Production de génétiquement Hamsters syriens dorés par Injection pronucléaire du complexe CRISPR/Cas9

Rong Li; Jinxin Miao; Zhiqiang Fan; SeokHwan Song; Il-keun Kong; Yaohe Wang; Zhongde Wang

doi:10.3791/56263

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Article de méthode

Production de génétiquement Hamsters syriens dorés par Injection pronucléaire du complexe CRISPR/Cas9

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DOI :

10.3791/56263

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9 janvier 2018

Rong Li^*¹ , Jinxin Miao^*¹^,² , Zhiqiang Fan¹ , SeokHwan Song³ , Il-keun Kong³^,⁴ , Yaohe Wang²^,⁵ , Zhongde Wang¹

¹Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University, ²National Centre for International Research in Cell and Gene Therapy, Sino-British Research Centre, School of Basic Medical Sciences, Zhengzhou University, ³Department of Animal Science Division of Applied Life Science (BK21 Plus), Gyeongsang National University, ⁴Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, ⁵Centre for Molecular Oncology, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Pronucléaire injection (PN) du cluster régulièrement entrecoupées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) et le système CRISPR-associated protein-9 nucléase (CRISPR/Cas9) est une méthode très efficace pour produire génétiquement hamsters syriens dorés. Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé d’injection de PN pour la production des hamsters de knock-out du gène avec le système CRISPR/Cas9.

Résumé

La technique d’injection pronucléaire (PN) fut instituée chez les souris pour introduire le matériel génétique étranger dans les pronucléus des embryons au stade unicellulaire. Le matériel génétique introduit peut s’intégrer dans le génome embryonnaire et générer des animaux transgéniques avec des informations génétiques étrangers après le transfert des embryons injectées afin d’encourager les mères. Suite au succès à souris, injection PN a été appliquée avec succès dans beaucoup d’autres espèces animales. Récemment, injection PN a été avec succès employée pour introduire les réactifs avec les gènes modificateurs des activités, comme le système CRISPR/Cas9, de réaliser des modifications génétiques in sites dans plusieurs laboratoires et espèces animales de la ferme. En plus de maîtriser le spécial de microinjection compétences pour produire des animaux génétiquement modifiés par injection de PN, les chercheurs doivent comprendre la physiologie de la reproduction et le comportement de l’espèce cible, parce que chaque espèce présente unique défis. Par exemple, les embryons de hamster doré de Syrie ont unique manipulation conditions in vitro , tels que les techniques d’injection PN n’étaient pas possibles dans cette espèce jusqu'à récentes avancées par notre groupe. Avec notre protocole d’injection de PN espèces modifiées, nous avons réussi à produire plusieurs knock-out du gène (KO) et knockin hamsters (KI), qui ont été utilisés avec succès aux maladies humaines de modèle. Nous décrivons ici la procédure d’injection PN pour livrer le complexe CRISPR/Cas9 pour les zygotes du hamster, les conditions de manipulation des embryons, les procédures de transfert d’embryon, et élevage pour produire des organismes génétiquement modifiés hamsters.

Introduction

Le golden hamster syrien (Mesocricetus auratus) est l’un des rongeurs plus largement utilisés pour la recherche biomédicale. Selon le département américain de l’Agriculture, environ 100 000 hamsters ont été utilisés aux États-Unis en 2015, ce qui représente 13 % du total laboratoire animal son utilisation parmi les espèces couvertes par l’Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; consulté le 10 mars 2017).

Le hamster offre plusieurs avantages par rapport aux autres rongeurs dans l’étude d’un certain nombre de maladies humaines. Par exemple, les adénocarcinomes canalaire pancréatique histopathologie du N-nitrosobis(2-oxopropyl)....