Article de méthode

Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

DOI :

10.3791/56311

⸱

13 septembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit le développement d’un in vitro humain modèle préclinique d’osteoclastogenesis de monocytes du sang périphérique, cultivées avec des lignées de cellules cancéreuses du sein pour imiter l’interaction cellule-ostéoclastes de cancer. Le modèle pourrait être utilisé pour approfondir nos connaissances de la formation de métastases osseuse et améliorer les options thérapeutiques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diaphonie entre les cellules tumorales et des cellules osseuses dans le microenvironnement osseux est essentielle pour comprendre le mécanisme de la formation de métastases osseuse. Nous avons développé un in vitro entièrement humain modèle préclinique d’une co-culture de cellules cancéreuses du sein et les monocytes en cours de différenciation vers les ostéoclastes. Nous avons optimisé un modèle d’osteoclastogenesis à partir d’un échantillon de sang périphérique provenant de donneurs sains. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ont d’abord séparés par centrifugation en gradient de densité, injectées à une densité élevée et induites à se différencier en ajoutant deux facteurs de croissance (GFs) : activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB ligand (RANKL) et macrophages facteur stimulant les colonies (MCSF). Les cellules ont été laissés dans la culture pendant 14 jours puis fixe et analysés par l’analyse en aval. Dans les métastases osseuses ostéolytiques, l’un des effets de l’arrivée de cellules du cancer dans l’OS est l’induction d’osteoclastogenesis. Ainsi, nous avons attaqué notre modèle avec co-cultures de cellules cancéreuses du sein afin d’étudier le pouvoir de différenciation des cellules cancéreuses à l’égard de GFs. Un moyen simple d’étudier l’interaction cellule-ostéoclastes cancer consiste à effectuer des co-cultures indirectes basées sur l’utilisation du milieu conditionné provenant de cultures de cellules de cancer du sein et mélangé avec un milieu frais. Ce mélange est ensuite utilisé pour induire la différenciation des ostéoclastes. Nous avons optimisé également une méthode de co-culture directe dans laquelle le cancer des cellules et des monocytes en cours de différenciation partagent le milieu et d’échangent des facteurs sécrétés. C’est une amélioration significative sur la méthode originale de co-culture indirecte car les chercheurs peuvent observer les interactions réciproques entre les deux types cellulaires et effectuer des analyses en aval pour les cellules cancéreuses et les ostéoclastes. Cette méthode nous permet d’étudier l’effet des drogues sur le microenvironnement osseux métastatique et aux lignées de cellules de semence autres que ceux provenant d’un cancer du sein. Le modèle peut également servir à étudier d’autres maladies comme l’ostéoporose ou d’autres maladies osseuses.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’OS est un site commun de métastase pour différents types de tumeurs primaires telles que le cancer de la prostate, du poumon et du sein, avec 20 à 25 % des patients présentant des métastases osseuses au cours de la maladie1,2,3. En particulier, 70 % des patientes atteintes de cancer portent témoignage de métastase osseuse à mort4. Tumeur et les cellules stromales interaction est essentielle pour la progression du cancer en cancer primitif et lésions secondaires. Dans le microenvironnement osseux, métastases osseuses ostéolytiques du cancer dépendent de la mise en place d’un cercle vicieux pathologique survenant entre cellules cancéreuses, les cellules osseuses et le microenvironnement osseux. Cellules cancéreuses perturbent l’équilibre osseuse, augmentation osseuse résorption5,6,7.

Dans des conditions normales et pathologiques, les ostéoclastes sont les cellules responsables de la résorption osseuse, tandis que les ostéoblastes, en déposant la nouvelle matrice, sont responsables de la formation8de l’OS nouveau. L’activité ostéoclastique est réglementée par les ostéoblastes à travers l’expression de RANKL, qui se lie à son récepteur RANK sur la surface des ostéoclaste, induisant des ostéoclaste avant la fusion, un processus nécessaire pour une différenciation des ostéoclastes matures. L’induction d’osteoclastogenesis augmente la résorption osseuse. Un grand nombre d’études in vivo ont considérablement amélioré notre compréhension des os métastase formation9,10,11. Cellules cancéreuses de la tumeur primaire et dans le microenvironnement osseux perturbent l’homéostasie osseuse, promotion osteoclastogenesis et8de la résorption des os. Dans ce scénario, toutes les interactions moléculaires qui se produisent entre les cellules cancéreuses et les ostéoclastes sont d’une importance cruciale. Comme nous l’avons déjà mentionné, le mécanisme de la formation de métastases osseuse a été élucidé dans les modèles de souris in vivo . Cependant, outre le fait que l’approbation de tous les in vivo l’expérimentation animale par le Comité d’éthique, il y a plusieurs autres inconvénients lorsque vous exécutez des expériences in vivo notamment les coûts élevés et des méthodes fastidieuses. Plusieurs auteurs ont combiné des modèles précliniques in vivo et in vitro d’osteoclastogenesis en utilisant une ligne murine des ostéoclastes pré appelé RAW246.79,10,11. Les inconvénients de ce modèle proviennent du fait que les cellules se sont déjà engagés à devenir des ostéoclastes et ne sont pas d’origine humaine. Pour ces raisons, la recherche translationnelle pourrait grandement bénéficier de la disponibilité de in vitro entièrement humain modèles précliniques pour étudier les interactions entre cellules de cancer osseux.

Nous avons optimisé une méthode d’osteoclastogenesis in vitro à partir des échantillons de sang périphérique humain12,13. Les ostéoclastes dérivent des monocytes, qui sont présents, bien que dans une faible mesure, dans des échantillons de sang périphérique. Les cellules mononucléaires sont d’abord séparés des érythrocytes et granulocytes présents dans le sang total par gradient de densité de gradient de Ficoll ; ils sont ensuite sélectionnés grâce à leur capacité à adhérer à un substrat en plastique, à la différence des lymphocytes. Après l’ensemencement, les cellules sont cultivées pendant 14 jours. MCSF et RANKL sont le GFs requis par les monocytes de différencier tout d’abord en macrophages, puis en ostéoclastes14,15. MCSF est nécessaire pendant toute la durée de l’essai, tandis que RANKL est utilisé pour induire le processus de différenciation dans les derniers stades d’osteoclastogenesis. Dans la phase précoce de la différenciation, MCSF aide monocytes proliférer et à survivre14,15. Au cours de la deuxième partie d’osteoclastogenesis, cellules fusionnent et matures comme les ostéoclastes, montrant la répartition caractéristique de l’actine F dans les anneaux et expriment des marqueurs spécifiques tels que les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) et récepteur calcitonine (CTR) 14 , 15. notre méthode consiste à ajouter le MCSF à la culture de monocyte pour les 7 premiers jours de l’expérience et une combinaison de MCSF et RANKL de jours 7 à 14. À la fin de l’expérience, osteoclastogenesis est analysée en comptant les cellules différenciées, comme détaillé ci-dessous.

Les cultures de monocyte induites à se différencier par GFs forment la base de notre modèle préclinique. Nous avons optimisé un système de co-culture sans GFs pour mieux comprendre le pouvoir d’osteoclastogenic des cellules cancéreuses du sein. Nous avons développé tout d’abord un modèle des co-cultures indirectes en ajoutant un support (80 % α-milieu essentiel Minimal (α-MEM) et 20 % conditionnée moyen prélevé une culture de cellules cancéreuses du sein qu’environ 90 % anastomosé aux cellules subissent la différenciation12 . Le milieu conditionné (non prélevé dans des conditions de privation de sérum) a été capturé après 24 heures et mélangé avec un milieu frais à une proportion de 1:4. Le milieu conditionné induite par différenciation ostéoclastique significative en ce qui concerne le contrôle négatif. Cependant, comme les informations sur l’interaction réciproque entre cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont perdues lors de l’utilisation indirectes co-cultures, nous avons amélioré notre système en effectuant des co-cultures directs. Nous avons ensemencé des cellules cancéreuses à 0,4 µM insère et placés dans le puits où les cellules mononucléaires sont plaqués. En utilisant cette méthode, les cellules partagent le même milieu et échangent des protéines sécrétées. Ainsi, nous avons créé un modèle préclinique pleinement humain d’osteoclastogenesis induite par le cancer des cellules13.

Ce système est extrêmement souple et peut être utilisé à des fins de recherche différentes, par exemple, dans des études pharmacologiques sur le rôle des médicaments dans les métastases osseuses. Notre modèle permet d’étudier l’efficacité et les mécanismes d’action des thérapies ciblées OS et/ou médicaments antitumoraux dans le microenvironnement osseux en présence de cellules de cancer du13. Concevez les expériences avec les réglages corrects, c'est-à-dire, les cellules cancéreuses et les ostéoclastes cultivés individuellement, rend plus facile à comprendre l’impact de la co-culture sur drogues est très actif. Cette approche devient encore plus intéressante lorsque le médicament à l’étude vise les deux cancer des cellules et des ostéoclastes, par exemple, évérolimus16. Ce modèle peut également être utilisé pour identifier de nouvelles voies d’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

humains ostéoclastes étaient différenciés de PBMC de donneurs sains qui ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique local, conformément aux normes éthiques fixés dans la déclaration d’Helsinki de 1964.

1. différenciation des ostéoclastes

Remarque : recueillir du sang périphérique ou manteaux buffy de donneurs humains sains à l’EDTA. N’utilisez pas de moins de 20 mL de sang périphérique. Buffy manteaux est préférables car ils ont une plus grande abondance de cellules mononucléaires. Effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte stérile vitroplants.

  1. Sang total EDTA dilué 1:1 avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Remettre en suspension bien.
  2. Couche sur les médias de séparation de lymphocytes (PBS de sang : médias de séparation de lymphocytes, 2:1) dans des tubes de 50 mL.
    1. Pipette de 30 mL de sang dilué dans du PBS dans un tube de 50 mL.
    2. Doucement assise 15 mL de médias de séparation de lymphocytes dans le bas du tube de 50 mL.
  3. Centrifugeuse à 757 × g pendant 10 min à température ambiante (sans frein).
  4. Le prélèvement de cellules mononucléaires :
    1. recueillir la couche de cellules mononucléaires avec une pipette de 5 mL blanche sans agitation et placez-le dans un nouveau tube de 50 mL.
    2. Diluer les PBMC collectées avec 20 mL de PBS.
  5. Laver les PBMC :
    1. centrifugeuse à 225 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Jeter le surnageant en renversant le tube. Répéter une fois.
  6. Lyse RBC :
    Remarque : si le culot cellulaire est rouge, traiter des cellules avec des globules rouges, solution tampon de lyse (voir Table des matières).
    1. Mettre le tube de 50 mL sur glace.
    2. Ajouter 5 mL de tampon de lyse de globules rouges.
    3. Attendre 3-5 min pour terminer la lyse des érythrocytes. Le temps varie selon le degré de contamination érythrocytaire.
    4. Arrêter la réaction en ajoutant 20 mL de PBS.
    5. Centrifugeuse à 225 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant en renversant le tube.
      Remarque : En option : si la lyse de la RBC est effectuée, laver les PBMC tel que décrit ci-dessous.
  7. Lavage PBMC :
    1. Ajouter 20 mL de PBS et centrifuger à 225 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Jeter le surnageant en renversant le tube.
  8. Remettre en suspension les cellules complète α-MEM (additionné de 1 % de glutamine (concentration initiale 100 X) et 10 % sérum de veau fœtal).
  9. Compter les cellules avec une chambre de Neubauer.
    1. Diluer l’échantillon 1/100 dans l’acide acétique glacial et 10 µL de la dilution permet de compter les cellules.
    2. Compter au moins deux fois et calculer la moyenne des répétitions pour obtenir le nombre moyen de cellules recueillies.
  10. Plaque de cellules :
    1. plaque de cellules à une concentration de 750 000 PBMC par cm 2.
    2. Stocker plaqué de cellules dans un incubateur à 37 ° C en atmosphère 5 % CO 2.
      NOTE : Conception de l’expérience pour inclure les contrôles négatifs, qui sont des cellules qui sont traités avec normal complet α-MEM sans MCSF ni RANKL GFs. n’oubliez pas d’effectuer chaque condition au moins 3 techniques réplique. Effectuer au moins 3 réplicats biologiques.
  11. Changer le milieu supplémenté avec GFs :
    1. attendre environ 3 h après l’ensemencement de la cellule, puis enlever le milieu en pipette (200-1 000 µL) de se défaire des débris, seules les cellules et les érythrocytes.
      Remarque : Soyez prudent lorsque vous modifiez le milieu pour éviter le détachement cellulaire.
    2. Ajouter nouveau complet α-MEM additionné de 20 ng/mL de MCSF (500 µL/puits).
      Remarque : Lorsque co-culture avec les cellules cancéreuses, les cellules semences le cancer le jour après l’ensemencement de PBMC.
  12. Changer les médias tous les 2-3 jours (α-MEM additionné de 20 ng/mL de MCSF) :
    1. jeter le milieu par une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter nouveau milieu frais par une pipette de 200-1 000 µL.
  13. 6-7 jours après l’ensemencement de cellule, ajouter 20 ng/mL de RANKL complet α-MEM + MCSF.
  14. Changer le milieu (α complète-MEM + MCSF + RANKL) tous les 2-3 jours :
    1. jeter le milieu avec une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter nouveau média avec une pipette de 200-1 000 µL. Induction de la différenciation du arrêter 14 jours après l’ensemencement de la cellule.
    3. Écart moyen et laver deux fois avec du PBS.
  15. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde :
    1. cellules demeurent sécher.
    2. Ajouter paraformaldéhyde à 4 % (voir la Table des matières).
    3. Laisser incuber pendant 20 min à température ambiante.
  16. Jeter paraformaldéhyde et laver deux fois avec 500 µL de PBS.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; Veuillez porter des gants, masque et lunettes.
  17. Permettre aux cellules sécher.
  18. Piège à effectuer la coloration selon le fabricant ' s directives (voir Table des matières).
  19. Compter cellules ostéoclastiques manuellement sous le microscope à grossissement 10 X ; NA 0.30.
    NOTE : Cellules semblables à des ostéoclastes sont définis comme polycarion cellules de piège + au moins 4 noyaux.

2. Les Cultures de cellules de cancer

Remarque : les expériences peuvent être effectuées avec différents types de lignées de cellules adénocarcinome du sein tels que sep2 17, une lignée de cellules d’osteotropic provenant de l’homme triple négatif lignée cellulaire de cancer du sein (MDA-MB-231) et la lignée de cellules de récepteurs hormonaux MCF7.

  1. La culture des cellules comme une monocouche dans des flacons de 75 cm 2.
    1. Cellules cancéreuses seed 1 000 000 dans une fiole de 75 cm, 2.
    2. Stocker les cellules à 37 ° C dans un milieu additionné de 1 % glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal dans une atmosphère de 2 CO 5 % complet α-MEM.
  2. Détacher les cellules à une confluence d’environ 90 % :
    1. jeter le milieu, laver avec du PBS et ajouter 2 à 3 mL de trypsine 1 X dans du PBS.
    2. Incuber les cellules pendant 3 à 5 min à 37 ° C.
    3. Recueillir les cellules individuelles de la fiole de 75 cm 2 par une pipette 10 mL, 8 ml de milieu complet pour arrêter la réaction enzymatique.
    4. Centrifuger à 225 x g pendant 5 min.
  3. Laver les cellules cancéreuses :
    1. Ajouter 10 mL de PBS.
    2. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min.
  4. Compter les cellules cancéreuses avec une chambre de Neubauer.
    1. Compter au moins deux fois par les cellules cancéreuses et de calculer la moyenne des répétitions pour obtenir le nombre moyen de cellules recueillies.

3. Direct des co-cultures de cellules cancéreuses une nd Monocytes en cours de différenciation vers les ostéoclastes

  1. les cellules cancéreuses sur plaquettes (pore diamètre 0,4 µm) de semences :
    1. graines les cellules cancéreuses à une concentration de 4 000 cellules / cm 2.
    2. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO 2.
      NOTE : Semences le cancer des cellules au lendemain de PBMC semis pour l’expérience de co-culture de 0,4 µm insertions.
  2. Attendre 24 heures afin de permettre aux cellules d’adhérer.
  3. Place la tête de série insérer la culture sur les cultures mononucléaires pour démarrer la co-culture (voir la section 1.10 du protocole).
  4. Changement des médias tous les 2-3 jours avec bain α-MEM.
    1. Jeter le milieu avec une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter 500 µL de frais moyen.
      Remarque : L’objectif principal de la co-culture doit comprendre le pouvoir d’osteoclastogenic des cellules cancéreuses, par conséquent, le GFs ne sont pas ajouté au α-MEM. Pour chaque expérience de co-culture, inclure negative contrôles (voir la note à l’étape 1.10 du protocole) et des témoins positifs des ostéoclastes différenciés par RANKL et MCSF (pas de cellules cancéreuses). Cellules cancéreuses ensemencées dans les encarts ne pas placées au-dessus des cellules mononucléaires sont utilisés comme contrôle négatif de la co-culture.
  5. Arrêter la co-culture et utiliser des cellules cancéreuses pour analyse en aval :
    1. 13 jours après le semis de PBMC et 12 jours après l’ensemencement de cellules du cancer, placer l’insert sur une nouvelle assiette.
    2. Arrêter la culture de cellules de cancer sur la base desquels les analyses en aval sont à effectuer (voir Discussion).
  6. Le 14e jour, arrêter la différenciation ostéoclastique et fixer les cellules, comme indiqué dans l’étape 1.15.
  7. Piège à effectuer la coloration immédiatement ou dans les 14-30 jours.
    NOTE : La coloration facultatif : pour vérifier que les cellules de polycarion piège + sont les ostéoclastes, chercheurs peuvent effectuer taches supplémentaires pour détecter les CTR, un marqueur d’ostéoclastes spécifique. La détection des anneaux d’actine-F est un autre ostéoclastiques spécifiques coloration test 12 , 13 , 14.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une méthode a été optimisée pour différencier facilement les ostéoclastes de monocytes du sang périphérique humain. La culture de monocyte a été cultivée avec les cellules cancéreuses, confirmant (comme décrit dans la littérature18) que les cellules cancéreuses sont capables de supporter des osteoclastogenesis dans les métastases osseuses. Les ostéoclastes différencient de cellules cancéreuses et GFs sont indiquées à la Figure 1. Une c...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des modèles précliniques in vitro étudie les mécanismes de la diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont nécessaires pour identifier les mécanismes de la métastase osseuse qui peut être utilisé pour créer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons développé un modèle entièrement humain in vitro d’osteoclastogenesis de sang périphérique humain (Figure 3). Lors de l’optimisation de la méthodologie, un certain nombre de points critiques ont ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Yibin Kang pour la fourniture de la lignée cellulaire de sep2 et Cristiano Verna pour aide à la rédaction.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
et alpha ; MEMEurocloneBE12-169F
GlutamineLife-technologiesECB3000D
Fetal Bovin SerumLife-technologiesECS0180DPR
hMCSFPeprotech300-25indications de stockage doivent être respectées
hRANKLPeprotech310-01indications de stockage doivent être respectées
Phosphatase acide, Kit leucocytaire (TRAP)Sigma Aldrich387 A
Milieu de séparation des lymphocytesBiowestL0560-100
Tampon de lysage des globules rougesSIgma11814389001
ROCHE
TrypsineEuroCloneCOD.
ECB3052D
Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 4 %, grade EMMicroscopie électronique Sciences157-4-100
MDA-MB-231 lignée cellulaireATCCCRM-HTB-267
MCF7ATCCHTB-22
TranswellCorning3470-ClearCes inserts sont destinés aux plaques à 24 puits ;
6,5 mm, 0,4 &mu ; M ;
taille des pores
Les Les

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
  2. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
  3. Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
  4. Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
  5. Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
  6. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
  7. Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215(2010).
  8. Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
  9. Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
  10. Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
  11. Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
  12. Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
  13. Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827(2016).
  14. Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
  15. Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
  16. Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
  17. Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  18. Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692(2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

OsteoclastogenesisPeripheral Blood MonocytesBreast Cancer Co cultureRANKL MCSF DifferentiationDensity Gradient CentrifugationTRAP StainingConditioned MediumDirect Co cultureGene Expression AnalysisWestern Blot

Articles connexes