire considérablement la sensibilité de l'analyse, parfois même en ne détectant aucune réactivité anti-Neu5Gc. Par exemple, le réactif de blocage le plus couramment utilisé, l'albumine de sérum bovin (BSA), bien que non glycosylé par lui-même, contient des contaminants IgG bovins qui portent des fragments Neu5Gc et, par conséquent, rivalisent wAvec des glycanes imprimés lors de la liaison à l'échantillon avec des anticorps anti-Neu5Gc 19 , 20 .
    4. Prewet les puits. En utilisant une multi-pipette, aliquotez 200 μL de PBST dans les puits, placez-les dans une chambre humide couverte et secouez pendant 5 minutes.
      REMARQUE: La chambre d'humidité est un bac en verre avec un papier à serviette humide, recouvert d'une enveloppe en nylon et d'un film pour protéger les échantillons de la lumière.
    5. Retirez le PBST en clignotant et en tapotant doucement sur une serviette en papier propre et une aliquote de 200 μL de tampon de blocage PBS-OVA dans chaque puits. Placer dans une chambre humide et incuber pendant 1 h à la température ambiante avec un tremblement doux.
  5. Préparez la détection primaire diluée dans un tampon de blocage PBS-OVA, comme indiqué dans le tableau 2 .
    REMARQUE: Pour l'évaluation de contrôle de la qualité de ce microarray de sialoglycane, utilisez plusieurs protéines de liaison Sia: la lectine Sambucus nigra (SNA), isolée de l'écorce de sureau, devrait reconnaître Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) devrait reconnaître Siaα23; Et l'anti-Neu5Gc IgY de poulet est attendu pour reconnaître tous les sialoglycans contenant de la Neu5Gc. En outre, utilisez divers échantillons de sérums humains pour évaluer la réponse anti-Neu5Gc IgG. La concentration de lectines / anticorps / sérums doit être calibrée expérimentalement.
  6. Nettoyer le tampon de blocage PBS-OVA sec et ajouter 200 μl d'anticorps primaire par puits (volume minimum par puits: 70 μL), incuber dans une chambre humide pendant 2 h.
  7. Flick sécher la détection primaire et de lavage 4 fois avec du PBST (entre le 3 ème et 4 ème lavage, incuber la lame dans PBST pendant 5 min dans la chambre humide). Laver une fois avec PBS.
  8. Préparer l'anticorps secondaire dans le PBS, comme indiqué dans le tableau 2 .
  9. Faire sécher le PBS et ajouter 200 μl d'anticorps secondaire. Incuber pendant 1 h à la température ambiante avec agitation.
  10. Faire sécher l'anticorps secondaire et laver quatre fois avec du PBST (entre 3ème et 4 ème lavage, incuber la lame dans PBST pendant 5 min dans la chambre humide).
  11. Retirez délicatement le cadre et placez les diapositives dans un tube de coloration à glissement de 50 ml rempli de PBS et secouez pendant 5 min.
  12. Remplissez deux bains de coulée ( figure supplémentaire 8D ) avec DIW, placez la glissière dans le support de glissière et laissez-la dans le bain. Trempez rapidement 10 fois, puis transférez au deuxième bain et plongez 10 fois de plus. Incuber pendant 10 min à la RT avec agitation.
  13. Débarrassez-vous de l'eau et transférez la glissière sur un support de teinture en verre ( Figure supplémentaire 8B , laissez la glissière sécher à l'air). Placez le support de vitre dans un support de plaque pivotante et centrifugez le tiroir pendant 5 minutes à 200 g et à la RT.
  14. Numérisez la diapositive, puis rangez-la dans une boîte étanche au vide dans l'obscurité.

6. Analyse de tableaux et analyse de données

  1. Ouvrez le scanner à glissement fluorescent et laissez le réchauffer pendant 5 minutes. Ouvrez leNumérisation et analyse de logiciels.
  2. Définissez les paramètres de balayage ( Figure supplémentaire 9A ): numérisez à 532 nm et 100% de puissance avec un gain de 350 PMT, avec une ligne en moyenne et une position de focalisation de 0 μm. Utilisez une résolution de taille de pixel de 10,0 μm.
    REMARQUE: les paramètres de numérisation peuvent être ajustés à différents types de diapositives, à la fluorescence et à la résolution.
  3. Scannez la diapositive développée. Ouvrez la porte du scanner et placez la glissière à l'intérieur, rangée vers le bas. Commencez la numérisation (bouton vert "Lecture" sur le menu du panneau de navigation du logiciel, Figure supplémentaire 9B ).
  4. Enregistrez les diapositives numérisées comme un fichier tiff.
  5. Préparez la diapositive pour l'analyse. Sélectionnez "Charger liste de matrice" et téléchargez le fichier GAL approprié qui mappe les tableaux dans chaque bloc sur la diapositive ( Figure supplémentaire 9C ).
    REMARQUE: Le fichier GAL contient des informations concernant l'identité et l'emplacement (X, Y) de chaque point sur la diapositive. Ce fichier peut être crééPar le logiciel de l'imprimante exportant un fichier texte délimité par des tabulations en fonction de l'identité des échantillons dans la plaque source 384 et la conception d'impression définie.
  6. Définissez les paramètres d'alignement et d'analyse. Appuyez sur le bouton "Option" du menu du panneau de navigation du logiciel ( Figure complémentaire 10 ).
  7. Définissez les paramètres d'alignement. Trouvez des fonctions circulaires, redimensionnez les fonctionnalités pendant l'alignement de 50 à 350%, limitez le mouvement des fonctionnalités à une traduction maximale de 40 μm, des fonctionnalités non flasques qui échouent au seuil d'arrière-plan (seuil CPI 0), estiment l'emballage et la rotation lors de la recherche de blocs et automatisent l'enregistrement d'image (10 pixels) ( figure supplémentaire 10 ).
  8. Définissez les paramètres d'analyse: rapport W1 / 532, écart-type normal, analyse des caractéristiques absentes et soustraction d'arrière-plan. Cliquez sur "sélectionner", puis "Méthode de fond de la fonction locale" et définissez 2 pixels à exclure et une largeur de 3 pixels d'arrière-plan. Appuyer sur OK." SeT le niveau de saturation du scanner par défaut ( figure supplémentaire 10 ).
    REMARQUE: La méthode de soustraction de fond dépend de la conception expérimentale et peut être modifiée en fonction de besoins spécifiques.
  9. Alignez les cartes des fonctionnalités. Réglez le programme en mode bloc (appuyez sur "B"), sélectionnez tous les blocs (Ctrl + A), positionnez les grilles des cartes de tableau et alignez tous les blocs (Alt + Maj + F7) ( Figure supplémentaire 11 ).
  10. Affinez l'alignement des fonctionnalités dans chaque bloc. Zoom (appuyez sur "Z" pour accéder au mode zoom) dans le bloc supérieur gauche, appuyez à nouveau sur "B" (mode bloc) et appuyez sur la grille de ce bloc. Déplacez seulement la grille de ce bloc jusqu'à ce qu'il s'harmonise parfaitement avec les blocs et appuyez sur F5 pour aligner les caractéristiques de ce bloc sélectionné. Répétez le mouvement de la grille et l'alignement F5 jusqu'à ce que les spots soient parfaitement alignés. Faites de même pour chacun des 16 blocs jusqu'à ce que toutes les grilles soient en place.
  11. Analyser et enregistrer les données. Sélectionnez tous les blocs (Crtl +A), puis analyse les données (Alt + A). Enregistrez les résultats de l'analyse (Ctrl + U) en tant que fichier .gpr.
  12. Ouvrez le fichier .gpr enregistré dans une feuille de calcul et analysez l'intensité de chaque point en fonction de la fluorescence après la soustraction d'arrière-plan local (F532-B532).

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Résultats

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Impression, développement et analyse de tableaux:

L'impression d'un microarray de sialoglycane avec de multiples échantillons de glycan et des courbes d'IgG STD humaines dans 16 blocs différents nécessite un étalonnage complet pour s'assurer que tous les échantillons sont imprimés aussi uniformément que possible dans les 16 blocs par diapositive et à toutes les diapositives dans le même tirage. Par conséquent, des expériences d'é...

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Discussion

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Une fabrication réussie de microarray glycan nécessite une planification minutieuse et comprend plusieurs étapes importantes dans le protocole. Ceux-ci incluent: (1) la planification des dispositions de blocs et de plaques qui définissent tous les paramètres ultérieurs ( p. Ex. Distances, espacement, quantité d'échantillons et impression); (2) nettoyer les broches et assurer l'intégrité des broches, ce qui est essentiel pour contrôler l'homogénéité des points; (3) maintenir une forte humidité pendan...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu en partie par un Prix de recherche sur le développement de carrière du Fonds de recherche sur le cancer d'Israël, une subvention de l'Initiative nationale de nanotechnologie israélienne et le Helmsley Charitable Trust pour une zone de technologie focale sur Nanomedicines pour les théranosites personnalisées (VP-K) et National Instituts de la subvention de santé R01GM076360 (à XC).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sialoglycanes contenant des amines primairesGlycohub, Inc., Davis, CA, États-Unis (http://www.glycohub.com/services)Contactez info@glycohubusa.com pour les demandes de composésGlycanes imprimés
Phosphate monosodique monohydratéSigmaS9638Composant tampon d’impression
Phosphate disodique heptahydratéSigmaS9390Composant tampon d’impression
Phosphate solution saline tamponnéeHy-LabsBP-507/500DTampon d’impression / incubation / tampon de lavage
Tris-baseSigmaT1503Réactif de blocage
lames GlycérolSigmaG-7893Composant de tampon d’impression
ÉthanolamineThermo-Fisher Scientific0700/08Réactif de blocage de lames
Ovalbumine (Grade V)SigmaA5503Protéine bloquante de lames
Tween-20SigmaP7949Détergent à laver à lames
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarqueur sur matrice
ChromPure Human IgG, molécule entièreJackson Immunoresearch009-000-003Composant d’impression
biotinylé - SNAVector LaboratoriesB-1305Lectine végétale &ndash ; liaison Sia-alpha2&ndash ; 6-lié
Biotinylated-MALIIVector LaboratoriesB-1265Lectine végétale &ndash ; liaison Sia-alpha2&ndash ; 3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend146903Détection primaire
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848Liaison à la biotine
Cy3-anti IgG humaineJackson Immunoresearch109-165-088Détection secondaire contre les IgG humaines
Cy3-anti ChickenIgY Jackson Immunoresearch703-165-155Secondaire détection contre les IgY
de poulet Échantillons de sérum humainBanqueDétection primaire
Azote comprimé (grade 5)Outil général de dépoussiérage/séchage
Lames revêtues d’époxyCorning40044Lames
Lames revêtues d’époxyPolyAn2D 104-00-221Diapositives. Dans ce type de lames, la surface est plus hydrophobe (par rapport aux lames de carottage), donc le tampon d’impression des glycanes devrait être complété par 0,005 % de Tween-20 pour obtenir 100 µ ; Taches de taille M.
Plaque de microtitration à 384 puitsGenetix2070Plaque d’impression
Marqueur de laboratoire VWRVWR52877-310Étiquetage
de lames Staining TubeArrayItMSTOutil de développement
de lames Bain de colorationVWR25608-904Outil de développement de
Supports de verre de diapositivesVWR631-9321Outil
de développement de diapositivesGenePixScanner Molecular devices4000BScanner de lames
LM-60 NanoPrinterArrayItLM-60
Array Printer PinsArrayIt946MP3Broches d’impression
ProPlate Module GraceBio-LabsP37004Module de développement de lames
Eau distilléeBio-Lab2321020500Nécessaire pour arrayer et humidificateur
Multi Pippete électronique, 8 canaux, plage de volume 2-125 &mu ; LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384Multi pippete pour la répartition des échantillons dans une plaque à 384 puits
de de sang israélienne diapositives

Références

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