Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

Résumé

Ce protocole décrit le développement d’un in vitro humain modèle préclinique d’osteoclastogenesis de monocytes du sang périphérique, cultivées avec des lignées de cellules cancéreuses du sein pour imiter l’interaction cellule-ostéoclastes de cancer. Le modèle pourrait être utilisé pour approfondir nos connaissances de la formation de métastases osseuse et améliorer les options thérapeutiques.

Résumé

La diaphonie entre les cellules tumorales et des cellules osseuses dans le microenvironnement osseux est essentielle pour comprendre le mécanisme de la formation de métastases osseuse. Nous avons développé un in vitro entièrement humain modèle préclinique d’une co-culture de cellules cancéreuses du sein et les monocytes en cours de différenciation vers les ostéoclastes. Nous avons optimisé un modèle d’osteoclastogenesis à partir d’un échantillon de sang périphérique provenant de donneurs sains. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ont d’abord séparés par centrifugation en gradient de densité, injectées à une densité élevée et induites à se différencier en ajoutant deux facteurs de croissance (GFs) : activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB ligand (RANKL) et macrophages facteur stimulant les colonies (MCSF). Les cellules ont été laissés dans la culture pendant 14 jours puis fixe et analysés par l’analyse en aval. Dans les métastases osseuses ostéolytiques, l’un des effets de l’arrivée de cellules du cancer dans l’OS est l’induction d’osteoclastogenesis. Ainsi, nous avons attaqué notre modèle avec co-cultures de cellules cancéreuses du sein afin d’étudier le pouvoir de différenciation des cellules cancéreuses à l’égard de GFs. Un moyen simple d’étudier l’interaction cellule-ostéoclastes cancer consiste à effectuer des co-cultures indirectes basées sur l’utilisation du milieu conditionné provenant de cultures de cellules de cancer du sein et mélangé avec un milieu frais. Ce mélange est ensuite utilisé pour induire la différenciation des ostéoclastes. Nous avons optimisé également une méthode de co-culture directe dans laquelle le cancer des cellules et des monocytes en cours de différenciation partagent le milieu et d’échangent des facteurs sécrétés. C’est une amélioration significative sur la méthode originale de co-culture indirecte car les chercheurs peuvent observer les interactions réciproques entre les deux types cellulaires et effectuer des analyses en aval pour les cellules cancéreuses et les ostéoclastes. Cette méthode nous permet d’étudier l’effet des drogues sur le microenvironnement osseux métastatique et aux lignées de cellules de semence autres que ceux provenant d’un cancer du sein. Le modèle peut également servir à étudier d’autres maladies comme l’ostéoporose ou d’autres maladies osseuses.

Introduction

L’OS est un site commun de métastase pour différents types de tumeurs primaires telles que le cancer de la prostate, du poumon et du sein, avec 20 à 25 % des patients présentant des métastases osseuses au cours de la maladie^1,2,3. En particulier, 70 % des patientes atteintes de cancer portent témoignage de métastase osseuse à mort⁴. Tumeur et les cellules stromales interaction est essentielle pour la progression du cancer en cancer primitif et lésions secondaires. Dans le microenvironnement osseux, métastases osseuses ostéolytiques du cancer dépendent ....

Protocole

humains ostéoclastes étaient différenciés de PBMC de donneurs sains qui ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique local, conformément aux normes éthiques fixés dans la déclaration d’Helsinki de 1964.

1. différenciation des ostéoclastes

Remarque : recueillir du sang périphérique ou manteaux buffy de donneurs humains sains à l’EDTA. N’utilisez pas de moins de 20 mL de sang périphérique. Buffy manteaux est préférables car ils ont une plus grande abondance de cellules mononucléaires. Effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte....

Résultats

Une méthode a été optimisée pour différencier facilement les ostéoclastes de monocytes du sang périphérique humain. La culture de monocyte a été cultivée avec les cellules cancéreuses, confirmant (comme décrit dans la littérature¹⁸) que les cellules cancéreuses sont capables de supporter des osteoclastogenesis dans les métastases osseuses. Les ostéoclastes différencient de cellules cancéreuses et GFs sont indiquées à la Figure 1. Une c.......

Discussion

Des modèles précliniques in vitro étudie les mécanismes de la diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont nécessaires pour identifier les mécanismes de la métastase osseuse qui peut être utilisé pour créer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons développé un modèle entièrement humain in vitro d’osteoclastogenesis de sang périphérique humain (Figure 3). Lors de l’optimisation de la méthodologie, un certain nombre de points critiques ont .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
et alpha ; MEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamine	Life-technologies	ECB3000D
Fetal Bovin Serum	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	indications de stockage doivent être respectées
hRANKL	Peprotech	310-01	indications de stockage doivent être respectées
Phosphatase acide, Kit leucocytaire (TRAP)	Sigma Aldrich	387 A
Milieu de séparation des lymphocytes	Biowest	L0560-100
Tampon de lysage des globules rouges	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsine	EuroClone	COD. ECB3052D
Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 4 %, grade EM	Microscopie électronique Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 lignée cellulaire	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	Ces inserts sont destinés aux plaques à 24 puits ; 6,5 mm, 0,4 &mu ; M ; taille des pores

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