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Article de méthode

Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques

7K vues

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DOI :

10.3791/56347

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20 janvier 2018

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1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

Dans cet article

Résumé

Une méthode pour obtenir nanopatterns inégale dendrimère-basé qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD) surface densité locale est décrite et appliquée pour l’étude de la différenciation cellulaire adhésion et chondrogéniques.

Résumé

Différenciation et adhésion cellulaire est conditionnée par la disposition de l’échelle nanométrique des composants de la matrice extracellulaire (MEC), avec des concentrations locales ayant un effet majeur. Nous présentons ici une méthode pour obtenir des nanopatterns inégales à grande échelle d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD)-fonctionnalisés dendrimères qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de RGD local grammage. Nanopatterns sont formés par adsorption en surface de dendrimères de solutions à différentes concentrations initiales et sont caractérisées par l’angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS), et scanning probe techniques de microscopie tels que microscopie à effet tunnel (STM) balayage et microscopie à force atomique (AFM). La densité de surface locale de RGD est mesurée en utilisant des images de l’AFM au moyen de cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec la différenciation et la réponse d’adhérence cellulaire. La méthode de structuration présentée ici est une procédure simple qui peut évoluer vers le haut d’une manière simple de grandes surfaces. Il est donc entièrement compatible avec les protocoles de culture de cellules et peut être appliqué aux autres ligands qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.

Introduction

Ici, nous décrivons une procédure simple et polyvalent basé sur dendrimère durcie pour obtenir des surfaces de culture de cellules qui permettent le contrôle des locaux de l’adhérence à l’échelle nanométrique. Nanoscale détails d’organisation de l’ECM ont été signalés,1,2,3 et la structuration de l’adhérence cellulaire a permis de mieux comprendre profondément les exigences cellulaires associés à adhérence4, 5. Expériences utilisant micellaire nanopatterns axée sur la lithographie a révélé un seuil à environ 70 nm pour nanospacing de peptide RGD, adhésion cellulaire retardée significativement supérieur à cette valeur6,7,8 ,9. Ces études ont aussi souligné le plus d’influence des locaux que la densité globale de ligand sur cell adhesion9,10,11.

Au cours de la morphogenèse, interactions cellulaires avec le milieu environnant déclenchent les premières manifestations de différenciation, qui continuent jusqu'à ce que les structures tissulaires complexe final ont été formés. Dans ce cadre, des surfaces de nanopatterned ont été utilisés pour lutter contre l’influence des interactions cellule-surface initiales sur la morphogenèse. Axée sur la lithographie RGD nanopatterns avec un espacement latéral de 68 nm en β-type Ti-40Nb alliages aident à maintenir le phénotype indifférencié de cellules de tige non engagés12, tandis que nanospacings RGD entre 95 et 150 nm améliorer la différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) vers adipocytaire/ostéogénique13,14,15 et chondrogéniques fates16. Auto-assemblage macromolécules modifiés avec signalisation composants montrent également, pour diriger l’adhésion cellulaire et la différenciation en fournissant nanométriques règlement architectural des indices signalisation17. À cet égard, la déposition de dendrimères avec interaction cellule moitiés dans leur sphère extérieure18,19,20 , sur des surfaces a été utilisée pour étudier les cellules adhérence21,22, morphologie23,24et migration des événements25,26. Néanmoins, l’absence de caractérisation de surface dans ces études rend difficile d’établir une quelconque corrélation entre dendrimère configuration surface et réponse de la cellule.

Dendrimère nanopatterns avec ordre de liquide et l’espacement défini peut être obtenue quand dendrimères s’adsorber sur les surfaces à faible charge de solutions avec faibles forces ioniques. 27 sur la base de cette propriété, nous présentons une méthode pour obtenir à grande échelle nanopatterns inégale des dendrimères fonctionnalisés RGD sur des surfaces très basse-chargées qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de masse surfacique RGD local. Angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS) et scanning probe microscopy techniques (STM et AFM nanopatterns) Voir la que la densité locale de ligand peut être ajustée en modifiant la concentration initiale dendrimère en solution. La densité de surface locale RGD est quantifiée des images de l’AFM en cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec des expériences de cellules. Par rapport aux autres techniques de structuration4, axée sur les dendrimère durcie est simple et peut être facilement transposé aux larges surfaces, étant donc entièrement compatible avec les applications de culture de cellules. Nanopatterns sont utilisés comme substrats bioactifs pour évaluer l’effet de la densité locale de surface RGD sur cell adhesion28 et sur l’induction chondrogéniques de l’adulte humain MSCs29. Nos résultats montrent que RGD dendrimère-basé nanopatterns soutenir la croissance des cellules et qu’adhésion cellulaire est renforcée par la forte densité de surface locale RGD. Dans les expériences de différenciation, intermédiaires de l’adhérence des cellules aux substrats favorisée condensation MSC et différenciation chondrogéniques précoce. Étant donné la facilité avec laquelle dendrimère groupes périphériques peuvent être modifiées, la méthode décrite ici peut être étendue aux autres ligands ECM qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.

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Protocole

1. préparation du substrat

  1. Recuit de 1,4 x 1,1 cm au (111) sur des substrats de Mica.
    1. Placez le substrat au (111) sur une plaque de cuisson en vitrocéramique et il recuire avec une flamme de butane pour 3 min. autoriser le substrat refroidir sous atmosphère d’argon. Répétez cette étape pour chaque substrat au (111).
      NOTE : Substrats au (111) doivent être utilisés immédiatement après le recuit.
  2. Préparation de Poly (acide L-lactique) (PLLA)-enduit des substrats de verre.
    1. Couper et laver les lames de verre.
      1. Découper des lames de microscope dans 18 diapositives de 1,25 x 1,25 cm avec un cutter pointe diamant. Faire une échancrure petite sur le côté inférieur de la lame, afin que les parties supérieures et inférieures peuvent être distingués par la suite.
      2. Laver soigneusement les lames avec de l’eau désionisée suivie d’éthanol à 96 %. Laissez-les sécher à l’air.
    2. Préparer la solution PLLA 2 %.
      1. Ajouter 200 mg de PLLA à 10 mL de 1, 4-dioxane dans un tube de pression. Ajouter une barre de remuer et bien refermer le tube.
      2. Placer le tube de pression dans un bain de glycérine sur une plaque chauffante à 60 ° C sous agitation douce pendant 24 h et ensuite transvaser la solution dans un flacon en verre de 15 mL.
    3. Revêtement des lames de verre avec la solution PLLA.
      1. Placez les lames de verre et la fiole avec la solution PLLA sur une plaque chauffante propre à 60 ° C. Assurez-vous de placer les lames vers le haut et leur permettre de rester pendant au moins 10 min atteindre la température nécessaire.
      2. Préparer la coucheuse spin et le programme spécifié dans le tableau 1.
      3. Un lieu de la face diapositives sur la coucheuse spin, à l’aide d’un système déprimogène. Avec une pipette Pasteur, appliquer 0,25 mL de la solution PLLA à la diapositive, en s’assurant que toute la surface est couverte. Exécutez le programme d’enduit. Répétez cette étape pour chaque diapositive.

2. dendrimère durcie

  1. Préparation des Solutions de 28 dendrimère RGD fonctionnalisés (RGD-Cys-D1).
    1. Dissoudre 5 mg de la dendrimère dans 6,494 mL d’eau désionisée. Il s’agit de solution A.
      Remarque : Utilisez dendrimère solution mère dans les 6 mois de préparation.
    2. Laisser agir la solution A pendant 10 min et préparer les solutions B et C après le tableau 2.
    3. Laisser agir la solution C pendant 10 min et préparer des solutions D, E et F suivant le tableau 2.
    4. Conserver les solutions B, C, D, E et F à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Solution A peut être stockée à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
  2. Durcie de dendrimères RGD-Cys-D1 sur les substrats
    1. Sous une hotte de culture tissulaire, stériliser les substrats en les irradiant avec lumière UV pendant 13 min.
      Remarque : Cette étape est nécessaire uniquement lorsque nanopatterned substrats vont servir de substrats de culture cellulaire. Dans ce cas, maintenir les conditions stériles (hotte de culture de tissus, matériel stérile, solutions et techniques) pour les étapes suivantes.
    2. Placer chaque substrat de face vers le haut dans les puits d’une plaque, manipuler avec soin avec des pincettes.
    3. Laisser agir pendant 10 min des solutions B, C, D, E et F.
    4. Passer les solutions de dendrimer RGD-Cys-D1 à travers un filtre de diamètre 0,22 µm en utilisant une seringue directement dans les puits contenant les substrats (2 mL/puits). Au moins trois répliques par dendrimère concentration sont recommandés. Fermer et sceller la plaque et laisser à température ambiante (RT) pendant 16 h.
    5. Retirez et jetez les solutions. Laver les substrats avec de l’eau désionisée stérile et sec. Magasin de substrats à 4 ° C.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.

3. préparation de substrats de contrôle

Remarque : Toutes les mesures ont été effectuées dans une hotte de vitroplants stérile et uniquement du matériel stérile, solutions et techniques ont été utilisées. Au moins, six contrôler substrats ont été utilisés (trois répliques du contrôle positif) et trois répliques de contrôle négatif.

  1. Sous une hotte de culture tissulaire, stériliser les substrats en les irradiant avec lumière UV pendant 13 min.
  2. Substrats de contrôle pour expérience adhésion des fibroblastes.
    1. Utilisez flamme-recuit au (111) substrats comme contrôle négatif. Or a un effet bien connu de protéine-dénaturation qui confère des propriétés adhésives anti-cellule28. Soniquer toutes les solutions et filtrer avant l’incubation du substrat.
    2. Pour les contrôles positifs, immerger le recuit à la flamme des substrats au (111) dans une solution de PEG RGD modifié thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glycol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 et triéthylène glycol mono-11-mercaptoundecyl éther (PEG-SH) dans un rapport molaire de 1 : 100 en éthanol à 96 % pendant 16 h à température ambiante.
    3. Laver soigneusement les substrats dans l’éthanol, puis séchez-les avec argon. Magasin de substrats à 4 ° C.
  3. Contrôle des substrats pour chondrogenèse.
    1. Utiliser des substrats PLLA vierges comme contrôle négatif. Sans traitement de surface, PLLA montre pauvre interfaçage avec les cellules vivantes. 31
    2. Pour les témoins positifs, préparer les 5 mL de la fibronectine 0,1 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber chaque substrat PLLA avec 1,6 mL de la solution de la fibronectine pendant 1 h à température ambiante.
    3. Retirer et jeter la solution de la fibronectine et laver les substrats avec du PBS. Magasin de substrats à 4 ° C.

4. surface caractérisation

  1. Imagerie de l’AFM
    1. Effectuer l’imagerie AFM de substrats PLLA pour une analyse de la rugosité. Étant donné que les dendrimères ont un diamètre de 4-5 nm, des valeurs de rugosité de 1 nm doit être obtenue pour la visualisation correcte de la nanopatterns. En outre, effectuer imagerie AFM de la nanopatterns. Dans les deux cas, effectuer l’AFM en tapant mode dans l’air.
    2. Sélectionnez un cantilever en silicone avec un ressort de constante k = 40 N/m et une fréquence de résonance ν = 300 kHz et montez-la sur l’équipement de l’AFM.
    3. Monter l’exemple sur la scène du microscope à force atomique. Selon la configuration de l’appareil, tuning et imagerie spécifications peuvent varier. Consulter le manuel du fabricant.
    4. Approcher l’échantillon avec la pointe du microscope jusqu’au contact.
    5. Pour l’image de PLLA pour l’analyse de la rugosité, sélectionnez au moins quatre zones représentatives de 20 x 20 µm par substrat dans trois substrats indépendants. Dendrimère nanopatterns l’image, choisissez au moins trois images représentatives de 5 × 5 µm par substrat de trois substrats indépendants par État (concentration initiale dendrimère dans la solution). Pour éviter d’endommager la couche dendrimère tout en imagerie, réglez la valeur de consigne pour maintenir la force à un minimum.
      Remarque : Le choix de la zone d’imagerie dépend aussi la plage de travail du scanner piézoélectrique. Veuillez consulter le manuel de l’instrument à cet égard.
    6. Processus des images en ajustant la hauteur de l’AFM chaque scan line à polynôme nivellement des fonctions en utilisant le logiciel du fabricant de l’appareil de l’AFM et d’analyser ceux de PLLA pour calculer la rugosité de surface. Moyenne-racine carrée (RMS) analyse peut fournir une option appropriée.
  2. Mesure de masse surfacique RGD local.
    1. Obtenir les seuils d’image des images AFM hauteur transformés pour sélectionner les dendrimères sur la surface.
    2. Déterminer la position de la particule à l’aide d’une logiciel de traitement d’image et utilisez-les pour obtenir les distances minimales entre (dmin).
    3. Tracer les valeursmin den z pour les positions de particule correspondante pour obtenir les cartes de contour de probabilité pour dmin. Ajuster l’échelle colorimétrique de l’intrigue de visualiser les régions de plus haute densité superficielle de RGD locale (dmin < 70 nm).
    4. Quantifier la superficie des régions avec la plus forte densité surface à local RGD en utilisant une logiciel de traitement d’image. Portent sur les domaines des agrégats dendrimère dans le calcul.
  3. Imagerie de la STM.
    Remarque : L’imagerie STM peut être effectuée que pour nanopatterns sur des substrats conducteurs au (111). Mesures sont effectuées dans l’air.
    1. Placer le substrat de nanopatterned dans le porte-échantillon de l’équipement de la STM. Vérifiez la connexion électrique entre l’échantillon et titulaire avec un testeur.
    2. Etch une astuce du matériau sélectionné sonde (i.e. PT 0,8 : Ir 0,2) avec un diamètre qui assure le bon ajustement sur la tête de l’équipement de la STM. La gravure peut être effectuée soit par découpe manuelle ou par gravure électrochimique. 32
      Remarque : La gravure électrochimique rend plus symétrique de conseils.
    3. Monter l’embout dans la tête de l’équipement de la STM et connecter l’échantillon.
    4. Régler le « courant » dans la voie de retour (dans ce type de mesure, actuelle sera constante par le réglage de vos commentaires). Régler la tension de polarisation et l’actuel point de consigne et la taille de scan pour obtenir une image bien résolue une fois que l’extrémité est insérée.
      Remarque : Le choix de la zone d’imagerie dépend aussi la plage de travail du scanner piézoélectrique. Veuillez consulter le manuel de l’instrument à cet égard.
    5. Processus les images topographiques STM en ajustant chaque ligne de numérisation au nivellement polynomiale fonctionne en utilisant le logiciel du fabricant de l’appareil de la STM.
  4. Mesures de CA.
    1. Mesure CA sur les nanopatterned des substrats par la méthode de la goutte sessile à trois positions différentes sur trois substrats indépendants par État (concentration initiale dendrimère en solution) avec un système optique de CA.
    2. Remplir la microseringue avec de l’eau désionisée et réglez les paramètres dans le logiciel CA pour produire des gouttes de 1 µL.
    3. Placez l’échantillon sur la scène afin que la surface de l’échantillon est clairement visible sur l’ordinateur pour l’imagerie.
    4. Placez la seringue avec le micromanipulateur jusqu'à ce qu’il se rapproche de la surface et déposer la goutte dans la surface. Enregistrer l’image immédiatement après la stabilisation de la gouttelette.
      Remarque : Dans les mesures de CA, il est très important de contrôler l’humidité afin d’obtenir des résultats reproductibles.
    5. Analyser le tas mesuré avec le logiciel du fabricant de l’appareil CA. La méthode de lissage peut être ajustée aux besoins des utilisateurs. La méthode de lissage elliptique peut être une option.

5. Culture cellulaire

Remarque : Toutes les mesures ont été effectuées dans une hotte de culture de tissus et uniquement du matériel stérile, des solutions et techniques ont été utilisées.

  1. Expérience d’adhérence des fibroblastes.
    1. La culture de fibroblastes embryonnaires de souris 3 t 3 NIH de premiers passages (< 10) à 37 ° C et 4,6 % CO2 atmosphère dans le milieu de base avec une forte concentration de glucose additionnée de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % L-glutamine, pyruvate de sodium pénicilline-streptomycine et 1 % 1 % (croissance moyenne). T75 flacons pour un ensemencement total de 500 000 cellules par flacon de 10 mL de milieu de croissance sont recommandés.
    2. Éliminer le vieux milieu avec une pipette 10 mL tous les 2 jours et remplacer par 10 mL de milieu de croissance fraîchement préparée.
    3. Cellules en culture dans le milieu de croissance jusqu'à ce qu’ils atteignent près de 80 % de confluence, puis enlevez le milieu et ajoutant 5 mL de trypsine par flacon. Afin d’assurer le détachement cellulaire appropriée du fond de la fiole, maintenir la solution de trypsine en contact avec les cellules pendant 5 min à 37 ° C.
    4. Ajouter 5 mL de milieu de culture par flacon et recueillir les cellules dans un tube à centrifuger. Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de croissance. Déterminer la concentration de cellules utilisant un hémocytomètre.
    5. Transférer les substrats bien en plaques non traitées pour culture de tissus (non adhérents).
    6. Les cellules sur les substrats à une densité de 4 000 cellules/cm2 dans le milieu des semences et les incuber pendant 4,5 heures à 37 ° C et 10 % CO2 atmosphère.
  2. Chondrogéniques Induction de MSCs.
    1. La culture humaines MSCs de passages au début (< 5) à 37 ° C et 4,6 % CO2 atmosphère dans le milieu de croissance de MSC. T75 flacons pour un ensemencement total de 500 000 cellules par flacon de 10 mL de milieu de croissance sont recommandés.
    2. Changer de support tous les 3 jours (voir 5.1.2).
    3. Trypsinize cellules avant la confluence de 80 % est atteint et centrifuger et remettre en suspension dans un milieu de croissance de MSC (tel que décrit au point 5.1.3). Déterminer la concentration de cellules utilisant un hémocytomètre.
    4. Centrifuger les cellules à nouveau et leur resuspendre dans 10 mL de milieu induisant chondrogenèse.
    5. Transférer les substrats des plaques aux nouvelles plaques bien ne pas traitées pour la culture de tissus (non adhérents). Les semences des cellules sur les substrats à une densité de 3 000 cellules/cm2.
    6. Changer le support de chondrogéniques tous les 3 jours (voir 5.1.2).

6. Fixation et immunomarquage des cellules

Remarque : Les étapes suivantes peuvent être effectuées dans des conditions non stériles.

  1. Retirez le support et laver les cellules doucement avec du PBS. Fixez-les en ajoutant une solution de formol à 10 % pendant 20 min à température ambiante.
  2. Retirez le formol et laver les cellules avec du PBS.
  3. Bloquer les groupes aldéhyde libre en ajoutant une solution de 50 mM de chlorure d’ammonium (NH4Cl) dans du PBS. Laissez les cellules pendant 20 min à RT. supprimer NH4Cl solution et laver les cellules avec du PBS.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C.
  4. Retirez les PBS et permeabilize des cellules en ajoutant une solution à 0,1 % de saponine dans la solution de saturation (1 % d’albumine dans du PBS) pendant 10 min à RT. Wash les cellules avec du PBS et transférer les échantillons à une nouvelle plaque bien.
  5. Incuber les cellules avec une solution d’anticorps primaires dans la solution de saturation (tableau 3) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, enlever la solution de l’anticorps primaire et laver les cellules avec du PBS.
  6. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires dans la solution de saturation (tableau 3) pendant 1 h à température ambiante.
    NOTE : Éviter la lumière l’exposition.
  7. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et laver les cellules avec du PBS et sec.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Stocker les échantillons dans du PBS à 4 ° C dans l’obscurité.
  8. Montage d’échantillon pour l’observation de microscope : à l’aide d’un cutter pointe diamant, couper des lamelles couvre-objet en distribuer 50 µL de 1,25 cm x 1,25 cm. de microscopie moyen sur les échantillons de montage et recouvrir délicatement avec les lamelles coupées.
  9. Transférer les échantillons à un destinataire commode, couvrez-la de papier d’aluminium et magasin dans l’obscurité à 4 ° C jusqu’en observation.

7. cellule d’imagerie et d’analyse des données

Remarque : Pour substrats d’axée sur les micro-lames épais et opaque au (111), un microscope vertical doit être utilisé.

  1. Expérience d’adhérence des fibroblastes.
    1. Utiliser un microscope à épifluorescence équipé d’un appareil photo numérique et la basse (X 10) et le grossissement élevé (c'est-à-dire 40 X) objectifs. Effectuer des mesures dans l’air.
    2. Placer l’échantillon sur les noyaux des cellules de la scène et image avec l’objectif de 10 X à l’aide d’une excitation UV, filtre d’émission longpass visualiser la tache de Hoechst/DAPI.
    3. Cytosquelette des cellules image et adhérences focales (FAs) avec l’objectif X 40, en sélectionnant le filtre microscope correspondant aux particularités du fluorochrome anticorps.
    4. Pour la quantification de la FA, utilisez un logiciel de traitement d’images pour convertir les images 8 bits. Supprimer les images de fond et de convertir en binaire en définissant un seuil. Calculer au moins 30 images par échantillon et envisager des FAs de 1 µm2 pour le calcul.
  2. Chondrogéniques Induction de MSCs.
    1. Image des condensats de la cellule aux stades initiaux de l’induction chondrogéniques (< 5 jours) avec un microscope à épifluorescence vertical équipé d’un appareil photo numérique et un plus bas (c'est-à-dire 10 X) objectif de grossissement. Filtre d’émission ultraviolet excitation et longpass permet de visualiser la tache de Hoechst/DAPI.
    2. Pour mesurer les superficies de condensat, utiliser un logiciel de traitement d’image, convertir les images 8 bits, supprimer l’arrière-plan et sélectionnez un seuil qui met en valeur le contour global. Calculer la surface des particules.
    3. Échantillons d’image immunocolorées pour SAF, fibres d’actine cytosquelette et spécifique du cartilage collagène type II alpha 1 (COL2A1) avec un microscope confocal vertical à fort grossissement (c'est-à-dire 40-60 X). Recueillir des sections à un intervalle représentant (soit 0,5 à 1 µm).
    4. Pour traiter la pile, utilisez une logiciel de traitement d’image. Convertir les images 8 bits, supprimer le fond et les rendre binaire en définissant un seuil. Traiter un minimum de trois condensats cellulaire par la condition de trois échantillons indépendants.
    5. Quantifier la protéine FA colorée des secteurs de la zone basale des condensats de la cellule et les exprimer en pourcentage correspondant de zone divisée par le nombre de noyaux de cellules dans l’image.
    6. Pour mesurer la coloration COL2A1, utiliser confocal z-projections et quantifier la somme de la surface projetée (superficie maximale de COL2A1 par exemple). Normaliser la valeur de la zone obtenue contre la zone de l’eau de condensation correspondante.

8. quantitative Reverse Transcription-polymérase Chain Reaction (qRT-PCR) analyse

Remarque : Pour empêcher la contamination de la RNase, utiliser la vaisselle en plastique jetable, stérile et porter des gants jetables lors de la manipulation des réactifs et l’ARN. Toujours utiliser des techniques aseptiques microbiologiques appropriés et utiliser une solution de décontamination appropriée pour éliminer la contamination de RNase de surfaces de travail et des articles réutilisables tels que les centrifugeuses et les pipettes.

  1. Isoler l’ARN total et il pulvérise dans un disrupteur RNA. Traiter des échantillons d’ARN à la DNase et convertissez-les en utilisant un kit de synthèse de cDNA de cDNA.
  2. Conduite qRT-PCR en utilisant des amorces pour le facteur de transcription SOX9. Bêta-2-microglobuline (B2M) et protéine ribosomique L13a (RPL13a) peut être utilisé comme gènes domestiques.
  3. Calculer les niveaux d’expression et normaliser contre le contrôle négatif (PLLA).

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Résultats

Nous présentons une méthode de structuration qui permet l’adhérence de surface à traiter à l’échelle nanométrique (Figure 1). La structure chimique de la RGD-Cys-D1 est montrée dans la Figure 1 a. Dendrimères ont été modelés sur des surfaces conductrices électriques d’au (111) pour la haute résolution de caractérisation de la STM. Dendrimère faible concentration en solution (jusqu'à 10-5% w/w) a rendu des dend...

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Discussion

Lors de l’élaboration du protocole décrit, on envisagera un certain nombre d’étapes critiques. Le premier se réfère à la caractérisation de nanostructures avec techniques de microscopie de sonde à balayage. Pour visualiser la nanopatterns, la surface où la structuration est produite doit avoir une valeur de rugosité au-dessous du diamètre moyen des dendrimères, qui est d’environ 4 à 5 nm tel que mesuré par la STM (Figure 1 b). En outre, il devrait tenir compte du fait que l’imagerie haute résolution STM ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent Oriol Font-Bach et Albert G. Castaño pour leur aide dans la quantificationmin d. Ils reconnaissent également l’unité de microscopie numérique avancé à l’Institut de recherche en biomédecine (IRB Barcelona) pour laisser les auteurs à enregistrer la vidéo dans leurs locaux. Ce travail a été soutenu par le réseautage Biomedical Research Centre (CIBER), Espagne. CIBER est qu'une initiative financée par le VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programme de Consolider, CIBER Actions et l’Instituto de Salud Carlos III, avec le soutien du Fonds européen de développement régional. Ce travail a été soutenu par le Conseil des universités et de la Ministère de l’Innovation, des universités et entreprises de la Generalitat de Catalunya (2014 SGR / 1442). Il a également été financée par les projets OLIGOCODES (no. MAT2012-38573-C02) et CTQ2013-41339-P, décerné par le ministère espagnol de l’économie et la compétitivité, en outre à INTERREG V-A Espagne-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). La CRP reconnaît le soutien financier de la subvention espagnole du ministère de l’économie et la compétitivité (no IFI15/00151).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Or (111) sur mica. 1,4x1,1 cm  ;Spi Supplies466PS-AB
Microlames en verre, ordinaireCorning2947-75x25
Eau déminéraliséeMillipore18M&Omega ; cm
Éthanol 96 %PanReac131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymèreCorbion95/05 rapport molaire
1,4 - dioxaneSigma-Aldrich296309-1L
Huile de silicone, haute températureAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Hotte à flux laminaire pour la culture tissulaireTelstarBio II AdvanceEnceinte de sécurité biologique Classe II
Unité de filtrationMillex-GPSLGP033RB0.22 µ ; m
Seringue 10 mLDiscardit309110
Microscope à force atomiqueVeeco InstrumentsDimension 3000 Instrument
Sondes AFM en siliciumBudget SensorsTap300AI-GRésonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Microscope à effet tunnelImagerie moléculaire MicroscopePicoSPM
Pt0.8 :Ir0.2 filAdventPT671012Diamètre 0,25 mm
Logiciel WSxM 4.0Nanotec electronica Système d’angle
contact optique (CA)Dataphysics
Logiciel SCA20Dataphysics
Spectromètre photoélectron à rayons XÉlectronique physiquePerkin-Elmer PHI 5500 Système
Fibronectine à partir de plasma bovinSigma-AldrichF1141-1MGSolution de 1,0 mL
Tampon de phosphate salin de Dulbecco (DPBS)Gibco21600-10Poudre
Fibroblastes d’embryons de sourisATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) liquide à haute teneur en glucoseGibco11960044liquide à haute teneur en glucose, sans glutamine, 500 mL
de sérum de veau fœtal (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutamineInvitrogen25030200 mM (100X)
Pénicilline-streptomycineInvitrogen15140
Pyruvate de sodiumInvitrogen11360039100 mL
T75 Fioles de cultureNunclon156499
TrypsinLife Technologies252000720,25 % EDTA
CentrifugeuseHermle LabortechnikZ 206 A
Plaque non traitée pour la culture tissulaire, 12 puitsFalcon351143dérivées
du tissu adipeuxATCCATCC PCS-500-011Flacon de cellule 1 mL
MSC milieu basalATCCATCC PCS-500-030
Kit de croissance MSCATCCATCC PCS-500-040Sérum faible
Outil de différenciation des chondrocytesATCC ATCCPCS-500-051
Solution de formolSigma-AldrichHT5011-15MLtamponnée neutre, 10 %
chlorure d’ammoniumSigma-AldrichA9434-500Gpour la biologie moléculaire, adaptée à la culture cellulaire, &ge ; 99,5 %
SaponineSigma-Aldrich47036-50G-Fpour la biologie moléculaire, utilisée comme tensioactif non ionique, adjuvant
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Monoclonal de lapin [Y113] anticorps anti-paxillineAbcamab32084Dilué 1:200
Monoclonal de souris [1F5] chaîne alpha-1 XX anti-collagène  ;Anticorps AcrisAM00212PU-Ndilués : 1:400
Alexa Fluor 488 Anticorps secondaire de chèvre conjugué contre les IgG (H+L)InvitrogenA106672 mg/mL. Anticorps secondaire Dilué 1:1000
Alexa Fluor 568 conjugué de chèvre anti-IgG (H+L)InvitrogenA110362 mg/mL. Dilué 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Verre de protection dilué 1:1000
24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Microscope droit Nikon Eclipse E1000avec caméra CCD
Microscope confocalLeica MicrosystemsLeica SPE Microscope confocal droit
ImageJ 1.50g freeware
logiciel MATLABLe logiciel MATHWORKS, Inc.
Logiciel OriginPro 8.5Coorporation
AFM de multitechnique HMSC non adhérentes Microscope à épifluorescence http://imgej.nih.gov/ij OriginLab

Références

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