Method Article

À long terme direct Imaging Device pour meilleure Manipulation expérimentale des larves de poisson zèbre

DOI:

10.3791/56340

⸱

October 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui est un dispositif compartimenté destiné à orienter et à empêcher les larves de poisson zèbre. La conception permet la transection de la queue et à long terme collection d’images de microscopie de fluorescence à haute résolution de la cicatrisation et de régénération.

Abstract

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La larve de poisson-zèbre est un organisme modèle important pour la biologie du développement et de la cicatrisation des plaies. Par ailleurs, la larve de poisson-zèbre est un système utile pour l’imagerie microscopique direct haute résolution des phénomènes biologiques dynamiques dans l’espace et le temps avec résolution cellulaire. Toutefois, la méthode traditionnelle d’encapsulation d’agarose pour l’imagerie live peut entraver le développement larvaire et repousse des tissus. Par conséquent, ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui a été conçu et fabriqué comme un dispositif fonctionnellement compartimenté pour orienter les larves pour la microscopie à haute résolution tout en permettant transection de nageoire caudale au sein de l’appareil et le développement subséquent de queue sans retenue et le repousse. Ce dispositif permet de blesser et de l’imagerie à long terme tout en préservant la viabilité. Étant donné que le moule de zWEDGI est imprimé en 3D, les possibilités de personnalisation de ses géométries rendent facilement modifiables pour applications diverses poisson-zèbre. En outre, le zWEDGI offre de que nombreux avantages, tels que l’accès à la larve au cours de l’expérimentation pour blessure ou pour l’application de réactifs, parallèlement à l’orientation des larves multiples pour l’imagerie simplifiée et réutilisabilité de l’appareil.

Introduction

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La capacité de régénération des larves de poisson zèbre Danio rerio rendent un organisme modèle idéal pour examiner la réponse de la plaie ainsi que guérison et repousse1,2,3,4. Accès à un tableau de lignées transgéniques de poisson-zèbre et transparence d’anatomique du poisson-zèbre encore améliorer leur utilité pour les études in vivo de plaie réponse événements ainsi qu’à plus long terme du processus de régénération4. Étude de ces processus biologiques à l’aide de la microscopie en fluorescence Ti....

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Protocol

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Remarque : la conception de base de zWEDGI a été formulée pour les larves de poisson zèbre fécondation après 2 à 4 jours (dpf) et suivent les directives de l’Université du Wisconsin-Madison recherche animaux Resource Center.

1. conception et impression de moules 3D

  1. modèle le PDMS composant de l’appareil souhaité des géométries et des attributs dans un logiciel 5 de modélisation 3D. Créer un assembly d’un moule vide et la partie PDMS et générer un moule négatif pour la partie PDMS en créant une cavité dans le moule correspondant à la partie PDSM. Enregistrez le moule sous un fichier .stl pour l’impression....

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Results

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Le dispositif microfluidique de zWEDGI PDMS est un dispositif fonctionnellement compartimenté conçu pour accueillir quatre fonctions principales (listées ci-dessous) associées à l’imagerie live de nageoire caudale, blessant la guérison et la régénération chez les larves de poisson zèbre. PDMS a été choisi pour la fabrication de zWEDGI, parce qu’il n’est pas seulement facilement disponible et qu’un standard industriel pour la biocompatibilité, mais aussi fonctionne bien dans les moules. En.......

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Discussion

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L’objectif de l’appareil zWEDGI est de capturer le laps de temps 3D imaging en stabilisant et en orientant le poisson au sein de la petite distance de travail d’un objectif de microscope de haute résolution. Tout en répondant à ces spécifications de conception, c’est aussi une amélioration au cours de la préparation traditionnelle axée sur la gélose, imagerie live. Il y a trois étapes critiques (ci-dessous) dans la fabrication de la zWEDGI, qui, si ne pas fait correctement, peut entraîner des dispositifs défectueux :

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Les auteurs aimerait remercier financement de projets primaire de l’Institut Morgridge pour la recherche et le laboratoire d’optique et d’Instrumentation computationnelle. Nous remercions également le financement de NIH # R01GM102924 (AH et KWE). KH, JMS, RS, AH et KWE conçu et destiné à l’étude. KH et JMS exécuté toutes les expériences avec l’appui du DL, KP et RS. KH, JS, RS, AH et KWE a contribué à la rédaction du manuscrit.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fabricate moules
Solidworks Professional Accedemic Research Logiciel de modélisation 3DDassault SystemesSPX0117-01Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D Printer3D Systems Inc.23200-9023D Systems Inc.
Résine photopolymère Accura 603D Systems Inc.24075-9023D Systems Inc.
alcool dénaturéSunnyside5613735Menards
Appareil de post-polymérisationUV 3D Systems Inc.23363-101-00Systèmes 3D Inc.
TouchNTuff gants en nitrileAnsell92-600McMaster Carr
220B, 400B, 600 grain T414 papier de verre bleu-bak  ;Norton66261139359, 54, 52
MSC disque en verre borosilicaté, 2" de diamètreMcMaster-CarrMIL-G-47033McMaster-Carr
nettoyant à ultrasonsBranson1510R-MTH
alcool isopropylique à friction 70 %Hydrox54845T43McMaster-Carr
10oz gobelet en plastique transparentWNA Masterpiece557405Amazon
6"craft stickPerfect StixCraft WTD-500Amazon
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 kit élastomère de silicium  ;Adhésifs Dow-Corning4019862Ellworth
Seringue de 10 mlBecton Dickinson305219Vitality Medical Inc
dessiccateurBel-Art SciencewareF42027-0000Amazon
4 in cliquetclamp Pittsburgh68974Harbor Freight
four de laboratoireQuincy Lab Inc.20GCGlobal Ensemble
pinces à épilerindustrielles Aven549825McMaster-Carr
buse filtrée à air compriméInnotechTA-N2-2000FTCleanroom Supply
étau de bancWilton Tool Group63500MSC Industrial
55mm plat à fond en verre ; 30mm micro-puits #1.5 verre de couvertureCellvisD60-30-1.5-NCellvis
nettoyeur plasmaHarrick PlasmaPDC-001Harrick Plasma
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Loading Larves
Pipetteman, P200GilsonF123601
100 % éthanol (dilué à 70 % avec de l’eau avant utilisation)Pharmco-aaper111000200
Pipette de transfertFisherbrand13-711-5AFisher Scientific
écrémé en poudreMP Biomedicals
bidistillée
N-phénylthioruréeSigma-AldrichP7629Sigma-Aldrich
tricaïne (3-aminobenzoate d’éthyle)C-FINQ-UEWestern Chemical
agarose à bas point de fusionSigma-AldrichA0701Bloc chauffant Sigma-Aldrich
(incubateur à bain sec)Fisher Scientific11-718-2Fisher Scientific
E3 tampon  ;
pointe de pipette à grand orifice, 200 uLFisherbrand02-707-134Fisher Scientific
Pointe de pipette à usage général, 200 uLFisherbrand21-197-8EFisher Scientific
#15 lame de scalpel  ;Feather2976Amazon
25G seringue aiguilleBD  ;BD305122Fisher Scientific
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Imaging
inverted microscope
Imaris logiciel d’imagerieBitplane
, de lait 2902887 eau

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
  2. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H.

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Zebrafish LarvaeWound HealingLive ImagingPDMS Device3D PrintingMultiphoton MicroscopyCollagen Fiber AnalysisTissue RegrowthMicrofluidic ChannelsAgarose Encapsulation

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