Créer et appliquer une référence afin de faciliter la Discussion et la Classification des protéines dans un groupe diversifié

Summary

Ce protocole vise à développer une référence pour les protéines divergentes dans un groupe qui n’a pas de critères cohérents pour la classification et la nomenclature. Cette référence facilitera l’analyse et la discussion du groupe dans son ensemble et peut être utilisée en plus de noms établis.

Abstract

Protéines apparentées qui ont été étudiés dans des laboratoires différents utilisant des différents organismes n’ont pas un système uniforme de la nomenclature et classification, rendant difficile de discuter de l’ensemble du groupe et de placer de nouvelles séquences dans le contexte approprié. Développer une référence qui donne la priorité aux fonctionnalités importantes séquences liées à structure et/ou de l’activité peut être utilisée en plus des noms établis pour ajouter quelque cohérence à un groupe diversifié de protéines. Cet article utilise la super-famille des (CS-αβ) hélice alpha cystéine stabilisé à titre d’exemple pour montrer comment une référence générée en tableur peut clarifier les relations entre les protéines existantes dans la superfamille, ainsi que faciliter l’ajout de nouveaux séquences. Il montre également comment la référence peut aider à affiner les alignements de séquences générées dans les logiciels couramment utilisés, dont l’incidence sur la validité des analyses phylogénétiques. L’utilisation d’une référence sera probablement plus utile pour les groupes de protéines qui incluent des séquences très divergentes d’un vaste éventail de taxons, avec des fonctionnalités qui ne sont pas suffisamment couverts par les analyses moléculaires.

Introduction

Nom de la protéine devrait refléter est caractéristiques et relation à d’autres protéines. Malheureusement, les noms sont généralement affectés au moment de la découverte et que les recherches se poursuivent, la compréhension de l’ensemble des contextes peut-être changer. Cela peut conduire à plusieurs noms si une protéine a été identifiée séparément par plus d’un laboratoire, à des changements dans la nomenclature ou dans les caractéristiques considérés comme définitif lorsque vous affectez le nom et le nom n’est plus suffisamment différenciant la protéine d’autres personnes.

Les défensines invertébrés offrent un bon exemple de la dégénérescence dans la nomenclature et la classification. Les premiers défensines d’invertébrés ont été signalés par les insectes, et le nom « defensin insecte » a été proposée basée sur l’homologie perçue à mammifères défensines^1,2. Le terme defensin est toujours utilisé, même s’il est maintenant clair que défensines invertébrés et mammifères ne partagent pas un ancêtre commun^3,4. Selon les espèces, un invertébré « defensin » peut avoir six ou huit des cystéines (qui forment trois ou quatre ponts disulfures) et une variété d’activités antimicrobiennes. Pour compliquer la situation, protéines ayant les mêmes caractéristiques que les défensines ne sont pas toujours appelés « défensines, » tels que le cremycins récemment identifié de Caenorhabditis remanei⁵. En outre, défensines gros invertébrés sont plus susceptibles de concerner évolutionnaire vertébrée β-défensines que d’autres invertébrés défensines⁶. Malgré cela, les chercheurs s’appuient parfois sur le nom « defensin » pour déterminer quelles séquences devraient être inclus dans les analyses.

Des études structurales ont révélé la similitude entre insectes défensines et scorpion toxines⁷, et le pli de CS-αβ a été établi par la suite comme la caractéristique structurelle de l’insecte défensines⁸. Cette bergerie définit la superfamille (CS-αβ) scorpion toxine dans la Classification structurale des protéines (SCOP) base de données⁹, qui comprend actuellement cinq familles : insectes défensines, toxines scorpion à chaîne courte, toxines de longue chaîne scorpion, MGD-1 (à partir de mollusque) et plante défensines. Cette superfamille est synonyme de la cis-défensines décrit récemment⁴ et super-famille 3.30.30.10 dans le CATH/Gene database 3D^10,11. Études de divers invertébrés, plantes et champignons que les noms des protéines qui contiennent cette bergerie ne sont pas clairement liées à afficher numéro de cystéine ou dessin de collage, activité antimicrobienne ou histoire évolutive¹².

Le manque de cohérence et de critères clairs rendent difficile de nommer et classer les séquences vient d’être identifié dans cette superfamille. Un obstacle majeur à comparer les protéines dans cette superfamille est que cystéines sont comptés à l’égard de chaque séquence individuel (la première cystéine dans chaque séquence est C1), sans aucun moyen pour expliquer le rôle structurel. Cela signifie que seules les séquences avec le même nombre de cystéines peuvent être comparés. Il y a peu conservation de séquence autre que les cystéines formant le pli de CS-αβ, ce qui complique les alignements et les analyses phylogénétiques. En développant un système de numérotation qui priorise les caractéristiques structurales, superfamille séquences peuvent être plus facilement par rapport et alignés. Caractéristiques conservées, ainsi que ceux définissant les sous-groupes, peuvent être visualisées rapidement, et de nouvelles séquences peuvent être placés plus facilement dans le contexte approprié.

Cet article utilise un tableur (par exemple, Excel) pour générer une référence à la numérotation de la super-famille des CS-αβ. Il montre comment cela clarifie les comparaisons entre les séquences et l’applique aux nouvelles séquences de CS-αβ identifiés des tardigrades. À l’aide de la super-famille des CS-αβ à titre d’exemple, le protocole a été écrit pour fournir des orientations pour l’utilisation de séquences d’intérêt ; Cependant, il n’est pas prévu pour être précis de cette superfamille ou de séquences riches en cystéine. Cette méthode sera probablement plus utile pour les groupes de protéines qui ont été étudiés séparément dans des taxons divergentes et/ou ont peu homologie de séquence globale, ayant des caractéristiques distinctes qui peut ne pas être facilement reconnu par le logiciel d’analyse moléculaire. Cette méthode requiert certaines décisions a priori au sujet des caractéristiques importantes, il sera d’une utilité limitée si aucune caractéristiques importantes n’ont été identifiées. L’objectif principal est de montrer comment une visualisation simple des relations séquence peut être atteints. Cela peut ensuite servir à informer l’alignement de séquences et d’analyse, mais si l’alignement et l’analyse sont les principaux objectifs, une méthode de code à barres serait une alternative appropriée qui a plus de capacité pour l’automatisation,¹³. La méthode actuelle affiche les caractéristiques de chaque peptide sous une forme linéaire, donc il ne sera pas utile pour la visualisation directe de la structure 3D.

Protocol

1. déterminer les caractéristiques de définition du groupe de protéines d’intérêt

1. consulter des publications antérieures pour déterminer s’il existe un consensus sur les fonctions qui sont nécessaires pour être considérés comme faisant partie du groupe. Prendre note des incohérences ou divergences d’opinion entre les groupes de recherche et comprennent des caractéristiques qui peuvent servir à différencier un sous-groupe de l’autre.
2. Si la littérature antérieure ne traite pas les caractéristiques qui définissent, utiliser des séquences qui sont considérés comme représentatifs du groupe comme point de départ pour identifier les caractéristiques conservées.

2. Collecter les séquences

1. si les commentaires ont été écrits, qui comprennent des analyses de séquences qui représentent le groupe, inclure ces séquences dans le jeu de données brute. Récupérer les séquences à l’aide de numéros référencés dans la littérature et enregistrer dans une séquence standard, programme d’édition (par exemple, EditSeq dans la suite Lasergene ou un des nombreux disponibles pour gratuit en ligne).
2. Si le groupe en question a été défini dans l’une des bases de données structurelles, comprennent les séquences de que la base de données répertorie comme faisant partie du groupe. récupérer les séquences à l’aide de numéros fournis dans la base de données et l’enregistrer dans un ordre standard d’édition programme, comme indiqué ci-dessus.
   NOTE : par exemple, les séquences regroupées autour de la super-famille des CS-αβ (toxine ressemblant scorpion) dans la base de données de la SCOP se trouvent ici : http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.
3. effectuer base locale Alignement Search Tool (BLAST) ¹⁴ recherches dans des bases de données publiques, en ligne, structurelles ou disponibles via le Centre National pour Biotechnology Information (NCBI) de trouver des séquences qui peuvent n’avoir pas été inclus dans la littérature bases de données. Pour la plupart résultats complets, utilisez les deux la protéine BLAST (blastp) et traduit souffle avec programmes de protéine de requête (tblastn) ; Ce sont tous deux disponibles à : https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   1. Des séquences d’utilisation connus pour faire partie du groupe d’intérêt sous forme de séquences de la requête. Copiez-collez la séquence dans la zone de recherche en haut ou fournir un identificateur de numéro ou gi d’adhésion GenBank, si elles sont disponibles.
   2. Choisir la base de données dans le menu déroulant. Choisissez les séquences de protéines non redondant (nr) pour blastp et étiquettes de séquence pour tblastn exprimées.
   3. Recherche de résultats dans des taxons particuliers dans l’organisme en entrant l’organisme ou le nom du taxon et en choisissant dans la liste qui s’affiche lors de la frappe. Pour ajouter des organismes complémentaires ou taxons d’exclure, cliquez sur le " + " touche un autre champ s’affiche. Exclure des taxons non désirées dans la zone de l’organisme en tapant le nom de l’organisme ou taxon, choisissant dans la liste qui s’affiche tout en tapant et en cochant le " Exclude " encadré sur la droite.
   4. Accéder aux paramètres supplémentaires en cliquant sur " les paramètres d’algorithme " près du bas de la page. Laisser par défaut sauf s’il existe une justification permettant de modifier un paramètre.
   5. Cliquez le " BLAST " bouton pour exécuter l’analyse, il peut prendre un certain temps pour que les résultats apparaissent. En général, récupérer des hits avec une valeur s’attendre (ou e-value) de " -05 " ou mieux et sauvegarder dans une séquence standard, programme d’édition.
      1. Si toutes les réponses sont au-dessus de ce seuil, exécutez de nouveau la recherche avec un nombre accru de séquences cibles (dans la section de paramètres d’algorithme) pour obtenir toutes les séquences pertinentes.
4. Si nécessaire, coupez les séquences pour exclure les informations non pertinentes (p. ex., le pli de CS-αβ s’applique uniquement au peptide mature). Identifier les peptides signaux et pro-peptides pour enlever en utilisant ProP ¹⁵ (disponible en ligne), ou SignalP pour sophistiquer signal peptide prédiction ¹⁶ (disponible en ligne).

3. Générer une référence à une feuille de calcul basé sur les importantes caractéristiques qu’ont été identifiées

1. identifier les caractéristiques du groupe d’intérêt. Par exemple, utilisez le pli de CS-αβ définitivement établi par la structure de solution d’insecte defensin A du Phormia terraenovae ( Figure 1) ⁸.
   1. Cette bergerie comprend un motif plus petit appelé l' hélice stabilisée cystéine (CSH) ¹⁷ ; identifier ce motif par un CXXXC (où X est n’importe quel acide aminé) en amont d’un CXC qui forment deux ponts disulfures ( Figure 1 , solid pink lines).
      NOTE : Pour compléter le motif CS-αβ, un troisième pont disulfure est formé à partir des cystéines supplémentaires placés devant chaque moitié du motif CSH ( Figure 1, pointillé des lignes roses).
2. Entrer dans ces définissant les caractéristiques sur une feuille de calcul. Voir la Figure 2.
   1. Colonnes d’utilisation pour les éléments conservés et pour représenter les espaces entre ces caractéristiques. Garder les colonnes assez larges pour adapter les numéros et s’assurer qu’ils ont une largeur uniforme. Réglez la largeur avec la " Format | Largeur de colonne " fonction ( Figure 2, Flèche Rose).
   2. Utiliser les lignes pour le nom de la séquence.
   3. Lorsqu’une séquence a la particularité, renseignez la zone à l’aide de la fonction de remplissage ( Figure 2, carré rose). Pour l’espacement entre les fonctions, entrez le nombre d’acides aminés dans la zone entre et le laisser vide. Par exemple, à l’aide de l’insecte defensin séquence donne une référence qui comprend six cystéines, avec espacement défini entre C2 et C3 et entre C5 et C6.
3. Ajouter des séquences représentant qui ont été précédemment établis en tant que membres du groupe basé sur les bases de données structurelles et de la littérature.
   NOTE : par exemple, la littérature antérieure et la base de données de la SCOP identifient plusieurs groupes pour l’inclusion : insectes défensines, toxines scorpion à chaîne courte, toxines de longue chaîne scorpion, MGD-1 plante défensines, nématode ABFs, drosomycins de drosophile, et macins. La littérature recense aussi une séquence bactérienne avec seulement quatre cystéines qui pourraient représenter l’ancêtre de cette superfamille ¹⁸. L’ajout de ces séquences augmente le nombre des cystéines dans le renvoi de six à dix, mais maintient l’alignement des éléments structurels importants ( Figure 3).
   1. Pour ajouter une fonctionnalité qui est susceptible de définir un sous-groupe de séquences (par exemple, une cystéine supplémentaire), utilisez le " Insert " fonction ( Figure 3, la flèche rose).
   2. S’il existe des fonctionnalités manquantes à partir d’une séquence donnée, laissez la case vide et combinez-le avec boîtes représentant les acides aminés intervenants. Si nécessaire, fusionner les cellules à l’aide de la fonction fusionner et centrer ( Figure 3, boîte rose).
4. Continuer ajoutant des séquences aux groupes pour obtenir une meilleure image de la variation dans chaque groupe de la superfamille des plus grande. Résumer les caractéristiques de groupe pour faciliter les comparaisons ( Figure 4).
   1. Lorsque le nombre d’acides aminés entre les principales caractéristiques varie, utilisez un trait d’Union pour indiquer une plage, par exemple les 6-12 (acides aminés de 6 à 12) et une barre oblique pour indiquer / ou, par exemple 7/10 (7 ou 10 acides aminés).
   2. Choisir une voie pour annoter les caractéristiques des séquences qui peuvent être utiles mais ne sont pas assez souvent à inclure dans la référence. Par exemple, puisque cystéines sont importants dans cette superfamille, étiquette supplémentaires cystéines ( Figure 4, boîtes de roses).
5. Ajouter newlséquences de y-identifiés dans la feuille de calcul utilisant les séquences établis comme guide. Par exemple, ajouter des séquences de tardigrades (jaune) montre que les séquences tardigrade appartiennent à différents groupes de la superfamille ( la Figure 5 présente des résumés au lieu d’une ligne pour chaque séquence aux fins de l’espace).
6. Présentent une variabilité au sein d’un groupe taxonomique en réorganisant les lignes ( Figure 6).

4. Utiliser la référence à affiner les alignements d’acides aminés

Remarque : il existe de nombreux programmes qui peuvent être utilisés pour les alignements multiples de séquences, mais cette démonstration utilise l’analyse moléculaire de la génétique évolutive (MEGA6) ¹⁹ car il est disponible pour téléchargement gratuit.

1. Télécharger et installer le logiciel.
2. Commencer un nouveau tracé en MEGA en sélectionnant " Edit/Build alignement " sous l’onglet alignement Select " créer un nouveau tracé de la " dans la boîte qui apparaît, puis cliquez sur " OK. " puis sélectionnez " Protein. "
3. Select " Insérez la séquence du fichier " dans le " Edit " menu permettant d’importer les séquences de.
   NOTE : Séquences devront être au format FASTA pour importation dans MEGA. Les couleurs d’arrière-plan qui représentent les types de différents acides aminés sont utilisés par défaut, mais cette option peut être désactivée en vertu de la " écran " menu.
4. Une fois que toutes les séquences sont entrés, cliquez sur l’icône de bras fléchis, puis " protéine aligner " pour aligner les séquences à l’aide de l' algorithme MUSCLE ²⁰.
   Remarque : ClustalW est également disponible.
   1. Si un message disant que rien n’a été sélectionné pop et souhaite sélectionner tout, cliquez sur " OK. "
   2. Remarque : cela ouvre une fenêtre qui permet de modifier certains paramètres, mais ils devraient seulement être changés il y a raison de le faire. Cette analyse utilise un sous-ensemble des séquences analysées dans un précédent fascicule ¹².
5. Contrôle l’alignement fondé sur les caractéristiques importantes ; Notez que la barre supérieure au-dessus des séquences affiche toutes les colonnes où l’acide aminé est complètement conservée (*). Voir Figure 7. Voir que l’alignement initial ne montre que trois des quatre cystéines conservées ( Figure 7, boîtes de roses) ; regardant vers le bas de la colonne, la séquence AlCRP est clairement mal alignées ( Figure 7, Flèche Rose).
6. De se débarrasser de l’écart important entre le j’et le C conservé, sélectionnez les tirets et appuyez sur la " supprimer " clé. Pas en évidence des acides aminés, ou ils seront ainsi supprimés.
7. Pour déplacer des acides aminés vers la droite, mettez en surbrillance et appuyez sur la barre d’espace.
   1. Remarque que le AlCRP a maintenant les cystéines structurels alignés et que le dernier C du motif CXXXC est conservée tout au long de l’alignement ( Figure 8). Ajuster l’alignement nécessaire de hiérarchiser les éléments les plus importants des séquences.

5. Comparer les groupes identifiés à l’aide de la référence aux résultats d’Analyses phylogénétiques

1. d’alignements préliminaires, déterminer quelles séquences doivent être inclus dans une analyse phylogénétique ; pour un petit nombre de séquences, cette étape peut n’est pas nécessaire.
   1. Garder un fichier alignement comprenant toutes les séquences, mais pour une analyse phylogénétique, supprimer les séquences redondantes ( Figure 9, rose boîtes Voir la paires de séquences redondantes).
   2. Si le jeu de données comprend un grand nombre de séquences, exécuter une analyse préliminaire et certains représentants de groupes qui a toujours forment un clade.
2. Déterminer le meilleur modèle de substitution des acides aminés.
   1. Exporter l’alignement au format MEGA (sous l’onglet données).
   2. Allez dans le menu modèles, puis sélectionnez " trouver meilleur ADN/protéine modèle. " choisir le fichier juste sauvé et ouvrez-le ; Ceci ouvrira une fenêtre qui a certains paramètres qui peuvent être changées.
   3. Utiliser les paramètres par défaut sauf si il y a une raison de les changer. Cliquez sur " calculer " pour commencer l’analyse.
3. Exécuter une analyse de probabilité maximale (ML) en MEGA.
   1. Choisir " arbre de probabilité maximale construction/Test " dans le menu de phylogénie.
   2. Choisir le modèle déterminé à être le meilleur ajustement pour les données de l’étape 5.2 (la sortie donnera le modèle de substitution ainsi que le meilleur " taux des sites " paramètre).
   3. Choisir 1 000 bootstrap réplique pour obtenir les mesures de soutien pour l’arbre.
   4. Click " calculer " pour exécuter l’analyse ; MEGA a un " Tree Explorer " de visualiser l’arborescence.
4. Exécuter une analyse bayésienne dans MrBayes logiciels libres ²¹.
   Remarque : Un manuel de MrBayes est également disponible sur ce site. Ceci est destiné à fournir des étapes de base et n’est pas un guide complet pour l’analyse phylogénétique bayésienne.
   1. Exporter l’alignement méga format PAUP (Nexus) dans le même dossier que le programme MrBayes.
   2. Open MrBayes et type " exe nom de fichier " (par exemple, " exe Alignment.nex ").
   3. Spécifier les paramètres de modèle et de l’analyse. Choisir soit le modèle spécifié à l’étape 5.2 ou choisir les " mixtes " qui sera essayer différents modèles et de faire rapport à la fréquence du modèle dans les arbres avec les meilleures probabilités postérieures (prset aamodelpr = mixte). Type " showmodel " de déclarer les paramètres actuels du modèle et " aider mcmc " pour afficher les paramètres actuels, avec une brève explication de chaque.
   4. Définir le nombre de générations à l’aide de la " mcmcp ngen = " commande (1 million est typique).
   5. Type " mcmc " pour commencer l’analyse.
   6. Lorsque le nombre de générations est terminée, le programme vous demandera d’ajouter plusieurs générations. Si l’écart moyen des fréquences de split est inférieure à 0,1, tapez no. Si c’est au-dessus de 0,1, l’analyse devrait être autorisée à continuer ou certains paramètres doivent être changés (voir le manuel).
   7. Utiliser la " sumt " commande pour générer l’arborescence des fichiers.
   8. Lorsque l’analyse est terminée et un arbre de consensus est généré, l’arbre peut être visualisé dans FigTree (disponible en ligne).
5. Comparer les arbres pour voir si les méthodes génèrent des résultats cohérents.
   Remarque : Certaines séquences ne fournissent pas beaucoup d’informations : les arbres ne soit pas bien résolues et les branches peuvent avoir un minimum de soutien ( Figure 10).
6. Comparer les arbres pour les groupes identifiés à l’aide de la référence pour voir si les analyses phylogénétiques des ces groupes de soutien.

Results

Groupes de séquences de la super-famille des CS-αβ rapportées dans la littérature sont affichés dans la Figure 4. Les appariements de cystéine basées sur la numérotation pour chaque séquence suggèrent cinq groupes principaux (tableau 1, colonne du milieu). Le groupe 1 a 6 cystéines qui de disulfure de trois obligations et comprend des séquences d’insectes, les arachnides, les mollusques, les nématodes et les champignons. Les groupes 2, 3 et 4...

Discussion

Les critères pour nommer une protéine au sein d’un groupe doivent être clairs, mais ce n’est pas toujours le cas. Les séquences qui ont le CS-αβ plier ont été étudiés dans plusieurs laboratoires en utilisant une variété d’organismes, ayant pour résultat différents systèmes de nomenclature, ainsi que différents niveaux de qualification. Tentative d’imposer une toute nouvelle nomenclature n’est pas raisonnable et se traduirait par une grande confusion lors de la consultation de la littérature antérieure. Une référence syst...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Page web			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
EditSeq (suite Lasergene)	DNASTAR		https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx
Excel 2013	Microsoft
FigTree			; http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/
MEGA			www.megasoftware.net
MrBayes			http://mrbayes.sourceforge.net/
base de données			http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/