Un protocole pour l’application de neuroprotective de traitement plasma pression atmosphérique faible dose sur les blessures de SH-SY5Y privation induite par le glucose.
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Article de méthode
Nouvelle Application d’un Jet de Plasma de la pression atmosphérique comme Agent neuroprotecteur contre les dommages causés par les privations de Glucose des cellules SH-SY5Y
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le jet de plasma de la pression atmosphérique (APPJ) a attiré l’attention de nombreux chercheurs de nombreuses disciplines ces dernières années parce que ses émissions comprennent plusieurs types d’espèces réactives de l’azote (IA) et les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Notre étude antérieure a montré l’effet cytoprotecteur de l’APPJ contre des blessures provoqués par le stress oxydatifs. La présente étude vise à fournir un protocole de traitement détaillé en vitro concernant les demandes de neuroprotective d’hélium APPJs sur blessure induite par la privation de glucose dans les cellules SH-SY5Y. La lignée de cellules de neuroblastome dérivée humaine SH-SY5Y a été maintenue dans un milieu RPMI 1640 additionné de sérum de veau foetal de 15 %. Le milieu de culture a été ensuite remplacé RPMI 1640 sans glucose avant le traitement APPJ. Après une incubation de 1 h dans un incubateur à cellules, la viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide de la cellule de comptage Kit 8. Les résultats montrent que, par rapport au groupe de privation de glucose, les cellules traitées avec APPJ expose la viabilité cellulaire nettement accrue de manière dose-dépendante, avec 8 s/puits observée comme une dose optimale. Pendant ce temps, les flux d’hélium est sans effet sur l’altération cellulaire induite par la privation de glucose. Nos résultats indiquent que APPJ pourrait être potentiellement utilisé comme une méthode de traitement pour les maladies du système nerveux central lié à la privation de glucose. Ce protocole pourrait également servir comme une application cytoprotecteurs pour les autres cellules déficientes différents, mais la culture cellulaire et les conditions de traitement APPJ devraient être réajustées, et la dose de traitement doit être relativement faible.
Introduction
Le cerveau adulte utilise presque exclusivement le glucose comme substrat pour le métabolisme énergétique dans les conditions physiologiques normales. Le cerveau humain ne représente que 2 % du poids du corps mais consomme environ 25 % du glucose total dans le corps1. Il est bien documenté cette dysfonction de métabolisme de glucose est l’un des principaux changements pathologiques au cours d’accident vasculaire cérébral ischémique et diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Huntington (MH) et maladie de Parkinson (MP) 2,3. L’absence de glucose et la captation d’une intolérance au glucose ou la phosphorylation oxydative peut un impact direct sur la production d’ATP et de plus induire la mort cellulaire neuronale, qui peut augmenter le risque de dysfonction neuronale, suggérant que maintenir la viabilité cellulaire ou retarder les lésions des cellules après que privation de glucose peut être une approche raisonnable pour le traitement de ces maladies. L’étude des effets neuroprotecteurs via la modulation de la glycémie, en se concentrant sur les agents anti-inflammatoires, modulateurs de canaux ioniques, piégeurs de radicaux libres, facteurs neurotrophiques, etc. a été d’intérêt. Cependant, la traduction de ces approches de neuroprotective de banc pour la pratique clinique n’a pas réussi4.
Jets de plasma de la pression atmosphérique (APPJs) sont un nouveau type de technologie de décharge de gaz atmosphérique basse température qui a attiré l’attention de nombreux chercheurs de nombreuses disciplines ces dernières années. APPJs ont été utilisés pendant des décennies dans diverses applications biomédicales telles que le traitement du cancer cell, inactivation bactérienne, la coagulation sanguine, la cicatrisation des plaies, médecine buccale,5, etc.6, en raison de ses émissions de plusieurs types des espèces réactives de l’azote (IA) et des espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Figure 1)7. Les demandes antérieures de bio-médecine de plasma a surtout porté sur le stress oxydatif ou nitrative sur les bactéries, les cellules et les tissus,8. Toutefois, l’APPJ pourrait également être une « double tranchant » puisque les RNS et ROS sont des molécules de signalisation intracellulaires importants, associés à de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques9. Protoxyde d’azote (NO) contrôle une large gamme de procédés biologiques et joue un double rôle dans le corps humain, en particulier dans le système nerveux central (SNC). Faibles niveaux de NO ont montré leur activité neuroprotectrice les deux in vitro et in vivo par l’intermédiaire de multiples signaux voies10. Notre étude précédente pour la première fois que hélium APPJ induite par l’absence de production a été impliqué dans l’effet neuroprotecteur de APPJ contre des blessures provoqués par le stress oxydatif,11. Cependant, les effets de APPJs sur les autres blessures n’ont pas été signalés. Par conséquent, le but de cette étude est de fournir un protocole de traitement in vitro concernant les demandes de neuroprotective d’hélium APPJ sur blessure induite par la privation de glucose dans les cellules SH-SY5Y. Différent des précédentes études, notre protocole utilisé traitement plasma de bas-dose pour des applications de neuroprotecteurs sans les conséquences excessives blessures induite par le plasma, indiquant que le traitement APPJ pourrait être potentiellement utilisé comme un roman « aucun médicament donneur « pour de futures recherches et même pour la traduction clinique. Ce protocole a également été proposé pour être utilisé comme une application cytoprotecteurs pour d’autres types de cellules avec des handicaps différents, mais les conditions de traitement APPJ doivent être réajustées et la dose de traitement doit être relativement faible.
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Protocole
1. préparation de l’appareil APPJ
attention : veuillez consulter toutes les fiches signalétiques (FS) avant utilisation. S’il vous plaît utiliser les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution de toutes les expériences, y compris l’utilisation d’une hotte de laboratoire et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse de laboratoire, etc.). Le protocole exige des cellules standard (stérilisation, récupération de cellules, cellule passage, gel cell, cellule coloration, etc.) des techniques de manutention.
- Choisir un tube de quartz avec un diamètre intérieur de 1 mm et un diamètre extérieur de 3 mm. lisser les sections transversales aux deux extrémités à l’aide d’une feuille de polissage.
- Utiliser une aiguille en acier nickelée avec un diamètre de 1,0 mm comme l’électrode haute tension. Broyer avec un rayon de courbure de 0,05 mm à son extrémité. Buse de
- enveloppe d’aluminium (2 mm de largeur) autour du tube de quartz à 1 cm du tube de quartz. Fixer le point d’aiguille en acier inoxydable à 1 cm de l’autre bout de la feuille d’aluminium. Utilisez l’anneau de papier d’aluminium comme électrode basse tension.
2. Acquisition de Jets
- de fournir un signal alternatif, connectez l’amplificateur de puissance haute tension pour le générateur de signaux de fonction qui sert comme source d’alimentation. Pour enregistrer les formes d’onde de la tension appliquée à l’électrode haute tension, connectez une extrémité de la sonde haute tension à l’oscilloscope numérique et connectez l’autre extrémité de l’alimentation. Pour protéger le circuit, utiliser un 2 k Ω résistance comme une résistance série. Raccorder le circuit tel qu’illustré à la Figure 2.
ATTENTION : Ne pas toucher les lignes à haute tension. - Continuellement passer hélium (fraction volumique, 99,999 %) sur le tube de quartz et de contrôler le débit de gaz à un Standard stable 1.4 litres par Minute (SLM).
NOTE : Nous n’utilisons pas un filtre avant de traiter les cultures de cellules. La fraction volumique de l’hélium utilisé dans l’expérience est de 99,999 %, et la plupart des micro-organismes ne peuvent pas vivre dans ces conditions. - Mettre sous tension de l’oscilloscope, générateur de signaux et amplificateur de puissance haute tension. Faites tourner la molette de réglage de fréquence à 5 kHz. Augmenter graduellement la tension à une valeur de crête à crête de 6 kV.
Remarque : Le jet est assez long (environ 3 cm) lorsque la valeur de crête à crête de la tension appliquée à l’aiguille est environ 6 kV.
3. Préparation des cellules SH-SY5Y
- lignée de cellules de neuroblastome dérivées humaines élèvent le SH-SY5Y dans un ballon jaugé de 25 cm 2 en milieu RPMI 1640 additionné de 15 % de sérum de veau fœtal (SVF). Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié contenant 5 % CO 2 et 95 % air à 37 ° C.
- Lorsque les cellules atteignent 85 % confluence, aspirer avec précaution les milieux de culture et ajouter trypsine 0,25 % 1 mL + EDTA 0,1 % pour les cellules.
- Après 15 s d’incubation à température ambiante, a soigneusement aspirer la trypsine et ajouter 2 mL RPMI 1640 contenant 15 % FBS pour neutraliser.
- Pipetez doucement verticalement, laver le fond du puits, jusqu'à ce que la monocouche SH-SY5Y est complètement détachée.
- Compter les cellules par le biais de l’hémocytomètre et ajuster la concentration en cellules à 2 x 10 5 cellules/mL en ajoutant RPMI 1640 moyenne + 15 % FBS, puis transférer 100 µL de la suspension de cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.
- Autoriser les cellules attacher pendant 12 h dans un incubateur à cellules avant traitement APPJ.
4. Traitement APPJ du SH-SY5Y
tube- régler la distance entre la buse du quartz et la plate-forme où sera placée la plaque 96 puits à 3 cm. veiller à ce que le faisceau peut toucher la surface du milieu de culture.
Remarque : La distance n’est pas mesurée par le bas de la plaque. Tout d’abord, il est ajusté à 3 cm entre l’embout du tube de quartz et de la plate-forme utilisée pour placer la plaque à 96 puits. - Avant le traitement APPJ, changer le milieu de culture dans chaque puits sauf les puits témoins RPMI 1640 sans milieu glucosé.
- Placer la plaque sous le bec APPJ et veiller à ce que les jets peuvent tirer verticalement dans chaque puits.
- Cellules de régal dans des puits séparés avec APPJ pour 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s et 12 s.
Remarque : APPJ est généré par rayonnement ionisant d’hélium ( Figure 1). Les cellules blessées par la privation de glucose sont traitées par 4 s et un débit de hélium s 8 à éliminer les effets de l’hélium sur les cellules. Tous les traitements doivent être effectuées en trois exemplaires.
5. Analyse de viabilité de cellules
Remarque : ne modifiez pas la moyenne dans cette étape.
- Après le traitement APPJ, incuber les cellules pendant 1 h dans un incubateur à cellules.
- Ajouter 10 µL de solution de comptage cellulaire Kit-8 (CCK-8) dans chaque puits.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 4 h.
Remarque : La lignée SH-SY5Y est sensible à la privation de glucose conditions 12. La viabilité des cellules diminue de près de 50 % après privation de glucose 1 h, qui est la condition de la viabilité cellulaire optimale pour les études de pharmacodynamie. CCK-8 n’a aucune cytotoxicité pour les cellules et les cellules sont incubées avec le réactif de CCK-8 pendant un autre 4 h dans des conditions de privation de glucose après traitement APPJ pour vérifier la viabilité des cellules. Après 8 h glucose privation et traitement APPJ, l’effet protecteur du APPJ était significativement réduite parce que la longue durée de la privation de glucose conduit à des dommages graves des cellules SH-SY5Y. Rien n’indiquait des cellules vivantes après 24h glucose privation 11. - , Mesurer l’absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques.
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Résultats
Les données sont exprimées comme la moyenne ± SD d’au moins trois expériences indépendantes. Résultats du groupe ont été analysés pour la variance à l’aide d’analyse de la variance. Toutes les analyses ont été réalisées à l’aide du logiciel d’analyse statistique prisme et p < 0,05 était le seuil de signification statistique.
La viabilité cellulaire a été mesurée après 4 h d’incubation de la CCK-8. Comme illustré à la Figure 3, la privation de glucose réduit la ...
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Discussion
Les cellules SH-SY5Y sont une lignée cellulaire humaine dérivée de neuroblastome et sont largement utilisés comme un modèle de cellule appropriée pour des études in vitro sur la neurotoxicité ou neuroprotection12. La lignée SH-SY5Y est sensible aux conditions de privation de glucose. La viabilité cellulaire a diminué de près de 50 % après privation de glucose 1 h, qui est la condition de la viabilité cellulaire optimal pour les études de pharmacodynamie. En outre, la CCK-8 réactif n’a auc...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêt ont été déclarés en ce qui concerne cet article.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Fonds d’Innovation de Beijing Neurosurgical Institute (2014-11), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos 11475019 et 81271286) et la Fondation des sciences naturelles de Pékin (n° 7152027).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lignée cellulaire SH-SY5Y | Chine Centre de culture de type Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 moyen | Thermo Scientific | 21875091 | stocké à 4 ° ; C |
| RPMI 1640 milieu sans glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stocké à 4 ° ; C |
| sérum de veau fœtal | Thermo Scientific | 16000044 | conservé à -20 ° ; C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stockée à 4 ° ; C |
| 96 puits plaque | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stocké à 4 ° ; C |
| lecteur de microplaques | Tecan | M200 Pro | pour la mesure de l’absorbance à 450 nm |
| Haute tension Amplificateur de puissance | Trek | PD06087 | pour l’amplification de la puissance |
| Fonction Générateur de signaux | MaZe Electronics Science& Technologie | AT30120 | pour fournir le signal spécifique |
| High &ndash ; Sonde de tension | Tektronix | P6015A | pour la détection de haute tension |
| Oscilloscope numérique | Tektronix | DPO4104B | pour l’affichage du signal |
Références
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Réimpressions et autorisations
