Article de méthode

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

DOI :

10.3791/56277

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24 septembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

Dans cet article

Résumé

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L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato - encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Résumé

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Le but du présent protocole présente une procédure optimisée pour la purification et la culture du pBECs et à établir des modèles in vitro barrière hémato - encéphalique (BHE) basés sur pBECs en mono-culture (MC), MC avec milieu conditionné par l’astrocyte (ACM), et co-culture (NCC) avec les astrocytes de porc sans contact ou des rat origine. pBECs ont été isolées et cultivées à partir de fragments des capillaires du cortex du cerveau des porcs domestiques âgés de 5 à 6 mois. Ces fragments ont été purifiées par extraction soigneuse des méninges, l’isolement et l’homogénéisation de la matière grise, filtration, digestion enzymatique et centrifugation. Pour éliminer les autres cellules contaminantes, les fragments capillaires ont été cultivées avec contenant la puromycine moyen. Lorsque confluente de 60 à 95 %, pBECs de plus en plus des fragments capillaires ont été repiquées à filtre à membrane perméable insère et mis en place dans les modèles. Pour augmenter l’étanchéité de la barrière et le BBB phénotype caractéristique de pBECs, les cellules ont été traitées avec les facteurs de différenciation suivant : membrane perméable 8-CPT-cAMP (cAMP abrégé ici), hydrocortisone et un inhibiteur de la phosphodiestérase, RO-20-1724 (RO). La procédure a été réalisée sur une période de 9 à 11 jours, et en établissant le modèle du NCC, les astrocytes ont été cultivés 2 à 8 semaines à l’avance. Respect des procédures décrites dans le protocole a permis la mise en place de couches endothéliales avec perméabilité paracellulaire très restreint, avec la CCN modèle montrant une résistance électrique moyenne transendothéliale (TEER) de 1249 ± 80 cm Ω 2et la perméabilité paracellulaire (Papp) pour le jaune Lucifer de 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (moyenne ± SEM, n = 55). Une évaluation plus poussée de ce phénotype pBEC a montré la bonne expression de la protéines jonctionnelles serré claudin 5, ZO-1, occludin et adherens jonction protéine p120 caténine. Le modèle présenté peut être utilisé pour une série d’études de la BHE dans la santé et la maladie et la perméabilité paracellulaire très restrictives, ce modèle convient aux études de transport et trafic intracellulaire.

Introduction

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Structure cellulaire et le fonctionnement de la barrière hémato - encéphalique

À l’interface de l’appareil circulatoire et système nerveux central (SNC), la BHE agit comme un site réglementaire clé pour contrôle homéostatique du microenvironnement CNS, qui est indispensable à leur fonctionnement et de la protection du système nerveux. Le site de la BHE est les cellules endothéliales tapissant la lumière du vaisseau sanguin. Dans les capillaires du cerveau, les cellules endothéliales forment complexes jonctions intercellulaires et profils d’expression fortement polarisée de particuliers transporteurs influx et l’efflux de veiller très spécifique transport moléculaire entre le sang et le cerveau 1. Les composants structurels des complexes de jonction serrée incluent des protéines de la famille occludin et claudin, les protéines zonula occludens (ZO), les cingulin et associés des molécules d’adhésion jonctionnelles (confitures). Claudin 5 est particulièrement important dans la limitation jonctionnelle paracellulaire. L’induction et l’entretien de ce phénotype caractéristique d’endothéliales BBB impliquent des interactions dynamiques avec les cellules environnantes, y compris les péricytes et astrocytes, neurones, les membranes basales, qui, avec le cerveau endothéliale, forme des cellules le neurovasculaire unité (NVU)2,3. Les mécanismes impliqués dans ces interactions ne sont pas encore entièrement compris, mais incluent l’échange de signaux chimiques entre les cellules, ce qui permet la modulation de la perméabilité BBB à court terme et induit à long terme BBB fonctions4. Astrocytes en particulier sont connus pour contribuer au phénotype de cellules endothéliales du cerveau et sont une source de facteurs de régulation tels que gliales neurotrophiques facteur (affectant l’AMPc intracellulaire)5, facteur de croissance de fibroblaste base6, hydrocortisone,7et transformant le facteur de croissance β (TGF-β)8. L’effet du TGF-β, cependant, a été débattue9.

In Vivo pour In Vitro BBB

Des études in vivo continuent à fournir des informations précieuses sur la biologie BBB. Cependant, les modèles de culture de cellules peuvent apporter un éclairage supplémentaire et constituent des outils utiles à la compréhension détaillée des aspects moléculaires et fonctionnelles de la BHE dans santé et maladie. Bien que les interactions complexes entre les types de cellules et les constituants de la BHE sont difficiles à atteindre dans des modèles in vitro , il y a eu, depuis la première purification de cellules endothéliales du cerveau et l’application de celles-ci dans les mono-cultures 10 , 11 , 12, développé des procédures de purification et des conditions de croissance de la BHE cell cultures modèles, ce qui entraîne une plus grande ressemblance avec la barrière en vivo . Les modèles BBB couramment utilisés in vitro sont basés sur les cellules primaires d’origine bovine, porcine et rongeur ainsi que sur les lignées cellulaires immortalisées. Chaque modèle a des inconvénients et des avantages différents. Pour le choix de modèle et de la comparaison, marqueurs de validation comme l’expression des enzymes, transporteurs, récepteurs et protéines structurales BBB sont utilisés pour donner un aperçu de l’actuelle de modèles établis1.

Objectif du protocole

Une caractéristique importante de la BHE est étanchéité barrière et haute TEER, pourtant un grand nombre de modèles disponibles ne reflète pas bien les niveaux en vivo . Intégrant le développement et l’optimisation des contributions de plusieurs laboratoires, le but du présent protocole est de présenter une méthode pour établir un haut TEER in vitro BBB modèle basé sur pBECs primaire en MC avec ou sans l’ACM, ou dans le NCC avec primaire astrocytes de rat ou d’origine porcine. L’appliqué les procédures et la mise en place du modèle comprennent les efforts pour éliminer les cellules contaminantes et améliorer la différenciation des pBECs en un phénotype BBB. Ce travail a abouti à la création de modèles TEER fiables et de haute perméabilité paracellulaire faible et bonne expression fonctionnelle de récepteurs, transporteurs et principales protéines jonctionnelles serrés. Cependant, comme les astrocytes sont un facteur qui contribue au phénotype de cellules endothéliales du cerveau, les trois différentes conditions de culture représentent trois différents phénotypes de cellules endothéliales du cerveau. Le modèle de la NCC est particulièrement utile pour l’étude de certains mécanismes spécialisés participent à la découverte de médicaments, des études de transport et trafic intracellulaire, ainsi que pour l’étude des interactions cellule-cellule où est l’expression maximale des caractéristiques BBB avantageuse.

Origine et histoire du protocole

Le modèle pBEC décrit ici est largement basé sur le modèle porcin développé dans les laboratoires Eisai (Londres) par Dr Louise Morgan et collègues, whichis basée sur un succès antérieure du cerveau de boeuf cellules endothéliales modèle13. La méthode originale de préparation de cellules a été une filtration de deux étages à l’aide de nylon des maillages pour intercepter les microvaisseaux, suivis d’une subculture afin d’améliorer la pureté. Dans l’élaboration antérieure de la méthode, étanchéité optimale de BBB phénotype et barrière ont été atteints par la croissance dans un milieu supplémenté, y compris les ACM. Autres modifications à la méthode ont été faites par R. Skinner dans laboratoire du Prof N. Rothwell de Manchester UK14,15. La méthode a été adoptée par le laboratoire Abbott, KCL London, où Patabendige rend considérablement plus simple à préparer en évitant l’utilisation des astrocytes ou ACM et en éliminant les cellules contaminantes telles que les péricytes avec puromycine. Les premiers documents ont confirmé que le modèle MC conservé plusieurs caractéristiques importantes du in vivo BBB, y compris des jonctions serrées efficaces, les systèmes de transport membranaire et transcytose médiée par les récepteurs16,17 , 18 , 19 , 20. plus tard S. Yusof encore testé culture mixte d’astrocytes et trouvé il a nettement amélioré TEER, donc il s’agit de la variante préférée actuellement utilisée dans le laboratoire de Abbott21. Le modèle a été correctement transféré à la M. Nielsen lab à Aarhus, où des modifications ont été introduites (ce protocole), y compris les gris simplificatrice d’importance extraction, à l’aide de maillage qu’une étape de filtration et une étape de revêtement de filtre unique combinaison de collagène et la fibronectine. La procédure appliquée pour l’isolement des astrocytes porcins (ce protocole) reposait sur des protocoles mis au point par le laboratoire de T. Moos à Aalborg, décrite par Thomsen et al.22. La TEER et autres propriétés du modèle généré à Londres et Aarhus sont semblables, ce qui donne confiance à l’idée que le modèle est facilement transféré entre les laboratoires et réagit bien à une observation attentive et de la rationalisation des étapes de la méthode. En effet, S. Yusof a maintenant établi le modèle de MC dans un pays tropical (Malaisie)23, qui impliquait un ajustement supplémentaire pour des conditions locales et les sources de tissus.

Avantages par rapport aux méthodes alternatives et actuellement mis en place des modèles

Par rapport aux cellules endothéliales du cerveau d’origine bovine et rongeur, pBECs offrent l’avantage d’avoir un taux plus faible de la perte de la phénotype BBB in vivo après isolement24. En outre, les pBECs sont capables de former des barrières endothéliales relativement serrés, même lorsque cultivées en MC (Ω 800 cm2)16 par rapport aux niveaux communément déclarés pour les monocouches de lignées cellulaires tels que bEND.5 et bEND.3 (Ω 50 cm2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30et cerebEND (Ω 500 cm2)29,31,32et cerveau primitif cellules endothéliales de souris (100-300 Ω cm2)SS = « xref » > 33,34,35,36 et rat (100-300 Ω cm2)37,38. Cependant, la TEER a montré dépendance sur les procédures de purification et de la culture. Dans la plupart des cas, l’ajout de ACM ou de co-culture avec des astrocytes montre des effets divergents sur les cellules endothéliales et une augmentation dans l’étanchéité des couches endothéliales1. Néanmoins, avec les efforts visant à optimiser les conditions de culture, seulement les modèles axés sur les bovins ont montré des valeurs TEER comparables aux modèles axés sur les porcins (moyennes de 800 Ω cm2 dans MC, jusqu'à 2500 Ω cm2 en culture mixte d’astrocytes)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Comme les modèles basés sur le cerveau de boeuf primaire les cellules endothéliales ont montré des variations importantes, entre et au sein de laboratoires14,45,46,47,48, reproductibilité pourrait être un problème. Dans le modèle pBEC rapporté ici, les laboratoires qui contribuent ont atteint TEER très similaire et les valeurs de perméabilité paracellulaire avec une faible variabilité, dans et entre les laboratoires. Par conséquent, il devrait être possible pour les autres laboratoires d’établir un modèle robuste avec une faible variabilité à l’aide de la méthode présentée ici. En formant des couches endothéliales serrés, plus de modèles avec pBECs ont déjà été validés par l’expression des protéines des jonctions serrées, fonctionnelle BBB transporteurs, récepteurs et enzymes et les qualités démontrées pour une série d’études de15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. par ailleurs, transcriptome inédit des données sur les cultures co de pBECs montrent un profil attendu des transporteurs BBB et récepteurs (résultats non publiés, Nielsen et al.).

Le modèle porcin de BBB a un autre avantage que le génome, l’anatomie, la physiologie, et la progression de la maladie du porc reflètent la biologie humaine à un degré plus élevé que les autres modèles établis dispose de60, qui sont favorables pour le industrie pharmaceutique. Cervelle de porc est un sous-produit courant de la filière viande, elles constituent une source facilement accessible du cerveau des cellules endothéliales, réduisant au minimum le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences et offrant un rendement élevé de purification d’un cerveau de porc. Bien que la purification et la culture de cellules primaires est un peu fastidieux et nécessite l’expertise de normalisation dans la mise en place du modèle, les cellules primaires génèrent les modèles plus fiables de la BBB. Lignées cellulaires immortalisées ne peuvent se substituer, en tant que propriétés importantes telles que l’étanchéité de la barrière, des profils d’expression transporteur et microenvironnement ne reflètent pas les résultats expérimentaux obtenus in vivo61, 62. in vitro modèles offrent l’avantage de vivre-cellule d’imagerie avec une résolution supérieure, permettant la visualisation de processus intracellulaires en permettant une approche de proximité aux cellules prélevés ou observées, à l’aide d’objectifs avec un grossissement supérieur et de la meilleure qualité optique63. Ce n’est pas le cas pour l’utilisation de la microscopie biphotonique chez les individus vivants. En outre, les modèles in vitro permettent de transfecter cellules, permettant la visualisation de protéines étiquetées et enquête de leur trafic.

Applications du modèle

La fonction de cette barrière n’est pas fixe et peut être modulée dynamiquement en physiologie et en pathologie. Dans de nombreuses maladies neurologiques, y compris neurodégénératives, maladies inflammatoires et infectieuses, perturbation et augmentation de la perméabilité de la BHE est observé64,65,66,67 . Afin de réduire et de prévenir la progression de la maladie et les dommages ultérieurs, identification et caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la modulation de la BHE sont d’une importance majeure. Dans ce contexte, fiable in vitro modèles sont très demandés par l’industrie pharmaceutique et en outre un rôle important dans la prédiction de perméabilité BBB de médicaments pour le système nerveux central. N’importe quel modèle in vitro agissant comme un écran de perméabilité doit afficher une voie paracellulaire restrictive, une architecture cellulaire physiologiquement réaliste et une expression fonctionnelle de transporteur mécanismes68. Démontré dans les précédentes études16,17,57et par la perméabilité paracellulaire et expression de protéines TJ et AJ ici, le modèle présenté répond à tous ces critères et convient à une gamme de BBB études dans les deux physiologie normale et en pathologie. Les points forts de la méthode de purification et de culture présentée comprennent une combinaison de simplicité et de la reproductibilité et la possibilité d’inclure astrocytaires influencent avec un robuste et fiable haute TEER in vitro BBB modèle résultant. Pour ce but, les astrocytes de porc et rat origine auraient dû être divulgués pour augmenter le phénotype BBB de pBECs dans une semblable manière22.

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Protocole

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cervelle de porc ont été obtenues comme sous-produits de l’industrie des produits alimentaires danois. Les abattoirs danois sont sous stricte surveillance et d’observation par le Ministère danois de l’environnement et de la nourriture.

rats utilisés pour l’isolement des astrocytes ont été élevés et logés en groupe dans l’animalerie locale à une température ambiante de 22 ° C à 23 ° C et sur un cycle de clair/sombre du 12/12 h sous contrôle du vétérinaire et selon danois Règlement pour les animaux de laboratoire. Les rats ont été euthanasiés avant ils étaient sacrifiés conformément aux lignes directrices internationales sur l’utilisation éthique des animaux (Communautés européennes la Directive du 24 novembre 1986 ; 86/609/CEE) et directives danois. Pas d’expériences in vivo sur des animaux ou matériel humain ont été utilisées dans ces expériences.

Remarque : Voici un protocole principal pBEC décrivant la purification (étape 1), culture (étape 2) et des mesures (étape 3) TEER. Pour l’installation d’une NCC avec les astrocytes, est présenté un remplaçant protcol (étape 4) décrivant la purification et la culture du rat et des astrocytes porcins.

1. purification des capillaires de cerveau Porcine

  1. recueillir 8-10 cerveaux de 5-6-month-old porcs domestiques (par exemple provenant d’un abattoir à proximité) et de les transporter sur la glace au laboratoire. Nous vous recommandons de commencer la procédure de purification suivant dans 2-3 h de la fin de l’animal.
  2. Placer le cerveau dans un banc de flux stérile et les laver doucement avec du PBS 1 L dans un becher placé sur la glace.
  3. Soigneusement enlever des méninges d’un cerveau à l’aide de pinces de fine pointe et transférer le cerveau méninges libres dans un autre bécher de 1 L avec du PBS mis dans la glace. Prorogation du délai pris peut compliquer le retrait. Le temps approximatif utilisé pour chaque cerveau devrait être 10-15 min.
  4. à l’aide d’un scalpel, grattez la matière grise du un cerveau à la fois et transférer le matériel isolé pour boîtes de Pétri (8,8 cm 2) contenant 20 mL DMEM nutriment mélange F-12 (DMEM/F-12) placé sur la glace. Isoler comme matière beaucoup grise que possible sans se retirer le matériel de la substance blanche. Pour la fragmentation initiale, traversent la matière matière grise sans aiguille, une seringue de 50 mL. Continuer pendant tout le cerveau et mettre en commun le matériel recueilli matière grise. Prorogation du délai pris peut compliquer le retrait. Le temps approximatif utilisé pour chaque cerveau devrait être 10-15 min.
  5. Transférer le matériel isolé de matière grise dans le tube de moulin d’un homogénéisateur à main tissu dans une proportion de 50/50 avec support DMEM/F-12. Homogénéiser la matière en faisant 8 monter et descendre des traits avec un pilon lâche, suivi par 8 et descendre de coups avec un pilon serré. Continuer jusqu'à ce que tous isolé matériel a été homogénéisé, puis transférer l’homogénat dans une bouteille de 500 mL et diluer avec DMEM/F-12 à environ le volume total de 450 mL.
  6. Filtrer l’homogénat à l’aide d’une bouteille 500 mL de bleu-cap avec porte-filtre et filtre-maille de 140 µm et isoler les capillaires en exécutant le tissu à travers le filtre. Utiliser un filtre par 50 mL d’homogénat et laver chaque filtre DMEM/F-12 par la suite.
  7. Place le tube capillaire contenant des filtres en boîtes de Pétri avec une solution de digestion de trypsine/EDTA (2,5 % trypsine, 0,1 nM EDTA dans du PBS), collagénase CLS2 (2 000 U/mL) et DNase 1 (3 400 U/mL) en DMEM/F-12. Utiliser 1 boîte de Pétri (8,8 cm 2, 20 mL de solution) par 3 filtre mailles.
  8. Placer les boîtes de Pétri à 37 ° C pendant 1 h dans un agitateur orbital à 180 tr/min ou ajoutez-les délicatement toutes les 10 min. Après 1 h, laver les capillaires des filtres avec suspension de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette de 1 mL.
  9. Divisé 2 tubes de 50 mL de la suspension de la 3 vaisselle et arrêter la digestion en ajoutant 10 mL DMEM/F-12 dans chaque tube de 50 mL.
  10. Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g, 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque boulette dans 10 mL de DMEM/F-12. Ajouter un autre 20 mL de DMEM/F12 dans chaque tube. Répétez cette étape de centrifugation deux fois.
  11. Laisser les tubes refroidissent sur glace pendant 5 min et les solutions de transfert à 2 nouveaux tubes de 50 mL.
  12. Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 g, 4 ° C pendant 5 minutes et resuspendre chaque culot dans 8-10 mL (environ 1 mL/cerveau utilisé) de congélation solution consistant en 10 % DMSO à BF.
  13. Transférer la suspension cellulaire à cryovials, à l’aide de 1 mL par cryovial. En moyenne, une purification provoque 1 flacon par cerveau utilisé, fournissant en moyenne les cellules endothéliales pour 12-16 amovibles. Placer les flacons dans une boîte de congélation à-80 ° C pendant au moins 4 h jusqu'à la nuit. Par la suite, stocker le cryovials dans un cryotank à l’azote liquide.
    ATTENTION : L’azote liquide a des températures extrêmement basses. Veuillez porter une protection appropriée.

2. Culture de pBECs primaire (8-10 jours)

  1. Culture initiale (3-5 jours)
    1 jour
    1. afin d’optimiser les conditions de fixation des pBECs, réaliser enduit d’une fiole de T75 en ajoutant une solution au final concentrations de collagène IV (150 µg/mL) et la fibronectine (50 µg/mL) à la FD 2 O le flacon, en s’assurant que la solution couvre toute la surface. Utiliser 10 mL pour chaque fiole T75. Incuber à 37 ° C pendant 2 h.
      Remarque : Le revêtement peut être effectué juste avant l’utilisation, ou jusqu'à une semaine avant et stocké avec du PBS à 4 ° C. Le revêtement ne doit pas sécher, ou il forme n’est plus une surface de fixation et la croissance appropriée.
    2. Préparer 16 mL de pBEC croissance moyenne composée de DMEM/F-12 additionné de 10 % de sérum de dérivés du plasma (PDS), la pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) et l’héparine (15 U/mL). Compléter le milieu avec la puromycine (4 µg/mL) pour sélectionner des cellules endothéliales. Sachez que le traitement de la puromycine utilisable uniquement pour un maximum de 5 jours.
    3. Partie aliquote du milieu préparé en volumes de 6 mL et 10 mL dans deux tubes de 15 mL.
    4. Apporter capillaires dans une cuvette de l’azote liquide (étape 1.13) et décongeler les capillaires par utilisation d’un bain-marie à 37 ° C ou en ajoutant des 750 µL du milieu préparé de l’aliquote de 6 mL. Si le dégel par adjonction de ce médium, soigneusement Pipetter haut et en bas pour décongeler et homogénéiser la suspension. Lorsque dégelé, transférer la suspension cellulaire au milieu de 6 mL aliquot.
    5. Pour éliminer le milieu de congélation, faites tourner les capillaires vers le bas à 250 g, 4 ° C pendant 7 min.
    6. Soigneusement aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 à 2 mL de l’aliquote de 10mL. Lorsque remis en suspension, transvaser la solution dans le milieu 10mL aliquot.
    7. Transférer la suspension capillaire dans la fiole de T75 couchée et inclinez doucement le flacon pour assurer une répartition égale sur toute la surface. Placer la fiole T75 à 37 ° C, 5 % de CO 2.
      Jour 2
    8. Après une nuit d’incubation, préparer 10 mL pBEC croissance additionné à la puromycine (4 µg/mL) pour un flacon de T75 et effectuer un changement de milieu. N’oubliez pas que toutes les solutions moyennes appliquées aux cellules devraient être pré chauffées à 37 ° C avant utilisation.
      Remarque : Un changement moyen peut également être effectué 4 à 6 h après placage quand capillaires devraient avoir attaché à la surface. Incuber les cellules tant que confluent de 60 à 95 % est atteint, habituellement 3-5 jours de dégel. Faire pas allocroissance des cellules cellules w pour atteindre 100 % confluence pour éviter d’inhibition de contact qui peut arrêter davantage.
      Jour 4-6
    9. Lorsque la confluence désirée est obtenue, le passage des cellules endothéliales à inserts membrane perméable (voir la section 2.2). Si la confluence désirée n’est pas atteint au jour 4, changement de support est réalisé. Au plus tard le jour 6, les cellules doivent être repiquées sur les inserts membrane perméable. Si la confluence requis n’est pas obtenue par jour 6, les cellules ne conviennent pas pour une utilisation expérimentale.
      NOTE : la préparation des astrocytes de CCN : lorsque vous configurez le modèle de culture mixte, 2 - 8 semaines astrocytes dans la culture (voir chapitre 4) doivent être préparés pour le modèle de co-culture en effectuant un changement médiatique le jour avant le passage des cellules endothéliales à inserts. Pour chaque astrocyte, Eh bien, préparer 1500 µL de milieu de croissance astrocyte consistant en DMEM bas glucose additionné de 10 % FBS, pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 µg/mL) et puis effectuez le changement médiatique.
  2. Croissance du pBECs sur insère de Membrane perméable (5 jours)
    jour 4-6
    1. Prepare membrane perméable insère (plaque de 12 puits avec inserts de 1,12 cm 2 surface, 0,4 µm pores) pour ensemencement de pBEC par revêtement avec le collagène IV (500 µg/mL) et la fibronectine (100 µg/mL) dans ddH 2 O. utilisation environ 300 µL de chaque insert et s’assurer que la solution couvre toute la surface de croissance. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO 2 pendant au moins 2 h.
    2. Préparer 30 mL de milieu de croissance pBEC (pour la composition de médias, voir section 2.1.2) sans la puromycine.
    3. Aspirer moyen de culture pBEC dans la fiole T75 et délicatement laver deux fois avec 5 mL PBS stérile à la température ambiante.
    4. Trypsinize les cellules en ajoutant 2 mL de solution de trypsine-EDTA (2,5 % trypsine, 0,1 nM EDTA dans du PBS) à la T75 et placer le ballon à 37 ° C, 5 % CO 2 pendant 5-7 min.
    5. Pour détacher les cellules endothéliales du cerveau, Tapotez doucement le côté de la fiole T75 avec les doigts, laissant finalement péricytes survivant et fixation plus solide sur la surface du ballon. Visuellement, enquêter sur détachement sous un microscope. Lorsque le détachement de 80 % est observé, arrêtez la trypsinisation en ajoutant 5 mL de milieu.
    6. Transférer la solution de cellules dans un tube de 15 mL en utilisant une pipette 10 mL et la rotation vers le bas les cellules endothéliales du cerveau par centrifugation à 250 g, 4 ° C pendant 7 minutes.
    7. Soigneusement retirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1mL de milieu. En cas de suspension, ajouter à nouveau 2 mL du milieu pour porter le volume total à 3 mL de
    8. compter le nombre de cellules manuellement par l’utilisation d’une cellule de comptage de chambre ou une cellule automatique système de comptage. Préparer une solution de cellule de 2,2 x 10 5 cellules/mL de milieu, ayant pour résultat une densité de semis finale de 1,1 x 10 5 cellules/insérer.
    9. Enlever les inserts membrane perméable de solution d’enrobage et de transférer 500 µL de la suspension cellulaire à chaque insertion. Sur l’un des inserts, ajouter seul médium et utiliser cet encart comme un ' filtrer seulement ' contrôle pour les mesures de TEER.
    10. Établir les cellules endothéliales MC, MC avec ACM, ou dans le NCC avec astrocytes de la manière suivante :
      1. pour MC : ajouter 1500 µL de pBEC croissance moyenne/ACM / puits de la plaque de 12 puits sous les inserts membrane perméable. Les inserts membrane perméable à 37 ° C, 5 % de CO 2 et incuber pendant 2 jours.
      2. Pour NCC : transfert insère à Herbert George wells avec astrocytes rafraîchis avec le milieu de croissance astrocyte la veille. Les inserts membrane perméable à 37 ° C, 5 % de CO 2 et incuber pendant 2 jours.
        Remarque : N’oubliez pas de l’utilisation des différents types de supports dans les puits à fond des trois modèles de.
        Jour 6-8
    11. Au jour 2, changer le support sur les inserts membrane perméable avec pBECs. Préparer 500 µL de milieu de croissance pBEC par plaquette et soigneusement effectue le changement afin de minimiser les perturbations de la couche cellulaire. Incuber les cellules pendant deux jours. Sachez que le changement de support est réalisé sur inserts uniquement et non sur des puits à fond en.
  3. Stimulation avec facteurs de différenciation (1 à 2 jours)
    jour 8-10
    1. pour chacun des différents modèles, les médias de stimulation doit être préparé comme suit :
      1. pour MC : pour chaque Insérer et préparer ainsi, 500 µL de milieu de croissance pBEC contenant du cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) et RO (17,5 µM).
        MC : Préparer en outre 1500 µL de milieu de croissance pBEC contenant du cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) et RO (17,5 µM).
        MC avec ACM : décongeler 1500 µL d’ACM et compléter avec le cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) et RO (17,5 µM).
      2. Pour NCC : pour chaque insertion, préparer 500 µL de milieu de croissance pBEC contenant du cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) et RO (17,5 µM). Pour chaque astrocyte bien, préparer le 1500 µL de DMEM/F-12 additionné de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 µg/mL), de l’héparine (15 U/mL), cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) et RO (17,5 µM).
    2. Pour chacun des différents modèles, procéder à l’échange de médias comme suit :
      1. pour MC : aspirer moyen des puits et des insertions avec précaution et d’ajouter le support de différenciation à deux compartiments, avec 500 µL de chaque insertion et 1500 µL à chaque puits. Sachez que des perturbations sur les deux côtés de l’insert peuvent affecter et perturber la couche cellulaire.
      2. Pour NCC : soigneusement aspirer moyen des puits et ajouter 750 moyen de différenciation µL / puits. Aspirer moyen d’insertions avec précaution et ajouter 500 µL de milieu de différenciation par plaquette. Puis ajouter le restant 750 µL de milieu de différenciation à chaque bien astrocyte.
    3. Pour tous les modèles : les cellules à 37 ° C, 5 % de CO 2 et incuber avec moyen de différenciation jusqu’au prochain jour.
      Remarque : N’oubliez pas que pour la CCN avec les astrocytes, les astrocytes sont de ce point conservé dans un milieu sans sérum.

3. Les mesures de TEER

  1. le jour après la stimulation des cellules avec un moyen de différenciation, préparer le système de chambre de mesure de résistance des tissus pour les mesures de TEER en rinçant la chambre deux fois avec FD 2 O, une fois avec 70 % EtOH pendant 5 min et 2 fois plus avec les ddH 2 O.
  2. Ajouter 4 mL de DMEM/F-12 à la chambre de mesure de résistance tissulaire, connectez-le au système et calibrer pour environ 30 min selon les paramètres suivants : R = 0, Test R = 1000, Mode = R.
  3. Effectuer les mesures de TEER en plaçant soigneusement les inserts dans la chambre de mesure de la résistance des tissus. Pour chaque insertion, effectuer des mesures en trois exemplaires et calculer la moyenne de Ω cm 2.
    Remarque : Pour le modèle de la co-culture, valeurs TEER devraient atteindre > 500 Ω cm 2. Si le niveau approprié de TEER n’est pas atteinte sur le premier jour de mesure TEER, ajouter de nouveaux facteurs de différenciation (cAMP (250 µM), hydrocortisone (550 nM) et RO (17,5 µM)) et mesurer la TEER à nouveau le lendemain. Lorsque ces niveaux sont atteints, le modèle devrait être prêt pour l’expérience prévue. Sachez que les cellules devraient reposer pendant au moins 3 h avant d’effectuer l’expérience de récupérer après les mesures de TEER. Après stimulation, valeurs TEER en général il reste acceptables pendant 24-48 h après la stimulation.
    Remarque : Une méthode alternative et plus rapide à l’aide de la paire d’électrodes STX - 100C rigide aussi enregistre TEER élevé dans ce modèle 81. Le flexible ele STX2paire de ctrode donne lectures moins fiables.

4. PRÉPARATION d’ASTROCYTES de co-culture sans CONTACT : Autre méthode

  1. Purification des Astrocytes
    1. pour chaque rat cerveau utilisé, manteau 2 T75 flacons en ajoutant 10 mL de la poly-L-lysine (5 µg/mL) de ddH 2 O à chacun T75 fiole. Incuber les flacons à 37 ° C pendant 30 min.
    2. Isolation des astrocytes peut être effectuée comme suit :
      1. Rat astrocytes :
        1. Decapitate 2 1 - 2 jours vieux rats en utilisant une méthode approuvée.
        2. Couper la peau du crâne à partir de la nuque vers le nez et couper l’OS avec une incision sagittale.
        3. Ouvrir le crâne avec une pince courbée, sortez le cerveau et le placer dans un tube de 15 mL (1 tube) avec 11 mL de DMEM faible concentration de glucose additionnée de 10 % FBS et gentamycine sulfate (125 µg/mL).
        4. Soigneusement retirer les méninges avec une pincette de fine pointe et suspendre le matériau du cerveau à l’aide d’une pipette de 1 mL.
      2. Porcines astrocytes :
        1. obtenir 1 cerveau provenant d’un porc domestique de 5-6-month-old.
        2. Retirer délicatement les méninges du cerveau à l’aide de la pince fine pointe et/ou des mains.
        3. Recueillir 4 g gris matière du cerveau et place les morceaux dans 1 à 2 mL DMEM faible concentration de glucose additionnée de 10 % FBS et gentamycine sulfate (125 µg/mL) dans une boîte de Pétri. Si les morceaux sont gros, émincer avec scalpels ou forceps.
        4. Suspendre le matériel isolé à l’aide d’une pipette de 1 mL, déplacez-le dans un tube de 15 mL (tube 1) et le remplir avec DMEM faible concentration de glucose additionnée de 10 % FBS et gentamycine sulfate (125 µg/mL) pour un volume total de 11 mL.
        5. Continuer l’homogénéisation du matériel isolé avec une longue aiguille attachée à une seringue de 10 mL et suspendre et descendre 3 fois. Attendre que les gros morceaux sont sont installés dans le fond du tube, puis recueillir 7 mL de milieu du haut du tube (tube 1).
        6. La suspension cellulaire 7 mL filtrer sur un filtre en nylon de 40 µm dans un nouveau tube de 50 mL (tube 2).
        7. Ajouter 7 mL de milieu dans le tube 1 avec le cerveau. Continuer l’homogénéisation et la filtration de 4.1.2.2.5-6 étapes jusqu'à ce que le volume de la suspension de cellules filtrées dans le tube 2 est d’environ 35 mL.
    3. Supprimer la solution de revêtement de ces flacons T75 [étape 4.1.1]. Un lavage rapide avec 5 mL de PBS après incubation avec la poly-L-lysine peut être utilisée pour s’assurer que les cellules ne soient pas lésés par les effets toxiques de la solution de revêtement.
    4. , Diviser et amorcer la solution astrocyte isolé également entre les flacons T75. Incuber les flacons à 37 ° C, 5 % CO 2 pendant 3 à 5 jours.
  2. Cultivant des Astrocytes et NCC préparer avec des cellules endothéliales (3 semaines)
    1. Culture initiale
      1. après 3-5 jours d’incubation, effectuer un changement de moyen de soigneusement aspirant moyen et en ajoutant 10 mL de DMEM faible concentration de glucose additionnée de 10 % FBS et gentamycine sulfate (125 µg/mL).
        Remarque : Après le premier changement moyen, moyen doit être changé tous les 5 jours. Pendant les deux premières semaines, agiter les fioles et laver les cellules avec du PBS lors du changement de milieu. Cela contribue à l’élimination des microglies contaminantes.
      2. Après 3 semaines de culture, trypsinize les cellules en ajoutant 2 mL de solution de trypsine-EDTA au fond de chaque fiole T75 et incuber à 37 ° C, 5 % CO 2 pendant 5-7 min.
      3. Arrêter la trypsinisation en ajoutant 5 mL de milieu, transvaser la solution de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger les astrocytes à x 250 g, 4 ° C pendant 7 min.
      4. Soigneusement retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules en gel solution consistant en 10 % DMSO à BF.
      5. Compter le nombre de cellules et préparer une solution de cellule de 4,0 x 10 6 cellules/mL. Geler les cellules en ajoutant 1 mL par flacon de cryovials.
    2. Croissance perméable Membrane insérer système puits à fond (2-12 semaines)
      1. préparer 12 plats pour la croissance des astrocytes en ajoutant 1 mL de la poly-L-lysine (5 µg/mL) dans ddH 2 O dans chaque puits. Placer les plaques à 37 ° C pendant 2 h.
      2. Pour chaque plaque de 12 puits, préparer 25 mL de milieu de croissance astrocyte (DMEM faible concentration de glucose additionnée de 10 % FBS et pénicilline (100 U/mL) et à la streptomycine (100 µg/mL)).
      3. Apporter le flacon d’astrocytes de l’azote liquide et décongeler les cellules en ajoutant 750 µL de milieu de DMEM faible concentration de glucose. Pipetter soigneusement monter et descendre pour décongeler et homogénéiser la suspension. Lorsque dégelé, transférer la cellules en suspension dans un tube de 15 mL et ajouter le support pour un volume total de 7 mL.
        ATTENTION : L’azote liquide est très basse température, alors portez une protection individuelle tels que des gants.
      4. Pour éliminer le milieu de congélation, faites tourner les capillaires vers le bas à 250 g, 4 ° C pendant 7 min.
      5. Soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu.
      6. Enlever l’enduit du puits des 12 plaques bien et transférer la suspension cellulaire à Herbert George wells en utilisant 1 mL par puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO 2.
      7. Actualiser le support tous les trois jours et la culture des cellules pendant au moins 2 semaines avant d’utiliser les cellules de co-culture avec des cellules endothéliales. Les cellules peuvent être utilisés pour la culture mixte jusqu'à 12 semaines après décongélation, avec l’âge optimal étant de 2 à 8 semaines.

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Résultats

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Mise en place des modèles In Vitro BBB

Dans la méthode présentée, optimisée, culture de pBECs et l’établissement du système insert membrane perméable avec MC ou sans ACM ou NCC avec les astrocytes (Figure 1) a été réalisées pour une période de 9 à 11 jours (Figure 2). Pour la sélection des cellules endothéliales, une culture initiale des fragments capillaires puri...

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Discussion

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Purification et prolifération des pBEC

Au cours de la procédure de purification, étapes critiques incluent une élimination rapide et efficace des méninges et la séparation de la matière blanche et grise, ce qui est important pour le rendement de la purification et la pureté et la mise en place correcte du modèle. Pour le BBB présenté en vitro modèle d’à l’aide de pBECs, nous avons amélioré et simplifié d’une procédure de purification basée sur l’homogénéisation mécanique de matière grise...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs tient à remercier Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen et Niels M. Kristiansen, assistance technique, et la Fondation de Lundbeck octroyer le numéro R155-2013-14113.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FibronectineSigma-AldrichF1141
Collagène IVSigma-AldrichC5533
Poly-L-lysineSigma-AldrichP1524
DMEM/F-12LonzaBE12-719F
DMEM/Low GlucoseSigma-AldrichD6046
Pénicilline/StreptomycineGibco Invitrogen15140
Sérum dérivé du plasma (PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Trypsine/EDTAGibco Invitrogen15090-046
HéparineSigma-AldrichH3393
PuromycineSigma-AldrichP8833
HydrocortisoneSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
Sulfate de gentamicineLonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296Mélanger la solution à 70 % de l’EtOH
DNAse à1 Sigma-AldrichD4513
Collagénase CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2OFabriqué avec
des flacons Elga System T75Thermo Scientific156499
inserts Costar Transwell (inserts à membrane perméable aux cellules)CostarCLS3401Plaque à 12 puits, 12 mm de diamètre, 0,4 &mu ; Membrane en polycarbonate m
Tubes à centrifuger de 15 ml Tubes à centrifugerCellstar188271
50 mlCellstar 227261
Thermo Scientific150350
Flacons cryogéniquesThermo Scientific377224 Flacon de
500 mlThermo Scientific159910/159920
ScalpelsSwann-MortenREF0211Type 24
Homogénéisateur de tissusSigmaD9188
140 &mu ; filtres mMERCKNY4H04700
40 &mu ; m filtersCorning431750
Système de chambre EndOhmWorld Precision InstrumentsENDOHM-12Chambre EndOhm pour coupelles de culture de 12 mm
Système d’électrodes EVOM2World Precision Instruments300523+STX100CSystème de mesure TEER avec paire d’électrodes rigide STX-100C
Aiguille longueSigmaFixer à une seringue
Pince incurvée à pointe fineKLS Martin12-409-12-07
Pince à embout largeVWR82027-390
Porte-filtreMERCK MiliporeSwinnex-47
Seringue de 50 mlBraun4617509F
Seringue de 10 mlTerumoSSt20ESI
Anticorps anti-occludineAbcamab317211:100
Anti-p120 Anticorps caténineBD Laboratoires de transduction6101331:200
Anticorps anti-ZO-1Invitrogen61-73001:200
Anticorps anti-Claudin 5Sigma-AldrichSAB45029811:100
Donkey anti rabbit IgG conjugué à la farine Alexa 568Thermo ScientificA100421:500
Donkey anti souris IgG conjugué à la farine Alexa 488Thermo ScientificA212021:500
SaccharosePerkin ElmerNEC100X250UC0,15µ ; l/ml conc de travail final
Lucifer YellowSigmaL014410 µ ; g/ml conc de travail final
96 % Boîtes de Pétri

Références

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