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Purification de l’ADN Viral pour l’Identification des protéines virus et cellulaires associées

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DOI :

10.3791/56374

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31 août 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le but du présent protocole est de marquer spécifiquement et sélectivement isoler l’ADN virale des cellules infectées pour la caractérisation des protéines de génome viral lié.

Résumé

Le but du présent protocole est d’isoler le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) ADN provenant de cellules infectées pour l’identification des associés virale et cellulaires protéines par spectrométrie de masse. Bien que les protéines qui interagissent avec les génomes viraux jouent un rôle important en déterminant les résultats de l’infection, une analyse complète des protéines de génome viral lié n’était pas précédemment possible. Nous démontrons une méthode qui permet la purification directe de HSV-1 génomes de cellules infectées. Réplication de l’ADN viral est sélectivement marquée avec des nucléotides modifiés contenant un groupe fonctionnel d’alcyne. DNA marqué est ensuite plus précisément et de manière irréversible tag via la fixation covalente d’azoture de biotine par l’intermédiaire de cuivre (I)-réaction de cycloaddition ou clic azoture-alcyne catalysée par. Biotine-tag ADN est purifiée sur perles streptavidine et protéines associées sont éluées et identifiés par spectrométrie de masse. Cette méthode permet le ciblage sélectif et l’isolement des fourches de réplication de HSV-1 ou des génomes entiers de milieux biologiques complexes. Par ailleurs, l’adaptation de cette approche permettra d’enquête sur les divers aspects de l’infection baculoviraux, ainsi que l’examen des génomes d’autres virus à ADN.

Introduction

Les virus ont une capacité limitée à remplir les fonctions essentielles et dépendent donc de facteurs de l’hôte pour faciliter les aspects critiques de l’infection, y compris le transport, la réplication, réparation, recombinaison et expression des gènes viraux. Les activités de ces facteurs de l’hôte sont souvent complétées par protéines virale. En outre, virus doivent éviter de détection et brouillage de la réponse cellulaire à l’infection virale. Par conséquent, interactions hôte virus dictent l’issue de l’infection. D’une importance primordiale est de comprendre comment les virus modifient l’environnement cellulaire afin d’adapter la machinerie cellulaire pour faciliter les processus viraux. Particulièrement intéressant est d’identifier quels facteurs et processus, agissent sur les génomes viraux durant tout le cycle infectieux.

Le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) est qu'un double stranded DNA virus qui infecte une proportion importante de la population humaine. Dans la première heure de l’infection, le génome viral pénètre dans le noyau, où une cascade ordonnée de l’expression des gènes viraux s’ensuit en coordination avec virale de réplication de l’ADN (vDNA)1. Dans le noyau, génomes sont soumis à régulation épigénétique, subir une réparation et recombinaison et sont emballés dans des capsides, telle que les virions de descendance premiers sont produites au sein de moins de six heures. L’évaluation complète des protéines de génome viral associé tout au long de l’évolution de l’infection jettera les bases pour étudier les détails moléculaires des processus qui agissent sur les génomes viraux et permettent de mieux comprendre quels facteurs viraux et cellulaires participent à divers stades de l’infection.

Les méthodes précédentes pour l’étude des facteurs impliqués dans l’infection virale de l’hôte incluent purification d’affinité des protéines virales pour l’analyse des protéines cellulaires associées2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. ces tests ont joué pour l’identification des facteurs cellulaires impliqués dans les réponses antivirales de l’hôte, mais aussi modification de la chromatine virale, l’expression des gènes, et réparation de l’ADN. Toutefois, il est difficile de vérifier si les interactions dépendent de la liaison avec vDNA, et protéomique seulement permettent de mieux comprendre les interactions qui se produisent en fonction d’un facteur viral spécifique. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a été utilisée pour identifier où les protéines virus et cellulaires spécifiques se lient à des génomes viraux10,11,12,13,14 , 15 et hybridation in situ fluorescente (FISH) combinée à l’immunocytochimie a permis la visualisation des facteurs cellulaires qui sont colocalisées avec vDNA16,17,18, 19 , 20. ces tests permettent une analyse spatiale et temporelle. Cependant, les limitations incluent la nécessité d’anticorps hautement spécifiques, sensibilité limitée et la nécessité pour le précédent aperçu interactions hôte virus. Nous avons donc mis au point une méthode basée sur iPOND (isolement des protéines sur l’ADN naissante)21 et aniPOND (iPOND native accélérée)22 à étiqueter de manière sélective et purifier vDNA de cellules pour l’identification non biaisée du génome viral infectées protéines associées par spectrométrie de masse. iPOND a joué un rôle déterminant pour l’investigation de la fourche de réplication cellulaire dynamique.

Pour l’épuration sélective des génomes viraux provenant de cellules infectées, reproduisant vDNA est étiqueté avec éthynyl modifiée nucléosides, 5-éthynyl-2´-déoxyuridine (EdU) ou 5-éthynyl-2´-désoxycytidine (EdC) (Figure 1), suivie par liaisons covalentes conjugaison de l’azoture de biotine par clic chimie pour faciliter la purification de la seule étape de génomes viraux et des protéines associées sur streptavidine perles (Figure 2 b). Ce qui est important, les infections sont réalisées dans des cellules fixes qui ne sont pas engagés dans la réplication de l’ADN cellulaire pour permettre un étiquetage spécifique de vDNA. En outre, infection par HSV-1 provoque l’arrêt du cycle cellulaire et inhibe la cellular DNA réplication23,24. Virus peut être prémarquées avant l’infection pour l’analyse des protéines associées aux génomes viraux entrants (Figure 1 a) ou marqués au cours de la réplication de l’ADN pour l’analyse de protéines nouvellement synthétisée vDNA (Figure 1 b) 25. en outre, pulse chase analyse peut être utilisée pour étudier la nature des protéines associées à la réplication virale fourches (Figure 1)26. En outre, éthynyl-modified vDNA peut être conjugué de façon covalente à un fluorophore pour l’exploration spatiale de la dynamique des protéines (Figure 2 et Figure 3). L’imagerie permet la visualisation directe de vDNA et est une approche gratuite pour la validation des interactions protéine-vDNA peut être adapté pour assurer le suivi des génomes viraux tout au long de l’infection. Nous prévoyons que ces approches pourraient être modifiées ultérieurement pour étudier n’importe quel aspect d’infection baculoviraux, y compris le temps de latence et de réactivation et d’étudier d’autres virus à ADN. En outre, marquage avec l’uridine 5-éthynyle (UE) pourrait permettre pour l’analyse des génomes viraux RNA.

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Protocole

1. Culture cellulaire, Infection virale et EdC Labeling ( Figure 1)

le protocole suivant implique l’utilisation de virus. Veuillez vous référer à votre établissement ' protocoles de biosécurité s concernant la manipulation sécuritaire des virus et autres agents biologiques. Ce protocole a été approuvé par la Commission de révision institutionnelle de l’Université de Pittsburgh.

  1. Trypsinize une fiole de vitroplants confluentes 150 cm 2 de MRC-5 cellules et les cellules de transfert à une plaque de culture de tissu de 2 600 cm contenant 100 mL DMEM majoré de 10 % FBS. Incuber à 37 ° C en présence de 5 % de CO 2 pendant 3-4 jours atteindre la phase stationnaire et confluency. Un plat de 2 cm 600 confluentes contient environ 7 x 10 7 cellules. Préparer 1 assiette pour chaque condition et 1 assiette pour chaque contrôle négatif correspondant.
    Remarque : Les cellules doivent parvenir à la phase stationnaire pour inhiber la réplication de l’ADN cellulaire pour s’assurer que seul vDNA est étiqueté et purifié dans les étapes suivantes.
    Remarque : Chaque échantillon nécessite un gratuit non témoin négatif établi en utilisant les mêmes conditions d’infection et le point dans le temps sans l’ajout de l’ECD.
    NOTE : A revus à la baisse la version de cette expérience devrait se faire en tandem pour tester pour l’étiquetage de l’ADN cellulaire par imagerie à l’aide de la croissance des cellules comparables, infection, EdC, des conditions d’étiquetage et de points de temps (voir étape 2).
  2. Diluer 7 x 10 8 PFU HSV-1 à 7 mL froide Solution Saline (SCT). Retirez le milieu de croissance et à 37 ° C. Pour infecter, ajouter le virus dilué de 7 mL cellules MRC-5 et le rock pendant 1 h à température ambiante. Après adsorption, retirer inoculum, rincer avec la température de la pièce 50 mL du SCT et remplacer le milieu de croissance initiale. Incuber à 37 ° C en présence de 5 % de CO 2. Cette étape devrait être effectuée pour chaque condition expérimentale et un témoin négatif.
    NOTE : Étiquetage d’EdC accrue peut être réalisé à l’aide de HSV-1 mutants déficients pour l’expression de la dUTPase virale (gène UL50) et/ou l’uracile glycosylase (gène AMT2). HSV-1 dUTPase a une spécificité de substrat faible et permet de réduire l’activation de plusieurs nucléosides analogues 25 , 27.
  3. Des génomes viraux étiquette avec EdC. Suivre les indications pour étiqueter des génomes entrants (1.3.1.), reproduisant les génomes (1.3.2.), ou les fourches de réplication virale (1.3.3.).
    NOTE : Seule étape 1.3.1 et 1.3.2 1.3.3 doit être effectué selon que les génomes entrants, génomes répliqués ou fourches de réplication sont à analyser dans les étapes suivantes, respectivement.
    NOTE : EdU ou EdU f-ara peut être substitué pour EdC. La toxicité d’analogues nucléosidiques doit être surveillée et réduit au minimum.
    1. Utilisation prémarquées des actions à mener à l’infection à l’étape 1.2 et passez à l’étape 2 ou 3 moins de 4 h après l’infection (hpi) pour enquêter sur les vDNA non répliquée ( Figure 1 a).
      NOTE : Préparer des virus pré-étiquetée stocks en utilisant le protocole décrit précédemment 25. Les stocks de virus doivent être passés à travers une colonne G-25 pour enlever tout résidu EdC.
    2. Label vDNA reproduisant en ajoutant 5 à 25 µM EdC au milieu de culture cellulaire des cellules infectées pendant 2-4 h ( Figure 1 b). Avant d’ajouter, diluer 1 mL de milieu de croissance EdC.
    3. D’étiqueter les fourches de réplication virale, après le début de la réplication de vDNA (≥ 4 hpi), étiquette impulsion reproduisant vDNA avec 5 à 25 µM EdC pour 5 à 20 min. Pour chasser, rincer 3 x milieu de chasse contenant 25-100 µM 2´deoxycytidine (deoxyC) et puis incuber en présence du milieu de la chasse pour une supplémentaire de 20 à 40 min ( Figure 1).
      NOTE : Moyenne de pouls et chase doit être équilibré à 37 ° C et 5 % de CO 2 avant utilisation.
      Remarque : Pour des expériences de pouls de chase, il est important de tenir compte de la quantité de temps qu’il faut pour les nucléosides entrer dans la cellule et être phosphorylé avant qu’ils peuvent être incorporés dans la réplication de l’ADN. Cela doit être déterminé empiriquement.
      Remarque : Pour déterminer la résolution d’expériences de pulse chase, calculer le taux de réplication virale dans les conditions expérimentales utilisées. Ceci peut être déterminé par PCR quantitative des génomes viraux durant une seule étape croissance temps cours 26.
      Remarque : Pour l’imagerie des génomes viraux passez à l’étape 2 et pour la purification des génomes viraux, passez à l’étape 3.

2. Imagerie de l’ECD étiquetée ADN ( Figure 2 a)

Remarque : il est utile d’effectuer l’imagerie en tandem avec la méthode de purification du génome viral pour vérifier que l’ADN cellulaire n’est pas étiquetée dans les expériences. L’imagerie permet également de visualiser la nature des vDNA marqué et valider les données de la protéomique. Exemples de patrons de coloration de l’ADN viraux et cellulaire sont indiquées à la Figure 3.

  1. Mener à des infections et EdC étiquetage comme indiqué à l’étape 1, sauf en utilisant revus à la baisse les conditions sur les lamelles dans un plat de culture de tissu de 12 puits contenant 1 mL de milieu de croissance.
    2. Paraformaldéhyde
  2. fix cellules avec 3,7 % de 1 mL dans du PBS 1 x pendant 15 min à température ambiante. Après fixation, rincer les cellules 2 x avec BSA 3 % 1 mL dans du PBS.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde peut causer des blessures graves ou permanentes. Suivez les consignes de sécurité.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et lamelles peuvent être stockés à 4 ° C au cours du deuxième lavage jusqu'à 3 jours.
  3. Permeabilize des cellules avec 1 mL de tampon de perméabilisation [Voir la Table des matières] pendant 20 min à température ambiante tout en berçant.
  4. Rincer avec 1 mL de 3 % de BSA, puis bloc avec BSA 3 % 1 mL dans du PBS pendant 30 min à température ambiante tout en berçant.
  5. Ajouter 1 mL de la réaction de clic cocktail [Voir la Table des matières] à lamelles de façon covalente conjugué Alexa Fluor 488 azoture d’EdC étiquetée ADN. Incuber à température ambiante pendant 30 min, tout bascule. Aspirer et rincer deux fois avec 1 mL de PBS.
  6. Tache ADN cellulaire avec 1 mL d’une dilution de 1:2,000 de Hoechst en PBS pendant 30 min à température ambiante tout en bascule. Aspirer et rincer deux fois avec 1 mL de PBS.
    7. Immunofluorescence indirecte
  7. tache avec des anticorps primaires et secondaires selon norme protocoles 25.
    Remarque : VDNA étiqueté putative avec ICP8, ICP4 ou UL42 et étiqueté cellulaire ADN putative avec Hoechst tache.
  8. Monter sur glissières lamelles couvre-objet et image des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence.
    Remarque : Diapositives peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.

3. Purification des vDNA et des protéines associées aux

Remarque : plusieurs aspects de ce protocole ont été adaptées de Leung et al. 22
Remarque : tous les tampons et les réactifs doivent être réfrigérés sur la glace avant utilisation et toutes les mesures devraient être menées sur glace sauf indication contraire.

  1. Récolter noyaux.
    NOTE : Avant l’isolement des noyaux, formaldéhyde peut servir aux protéines de réticulation à l’ADN. Des conditions plus strictes de lavage permet ensuite au cours de la purification de l’ADN sur des billes de streptavidine. Pour crconditions osslinking et lavage voir Sirbu et al. 21.
    1. remplacer le milieu de culture avec 20 mL de tampon d’Extraction de noyaux (NEB) et incuber pendant 20 min à 4 ° C, avec parfois de la bascule. Noyaux deviendra visibles au microscope.
    2. Gratter des noyaux de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules et transvaser dans un tube conique de 50 mL. Centrifugation pendant 10 min à 2 500 g à 4 ° C à noyaux de granule, éliminer le surnageant.
      NOTE : Trypan coloration bleue peut être utilisée pour vérifier l’isolement des noyaux des cellules.
    3. Délicatement déloger le culot nucléaire dans 10 mL de PBS, transférez dans un tube conique de 15 mL et pellet par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. Completely remove PBS.
      Remarque : Les noyaux peuvent être congelés et le protocole peut être suspendu à ce stade. Pour ce faire, doucement Resuspendre le culot nucléaire dans 500 µL de congélation mettre en mémoire tampon et incuber le tube dans un bain de glace d’éthanol/sec. Stocker des noyaux congelés à-80 ° C. Avant utilisation, décongeler à température ambiante, les noyaux, transférer rapidement vers la glace, ajouter 10 mL de PBS, roche doucement pour mélanger, pellet par centrifugation pendant 10 min à 2 500 g à 4 ° C et de supprimer complètement les PBS. Noyaux de congélation peut entraîner des rendements réduits.
  2. Par covalence conjugué Biotine-azide à EdC étiqueté vDNA.
    1. Remettre le culot nucléaire en réaction clic 10 mL mélanger [Voir la Table des matières] par pipetage doucement monter et descendre 5 fois avec une pipette de 10 mL.
      Remarque : Il est important que les réactifs inclus dans le mélange réactionnel clic sont ajoutés dans l’ordre indiqué.
    2. Tourner pendant 1h à 4 ° C. Pendant la rotation de préparer et refroidissez les tampons B1, B2 et B3 [Voir la Table des matières].
    3. Pellet noyaux par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. complètement supprimer cliquez sur mélange réactionnel et laver le culot par doucement resuspendant dans 10 mL de PBS et centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C.
    4. Resuspendre doucement le nucléaire culot dans 1 mL de PBS et le transfert d’un tube de microtubes de 1,5 mL à l’aide d’une pointe de pipette grosse perce. Noyaux de granule par centrifugation pendant 10 min à 2 500 x g à 4 ° C. Completely remove PBS et flash congélation dans l’azote liquide.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et noyaux congelés peuvent être conservés à-80 ° C. gel dégel contribue à la lyse ultérieure il est donc recommandé que les noyaux être flash gelés même quand procéder à l’étape 3.3 le même jour.
  3. Lyse des noyaux et de fragments d’ADN.
    1. Décongeler noyaux sur la glace et remettre en suspension dans 500 µL tampon B1 par pipetage de haut en bas. Incuber sur glace pour 45 min.
    2. Un échantillons 6 fois pendant 30 s chaque à amplitude de 40 % à l’aide d’une sonde de microtip 3 mm. Placer les échantillons sur la glace pendant 30 s entre les impulsions. Après la sonication, échantillons devraient être clair, pas nuageux.
      NOTE : Conditions de Sonication doivent être optimisées pour chaque sonicateurs. Pour obtenir des instructions détaillées sur la façon d’optimiser les conditions de la sonication voir Leung et al. 22.
    3. -pellet débris cellulaires par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. La taille de granule devrait diminuer de manière importante. Filtrer le liquide surnageant à travers des tamis de cellule 100 µM et de conserver le débit par.
    4. Ajouter 500 µL tampon B2 pour le surnageant filtrée. 900 µL de cet exemple seront utilisés à l’étape 3.4.2.
    5. , Prélever une partie aliquote de chaque condition d’isolement d’ADN (50 µL ou volume 1/20ème) et ajouter 50 µL 2 x solution SDS-bicarb [Voir la Table des matières]. Procéder au protocole d’isolement de l’ADN (étape 3.6).
    6. Prélever une partie aliquote de chaque condition d’entrée protéine (50 µL ou volume 1/20ème) et ajouter 50 µL 2 x solution tampon de Laemmli, congélation dans l’azote liquide et stocker à -80 ° C. utiliser à l’étape 3.5.6.
  4. Billes recouvertes de bind biotinylé ADN de streptavidine.
    1. Préparer la Streptavidine T1 billes magnétiques en transférant 300 µL de lisier de perle à un tube de microtubes de 1,5 mL. Préparer un tube de perles par exemple. Perles de lavage 3 x avec 1 mL de tampon B2 par vortex pour remettre en suspension, en appliquant un aimant pour séparer les billes et aspirer le tampon de lavage.
      NOTE : Optimisé liant le résultat de conditions en rendement maximisé et liaison fond minimal. Il a été déterminé expérimentalement que Streptavidin T1 billes magnétiques ont une capacité de liaison significativement plus élevée que d’agarose perles, mais aussi d’autres perles de streptavidine et moins de fond lie de streptavidine C1 perles ( Figure 4 a ).
    2. Ajouter 900 µL de l’échantillon de l’étape 3.3.4. aux talons lavées et tourner la nuit à 4 ° C.
      Remarque : Ne pas les perles de vortex, une fois que l’échantillon est ajouté à leur.
      Remarque : Si des quantités importantes de l’ADN ou des protéines sont isolées dans le contrôle négatif sans étiquette, cette étape peut être réduite de nuit à 4 h afin de réduire la liaison fond.
  5. Laver les perles et éluer vDNA et des protéines associées.
    Remarque : Il est recommandé d’utiliser des embouts de filtration pour les étapes restantes.
    1. Échantillons de Place dans un portoir magnétique microtubes, enlever le surnageant, resuspendre doucement dans 1 mL de tampon B2, tournent à 4 ° C pendant 5 min.
    2. Répéter l’étape 3.5.1 triple.
    3. Placer les échantillons dans un portoir magnétique microtubes, éliminer le surnageant, resuspendre dans 1 mL de tampon B3, doucement et tourner à 4 ° C pendant 5 min.
    4. Transférer 100 µL de billes mélange (1/10 ème volume) dans un nouveau tube pour l’isolement d’ADN lié. Appliquer ce tube à l’aimant, éliminer le surnageant, remettre les billes en suspension dans 100 µL 1 x solution SDS-bicarb et procéder au protocole d’isolement de l’ADN (étape 3.6).
    5. Appliquer le tube contenant le reste du mélange 900 µL perle de l’étape 3.5.3. à l’aimant, éliminer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 50 µL 2 x Laemmli solution tampon pour éluer les protéines et complexes ADN-protéine.
    6. Échantillons de bouillir à 95 ° C pendant 15 min, vortex, rapidement spin dans des microtubes et appliquer l’aimant. Transférer l’éluat dans un nouveau tube, congélation flash et conserver à -80 ° C.
      Remarque : Serrures cap emploi pour s’assurer que les tubes ne pop pas ouvrir tout en ébullition.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pendant plusieurs semaines.
    7. Analyser des échantillons de protéine par le bleu de Coomassie coloration, éponger occidental ou spectrométrie de masse par des procédures standard 25. Résultats représentatifs sont présentés dans la Figure 4 et Figure 5.
      Remarque : Pour déterminer si le rendement de protéine est suffisante pour la spectrométrie de masse, 7,5 µL de chaque échantillon est utilisé pour l’analyse par coloration au bleu de Coomassie et 7,5 µL pour éponger occidental d’un génome viral représentant associé la protéine (ICP4, ICP8 ou UL42). Le même volume de lysats de l’étape 3.3.6. sont exécutés aux côtés de contrôle des niveaux de protéine d’entrée. L’échantillon restant (35 µL) est ensuite analysée par mass spectrometry comme décrit plus haut 25.
  6. Isolement d’ADN
    1. Incuber les échantillons de mesures 3.3.5. et 3.5.4. à 65 ° C pendant 4 à 16 h. Retirer l’échantillon de billes magnétiques, si nécessaire.
    2. Extraire des échantillons avec alcool de phénol : chloroforme : isoamylique 150 µL (PCI) et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube.
    3. Extraire le PCI restant avec 100µl Tris-EDTA (TE) et ajouter la phase aqueuse dans un nouveau tube.
    4. Extraire des échantillons avec alcool de chloroforme : isoamylique 200 µL (24:1).
    5. Purifier la phase aqueuse à l’aide de la PCR Purification Kit selon le fabricant ' protocole de s.
      Remarque : L’indicateur de pH tampon PB devient pourpre lorsqu’ajoutés à l’échantillon. Ajouter 10 & #181 ; L 3M de NaOAc pH 5.0 pour diminuer le pH de l’échantillon.
    6. Concentration d’ADN de déterminer à l’aide d’un fluorimètre.
      Remarque : Ce protocole entraîne généralement de 100 à 400 ng perle lié aux DNA. Aucun ADN ne devrait être détecté dans l’éluat du contrôle négatif dans lequel EdC n'a pas été ajouté dans l’étape 1.3.
    7. ADN peut être stocké dans une faible liaison ADN tube à 4 ou - 20 ° C et peut être utilisé pour la PCR en temps réel ou analyse de séquençage à haut débit.

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Résultats

Tout d’abord, l’utilisation de la chimie de clic pour la purification de l’ADN des cellules a été réalisée par la méthode d’iPOND21. Le but d’iPOND est de purifier les fourches de réplication cellulaire pour l’identification des protéines associées. Nous avons adapté cette technique afin d’étudier spécifiquement les interactions de protéine de vDNA au cours de l’infection. Manipulation de l’approche d’étiqueter des génomes viraux avec EdC (Figu...

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Discussion

Ce protocole comprend plusieurs étapes qui, si ne pas suivi attentivement, peuvent entraîner en rendement de protéine significativement réduite ou une contamination par l’ADN cellulaire. Il est essentiel que cellules stationnaires sont utilisés pour toutes les expériences à faire en sorte que l’ADN cellulaire n'est pas étiqueté et purifié. Ceci peut être confirmé par l’absence de polymérases d’ADN cellulaires dans l’échantillon de protéines car HSV1 n’utilise pas l’ADN polymérase cellulaire pour la synthèse du génome. Pe...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous reconnaissons Hannah Fox pour aider à la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH grant R01AI030612.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules MRC-5ATCCCCL-171
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco26140-179
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)Gibco12800-082Substitué par 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 12 mM  ; (pour la croissance en flacons) ou 30 mM (pour la croissance en boîte) bicarbinate de sodium
600 cm2 boîte de culture tissulaireThermo Fisher Scientific166508
Tris Saline tamponnée (TBS), pH 7,4137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
HSV-1 StockLes stocks avec des titres supérieurs à 1x109 PFU/mL fonctionnent le mieux
Sephadex G-25  ; colonne (colonne de dessalage-10)GE Healthcare17085101
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)Fisher ScientificD128-1
5´ ;-Ethynyl-2´ ;-deoxycytidine (EdC)Sigma-AldrichT511307Dissoudre dans du DMSO pour préparer un stock de 40 mM, aliquote et stocker à -20 ° ; C  ;
2´ ;-désoxycytidine (deoxyC)Sigma-AldrichD3897Dissoudre dans l’eau pour préparer un stock de 40 mM, aliquote et conserver à -20 ° ; C  ;
Tampon d’extraction nucléaire (NEB)Préparer frais (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccharose, 0,5 % Igepal)
Racleur à cellulesVerre Bellco7731-22000Autoclave avant utilisation
Solution de bleu de trypanSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7,2 (10x)1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO<4> (diluer à 1x dans de l’eau stérile avant utilisation)
Sulfate de cuivre (II) pentahydraté (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489Préparer un stock de 100 mM et stocker à 4 ° ; C jusqu’à 1 mois
(+) L-ascorbate de sodiumSigma-AldrichA4034Préparer fraîchement le stock de 100 mM et le stocker sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit utilisé, l’azoture
de biotineInvitrogenB10184Préparer le stock de 10 mM dans le DMSO, l’aliquote et le conserver à -20 ° ; C jusqu’à 1 an  ;
Préparer immédiatement avant utilisation en ajoutant les réactifs dans l’ordre indiqué (10 ml : 8,8 ml 1x PBS, 200 ml 100 mM CuSO4, 25 ml 10 ml d’azoture de biotine, 1 ml 100 ml d’ascorbate de sodium)  ;   ;
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase Roche11697498001Dissoudre dans 1 mL d’eau pour préparer 50x stock, peut se conserver à 4 ° ; C jusqu’à 1 semaine, ou ajouter directement 1 comprimé à 50 mL
de tampon TamponPréparez frais (7 mL de glycérol à 100 %, 3 mL de NEB, 200 &mu ; L 50x inhibiteur de protéase)
Tampon B1Préparer frais (25 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1 % d’Igepal, 1x inhibiteur de protéase)
Tampon B2Préparer frais (150 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 % d’Igepal, 1x inhibiteur de protéase)
Tampon B3Préparer frais (150 mM de NaCl, 2 mM d’EDTA, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1x inhibiteur de protéase)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer équipé d’une sonde à micro-pointes de 3 mmSonicsVCX 130
Filtre à cellulesFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Mini-Tube RotatorFisher Scientific260750F
d’échantillon LaemmliMélanger 400 mg de SDS, 2 mL de glycérol à 100 %, 1,25 mL de 1 M de Tris (pH 6,8) et 10 mg de bleu de bromophénol dans 8 mL d’eau. Magasin à 4 ° ; C jusqu’à 6 mois. Avant utilisation, ajoutez 1 M de DTT à une concentration finale de 200 mM.
Verrouillage du capuchon pour tube de 1,5 mLFisher ScientificNC9679153
Réactifs
NOVEX Kit de coloration au bleu colloïdalInvitrogenLC6025
Boîte de culture tissulaire à 12 puitsCorning3513
CoverslipsFisher Scientific12-545-100Autoclave avant utilisation
Lames de microscopeFisher Scientific12-552-5
16 % de paraformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15710Diluer à 3,7 % dans 1x PBS avant utilisation
Albumine sérique bovine (BSA)Fisher ScientificBP1605Préparer 3 % dans 1x tampon
perméabilisation PBS (0,5 % Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787Préparer 0,5 % Triton-X 100 dans 1x PBS
Cocktail de réaction Click - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit d’imagerieSondes moléculairesC10337Préparer selon le protocole du fabricant
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Préparer 10 mg/mL dans l’eau, peut stocker à 4 ° ; C jusqu’à 1 an
Anticorps primaire anti-ICP8 de sourisAbcamab20194Utiliser une dilution de 1:200 dans 1x anticorps
primaire anti-UL42 de souris PBS (2H4)Abcamab19311Utiliser une dilution de 1:200 dans 1x PBS
Anticorps secondaire conjugué anti-souris 594chèvre Life Technologiesa11005 Utiliserune dilution de 1:500 dans 1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
SDS-bicarbonate2 % SDS, 200 mM NaHCO3
Phénol :chloroforme :alcoolMix 25:24:1 au moins 1 jour avant utilisation, conserver à 4 ° ; C dans l’obscurité
chloroforme :alcoolMélanger 24:1 au moins 1 jour avant utilisation, conserver à température ambiante dans l’obscurité
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluer à 1x avant utilisation)
Qiaquick Kit de purification PCRQiagen28104
3 M acétate de sodium pH 5.2
Qubit 2.0 FluorimètreInvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Kit de dosageInvitrogenQ32851
Tubes de dosage QubitInvitrogenQ32856
Microscope à fluorescence équipé d’un logiciel
Microcentrifugeuse pour tubes
Centrifugeuse de table pour tubes
Cellule incubateur de
Armoire
Blocs thermiques65 ° ; C et 95 ° ; L
de congélation 2x Tampon western blot standard de de 2x solution isoamylique isoamylique d’imageriede 1,5 mLde 15 et 50 mLculturede biosécurité

Références

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

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