Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques

Résumé

Une méthode pour obtenir nanopatterns inégale dendrimère-basé qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD) surface densité locale est décrite et appliquée pour l’étude de la différenciation cellulaire adhésion et chondrogéniques.

Résumé

Différenciation et adhésion cellulaire est conditionnée par la disposition de l’échelle nanométrique des composants de la matrice extracellulaire (MEC), avec des concentrations locales ayant un effet majeur. Nous présentons ici une méthode pour obtenir des nanopatterns inégales à grande échelle d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD)-fonctionnalisés dendrimères qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de RGD local grammage. Nanopatterns sont formés par adsorption en surface de dendrimères de solutions à différentes concentrations initiales et sont caractérisées par l’angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS), et scanning probe techniques de microscopie tels que microscopie à effet tunnel (STM) balayage et microscopie à force atomique (AFM). La densité de surface locale de RGD est mesurée en utilisant des images de l’AFM au moyen de cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec la différenciation et la réponse d’adhérence cellulaire. La méthode de structuration présentée ici est une procédure simple qui peut évoluer vers le haut d’une manière simple de grandes surfaces. Il est donc entièrement compatible avec les protocoles de culture de cellules et peut être appliqué aux autres ligands qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.

Introduction

Ici, nous décrivons une procédure simple et polyvalent basé sur dendrimère durcie pour obtenir des surfaces de culture de cellules qui permettent le contrôle des locaux de l’adhérence à l’échelle nanométrique. Nanoscale détails d’organisation de l’ECM ont été signalés,^1,2,3 et la structuration de l’adhérence cellulaire a permis de mieux comprendre profondément les exigences cellulaires associés à adhérence^{4, 5}. Expériences utilisant micellaire nanopatterns axée sur la lithographie a révélé un seuil à environ 70 nm po....

Protocole

1. préparation du substrat

1. Recuit de 1,4 x 1,1 cm au (111) sur des substrats de Mica.
   1. Placez le substrat au (111) sur une plaque de cuisson en vitrocéramique et il recuire avec une flamme de butane pour 3 min. autoriser le substrat refroidir sous atmosphère d’argon. Répétez cette étape pour chaque substrat au (111).
      NOTE : Substrats au (111) doivent être utilisés immédiatement après le recuit.
2. Préparation de Poly (acide L-lactique) (PLLA)-enduit des substrats de verre.
   1. Couper et laver les lames de verre.
      1. Découper des lames de microscope dans 18 diapositives de 1,25 x 1,....

Résultats

Nous présentons une méthode de structuration qui permet l’adhérence de surface à traiter à l’échelle nanométrique (Figure 1). La structure chimique de la RGD-Cys-D1 est montrée dans la Figure 1 a. Dendrimères ont été modelés sur des surfaces conductrices électriques d’au (111) pour la haute résolution de caractérisation de la STM. Dendrimère faible concentration en solution (jusqu'à 10^-5% w/w) a rendu des dend.......

Discussion

Lors de l’élaboration du protocole décrit, on envisagera un certain nombre d’étapes critiques. Le premier se réfère à la caractérisation de nanostructures avec techniques de microscopie de sonde à balayage. Pour visualiser la nanopatterns, la surface où la structuration est produite doit avoir une valeur de rugosité au-dessous du diamètre moyen des dendrimères, qui est d’environ 4 à 5 nm tel que mesuré par la STM (Figure 1 b). En outre, il devrait tenir compte du fait que l’imagerie haute résolution STM .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Or (111) sur mica. 1,4x1,1 cm  ;	Spi Supplies	466PS-AB
Microlames en verre, ordinaire	Corning	2947-75x25
Eau déminéralisée	Millipore		18M&Omega ; cm
Éthanol 96 %	PanReac	131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymère	Corbion		95/05 rapport molaire
1,4 - dioxane	Sigma-Aldrich	296309-1L
Huile de silicone, haute température	Acros Organics	174665000
Spinner	Laurell	WS-650MZ-23NPP/Lite
Hotte à flux laminaire pour la culture tissulaire	Telstar	Bio II Advance	Enceinte de sécurité biologique Classe II
Unité de filtration	Millex-GP	SLGP033RB	0.22 µ ; m
Seringue 10 mL	Discardit	309110
Microscope à force atomique	Veeco Instruments	Dimension 3000 Instrument
Sondes AFM en silicium	Budget Sensors	Tap300AI-G	Résonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Microscope à effet tunnel	Imagerie moléculaire Microscope		PicoSPM
Pt0.8 :Ir0.2 fil	Advent	PT671012	Diamètre 0,25 mm
Logiciel WSxM 4.0	Nanotec electronica Système d’angle
contact optique (CA)	Dataphysics
Logiciel SCA20	Dataphysics
Spectromètre photoélectron à rayons X	Électronique physique	Perkin-Elmer PHI 5500 Système
Fibronectine à partir de plasma bovin	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	Solution de 1,0 mL
Tampon de phosphate salin de Dulbecco (DPBS)	Gibco	21600-10	Poudre
Fibroblastes d’embryons de souris	ATCC	ATCC CRL-1658	NIH/3T3
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) liquide à haute teneur en glucose	Gibco	11960044	liquide à haute teneur en glucose, sans glutamine, 500 mL
de sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	16000044	500 mL
L-Glutamine	Invitrogen	25030	200 mM (100X)
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15140
Pyruvate de sodium	Invitrogen	11360039	100 mL
T75 Fioles de culture	Nunclon	156499
Trypsin	Life Technologies	25200072	0,25 % EDTA
Centrifugeuse	Hermle Labortechnik	Z 206 A
Plaque non traitée pour la culture tissulaire, 12 puits	Falcon	351143	dérivées
du tissu adipeux	ATCC	ATCC PCS-500-011	Flacon de cellule 1 mL
MSC milieu basal	ATCC	ATCC PCS-500-030
Kit de croissance MSC	ATCC	ATCC PCS-500-040	Sérum faible
Outil de différenciation des chondrocytes	ATCC ATCC	PCS-500-051
Solution de formol	Sigma-Aldrich	HT5011-15ML	tamponnée neutre, 10 %
chlorure d’ammonium	Sigma-Aldrich	A9434-500G	pour la biologie moléculaire, adaptée à la culture cellulaire, &ge ; 99,5 %
Saponine	Sigma-Aldrich	47036-50G-F	pour la biologie moléculaire, utilisée comme tensioactif non ionique, adjuvant
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-50G
Monoclonal de lapin [Y113] anticorps anti-paxilline	Abcam	ab32084	Dilué 1:200
Monoclonal de souris [1F5] chaîne alpha-1 XX anti-collagène  ;	Anticorps Acris	AM00212PU-N	dilués : 1:400
Alexa Fluor 488 Anticorps secondaire de chèvre conjugué contre les IgG (H+L)	Invitrogen	A10667	2 mg/mL. Anticorps secondaire Dilué 1:1000
Alexa Fluor 568 conjugué de chèvre anti-IgG (H+L)	Invitrogen	A11036	2 mg/mL. Dilué 1:1000
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570 10ML	10 mg/mL. Verre de protection dilué 1:1000
24x24 mm	Deltalab	D102424
Fluoromount	Sigma-Aldrich	F4680-25ML
		Microscope droit Nikon Eclipse E1000	avec caméra CCD
Microscope confocal	Leica Microsystems		Leica SPE Microscope confocal droit
ImageJ 1.50g freeware
logiciel MATLAB	Le logiciel MATHWORKS, Inc.
Logiciel OriginPro 8.5	Coorporation

AFM de multitechnique HMSC non adhérentes Microscope à épifluorescence http://imgej.nih.gov/ij OriginLab