Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Summary

Détection de la maladie résiduelle minime ou mesurable (MRD) est un biomarqueur pronostique important pour affiner l’évaluation des risques et de prédire les rechutes dans la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ces lignes directrices exhaustives et recommandations avec les meilleures pratiques d’identification cohérente et précise et de détection du MRD, peut aider à prendre des décisions de traitement efficaces AML.

Abstract

Critères de réponse dans la leucémie myéloïde aiguë (AML) a récemment été rétablie, avec l’examen morphologique pour déterminer si les patients ont obtenu une rémission complète (CR). Environ la moitié des patients adultes qui sont entrés dans CR vont revenir dans les 12 mois en raison de l’excroissance de cellules résiduelles de AML dans la moelle osseuse. La quantification de ces autres cellules de la leucémie, appelées la maladie résiduelle minime ou mesurable (MRD), peut être un biomarqueur robuste pour la prévision de ces rechutes. En outre, une analyse rétrospective de plusieurs études a montré que la présence de MRD dans la moelle osseuse des patients AML correspond au faible taux de survie. Non seulement est l’ensemble de la population leucémique, reflété par les cellules ayant une leucémie associés phénotype immunitaire (LAIP), associée à des résultats cliniques, mais est donc la sous-population immatures basse fréquence des cellules souches de la leucémie (LSC), qui peuvent être le suivi par cytométrie MRD ou approches MRD-like. La disponibilité des épreuves sensibles qui permettent la détection des cellules de la leucémie résiduelle (tige) sur la base des caractéristiques spécifiques à certaines maladies ou associés à la maladie (marqueurs moléculaires anormaux ou immunophenotypes aberrants) ont considérablement améliorée évaluation MRD dans AML. Toutefois, compte tenu de l’hétérogénéité inhérente et la complexité des AML comme une maladie, méthodes pour le prélèvement de moelle osseuse et effectuer des analyses MRD et LSC devraient être harmonisées lorsque cela est possible. Dans ce manuscrit, que les auteurs décrivent une méthodologie détaillée pour l’aspirat de moelle adéquate d’échantillonnage, transport, traitement pour évaluation de cytométrie en flux optimal de multicolore et blocage des stratégies pour évaluer MRD et LSC pour aider à la prise de décision thérapeutique de l’échantillon pour les patients de l’AML.

Introduction

Leucémie myéloïde aiguë (LMA) est qu'une tumeur maligne de la moelle osseuse caractérisée par des défauts dans le programme de maturation, avec prolifération anormale et l’accumulation de cellules myéloïdes progénitrices, inhibition de l’hématopoïèse normale et enfin insuffisance médullaire . La maladie est très hétérogène en ce qui concerne la morphologie, immunophenotype, cytogénétique, des aberrations moléculaires et les signatures d’expression de gène, en réponse au traitement ou traitement résultat^1,2. Gestion actuelle inclut chimiothérapie d’induction dans le but d’atteindre la rémission complète (CR), suivie d’une rémission après traitement, qui repose en grande partie sur les résultats de moléculaire, cytogénétique et immunophénotypiques des études et se compose des de nombreux cours de chimiothérapie additionnelle ou de transplantation de cellules souches (autologue ou allogénique)³. Malgré le taux de rémission élevé après que chimiothérapie intensive jusqu'à 90 %, survie à 5 ans chez l’adulte est seulement environ 30 % - 40 %, principalement en raison du développement des rechutes qui sont généralement résistantes à la chimiothérapie et par conséquent très difficile à traiter. Résultats chez les enfants est mieux, même si un tiers environ des rechutes aussi. Donc, la détection précoce de la rechute imminente remplira un besoin médical non comblé et peut-être servir de guide de rémission après traitement⁴.

Maladie résiduelle après que traitement peut refléter la somme de tous les diagnostics et les mécanismes/facteurs de résistance après le diagnostic ; d'où sa mesure peut être pronostique et instrumentale pour guider le traitement. La possibilité de modifier la maladie résiduelle (anciennement appelée maladie résiduelle et la maladie résiduelle maintenant dénommée aussi mesurables ou MRD) bien en deçà du critère morphologique des cellules blastiques 5 % change le paysage de la classification de risque. Actuellement les deux méthodes utilisées principalement pour détecter les MRD sont écoulement cytometry-base et moléculaires, ce dernier étant évaluée par reverse transcriptase PCR (RT-qPCR)⁵ ou, bien que dans un stade prématuré, de prochaine génération séquençage (NGS). De nombreuses études chez les adultes ainsi que les enfants ont déjà démontré que diverses approches MRD renseignent fort pronostique dans AML fois après induction et consolidation thérapie^6,7et une nouvelle définition de la maladie (de charge supérieure à CR morphologique) est en train d’émerger⁸. Ceci suggère que MRD évalués par débit et/ou techniques moléculaires devraient devenir et en fait déjà deviennent, standards à chaque essai clinique AML.

Ce manuscrit présente la procédure de cytométrie en flux détaillé afin d’obtenir une caractérisation immunophénotypiques précise et reproductible de MRD dans des échantillons de moelle osseuse, y compris le prélèvement de moelle osseuse et le traitement des procédures précédant la cytométrie en flux. La disponibilité des échantillons de moelle osseuse de bonne qualité au diagnostic et de suivi est cruciale pour le succès de cette mesure sur les sites cliniques et les essais cliniques. En fait, ces considérations pré-analytique sont aussi des approches MRD une importance vitale pour moléculaires (PCR et NGS). Pour la caractérisation d’immunophénotypiques du MRD, marqueurs exprimés de manière aberrante sont combinés avec normal myéloïde et marqueurs de géniteur, pour identifier un associées aux leucémies lymphoblastiques (LAIP)⁹. La résultante de nombreux facteurs qui influencent la réponse au traitement, tels que la pharmacorésistance leucémie intrinsèque ou acquis, de Pharmacodynamie et de cinétique de thérapie, surveillance du système immunitaire et la conformité des mesures MRD. MRD est donc un paramètre pronostique après le diagnostic très fort, associé à des résultats cliniques en termes dichotomiques sur un seuil de concentration déterminé par analyse d’exploitation récepteur caractéristique (ROC). Pour notre cohorte AML adulte de la HOVON 42 a étudier, le seuil est fixé à 0,1 % des globules blancs LAIP positive cellules/total. En utilisant ce critère pour déterminer le statut MRD positif négatif vs, un groupe de patients peut être identifié qui ont une incidence de rechute significativement plus mauvais, la survie sans rechute et global⁶. En outre, les auteurs décrivent la mesure des cellules de la leucémie immatures, résistante aux médicaments avec des caractéristiques semblables à des cellules souches (cellules souches CD34 + CD38-leucémie ou LSC), qui offre un bon prédicteur des résultats pour les patients¹⁰. Ensemble LAIP et LSC approche forme l’approche MRD de cytométrie en flux. L’approche LAIP consiste pour à peu près 90 % des patients, tandis que l’approche de la LSC peut être appliquée dans environ 80 % des patients. Ensemble plus de 95 % des patients peuvent être évaluées pour un paramètre, ou les deux.

Enfin, cette publication fournit une description détaillée et opérationnelle pour évaluer MRD par cytométrie en flux. Cela inclut : 1) harmonisation et/ou standardisation des procédures de prélèvement de moelle osseuse, orientation transport 2) échantillon 3) description détaillée de la détection de cellules leucémiques avec FACS en utilisant plusieurs panneaux d’anticorps y compris les cellules du même tube pour caractériser la LSC, 4) machines de mise en place de la FACS pour les mesures normalisées, 5) programmes analytiques pour la mesure de MRD et 6) les programmes analytiques pour la détection de la LSC.

Notre objectif est de montrer toutes les facettes de la procédure, y compris la préparation de l’échantillon, car qui est rarement discutée alors que c’est une question importante pour la qualité du résultat final. Biopsie et la ponction de moelle osseuse sont des procédures cliniques utilisés pour évaluer des cellules hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ceux-ci sont réalisés avec une numération formule sanguine (CBC) et un frottis sanguin. La méthode optimale pour la ponction de moelle osseuse est cruciale d’un diagnostic précis et de suivi pour la mesure de MRD. En outre, un aspirat de moelle épinière réussie doit contenir suffisamment de cellules pour effectuer l’analyse des flux LAIP et LSC (cellules viables au moins 10 millions). Nous décrivons ici la méthode pour effectuer une ponction de moelle osseuse et de fournir des lignes directrices, qui devraient se traduire par adéquate cellule d’échantillonnage (et limite le potentiel d’hémodilution) nécessaire pour le diagnostic précis et des recherches supplémentaires. Ces considérations pré-analytique sont également des approches MRD une importance vitale pour moléculaires (PCR et NGS). Tous les spécimens pour immunophenotyping doivent être traités préférentiellement dans les 24 h suivant le prélèvement. Bien que pas recommandable, la moelle osseuse et des échantillons de sang périphérique peuvent encore être traités et analysés lorsqu’ils sont conservés jusqu'à 72 h à température ambiante. En outre, toutes les manipulations avec du matériel doivent être effectuées dans des conditions stériles, afin de permettre la cryoconservation des cellules stériles pour évaluation ultérieure de la recherche/qualité etc..

Protocol

Le protocole suit les lignes directrices du code de la recherche et le Comité d’éthique de recherche de la VU University Medical Center.

1. moelle osseuse aspiration et échantillon de préparation

1. Patiente et matérielle de préparation
   1. Remplir un ou deux seringues de 10 mL de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une aiguille de calibre 16. Remplacer l’aiguille pour une aiguille de calibre 21.
   2. Mettre deux gouttes de 5 % et d’EDTA sur un verre de montre.
   3. Mettre en place des lames de verre (n = 15 avec numérotation patient cohérente et la date) pour la préparation de frottis.
   4. Placer le patient en position de décubitus latéral. Localiser l’épine iliaque supérieure postérieure et marquer avec un stylo.
      Remarque : en général, l’épine iliaque supérieure postérieure est situé une main largeur distale à la crête iliaque et une main largeur latérale à la ligne médiane. Chez les femelles, la colonne vertébrale réelle peut être un peu plus latérale, chez certains hommes un peu plus médiales.
   5. Désinfecter la peau à la chlorhexidine à 0,5 ou 1 % dans l’éthanol à partir de la zone de biopsie prévue vers l’extérieur dans les cercles.
   6. Ouvrez l’emballage des gants stériles, mettre les gants stériles et déposer le paquet sur la table pour créer un champ stérile. Ouvrez l’emballage avec l’aiguille d’aspiration et le placer sur le champ stérile.
   7. Infiltrer la peau et tissu sous-cutané et enfin périoste. Au périoste, administrer la lidocaïne de telle sorte qu’une zone de 1 cm de diamètre a été anesthésiée.
      Remarque : L’administration adéquate de lidocaïne au périoste est l’un des facteurs plus importants pour le confort du patient. Tester si le périoste a été correctement anesthésié en tapant sur l’emplacement de la biopsie prévue avec l’aiguille introduite et demander si le patient ressent une douleur. Note : enfants sont complètement anesthésiés pendant toute la procédure.
   8. Tenez l’aiguille d’aspiration (15 Ga x 2.8") avec l’extrémité proximale de la paume et l’index contre le côté de l’axe de l’aiguille en métal près de la pointe ; Cette position permet de mieux contrôler.
   9. Introduire l’aiguille avec un mouvement de rotation (en alternant rapidement les mouvement de pronation/supination) à travers la peau vers l’épine iliaque et l’aiguille en contact avec l’épine iliaque postérieure.
   10. Assurer que l’aiguille est introduite à la zone anesthésiée du périoste ; le patient doit se sentir seule pression et aucune douleur. Si le patient ressent de la douleur, repositionner l’aiguille ou administrer plus de lidocaïne.
   11. En exerçant une pression douce mais ferme, avancer l’aiguille tout en tournant dans une alternance aiguilles de compteur dans le sens horaire. Entrée dans la cavité de moelle osseuse est généralement détectée par diminution de la résistance.
   12. Retirer le stylet de l’aiguille. Fixez une seringue vide de 10 mL à l’aiguille.
   13. Appliquer une pression négative en retirant le piston de la seringue avec une traction douce. Prévenir le patient qu’ils peuvent se sentir une sensation de crampes et de douleur lorsque la moelle est être aspiré. Si pas assez spicules de moelle osseuse sont libérés, un autre aspiration doit être effectuée avec un tirage rapide. La plupart des spicules sera dans le premier 1-2 mL provenant de l’attraction initiale. Aspirez seulement 1 à 2 mL afin d’éviter la dilution de l’échantillon.
       NOTE : Dilution se traduira par hémodilution et peut entraîner des résultats MRD).
   14. Enlevez la seringue et remplacer le stylet dans l’aiguille d’aspiration. Éjectez la partie de la moelle dans un verre de montre et le reste dans un tube de 8 mL enduit avec de l’héparine.
       Remarque : Il faut inverser chaque tube immédiatement après le dépôt de l’aspirat de moelle dans le tube d’échantillon afin d’assurer l’anticoagulation adéquate. Coagulation de la moelle osseuse est souvent la cause de matériel inapproprié. Supplémentaires de la moelle osseuse peut être aspirée depuis le même endroit, mais de préférence, l’aiguille est avancée à 5-10 mm avant de prend une nouvelle aspiration. Préférence pas plus de 2 tirages par niveau d’insertion doivent être prises. N’oubliez pas de marquer les tubes avec un nombre qui représente le premier croissant, deuxième et/ou consécutive attire. C’est une règle commune à utiliser le premier tirage au sort pour l’analyse diagnostique plus pertinent.
   15. Sinon, retirer l’aiguille de l’endroit d’insertion et réintroduire dans la cavité de moelle quelques millimètres de l’endroit d’insertion original et répéter la procédure.
       Remarque : Aspirer pas plus de 1 à 2 mL par tir, pour éviter la contamination sanguine importante.
   16. Répétez aussi souvent que le matériel est nécessaire. Lorsque suffisamment de matière pour le protocole d’étude clinique spécifique est aspiré, retirer l’aiguille de la moelle osseuse.
       Remarque : Dans le cas d’aspirations de moelle osseuse lente ou difficile l’utilisation de seringues qui ont été préalablement rincé avec anticoagulant peut être utile. Dans le cas d’un robinet sec, effectuer une biopsie à trépan qui déborde le cadre de ce manuscrit.
2. Préparation des frottis pour l’examen morphologique
   1. Pour évaluation morphologique optimale, choisir des spicules (p. ex. à l’aide d’une spatule en plastique) de l’aspirer dans le verre de montre et les placer sur une lame de verre.
   2. Placez délicatement une lame de verre sur la diapositive avec la moelle et glissez doucement ; éviter toute pression.
      Remarque : Uniquement en cas de spicules très large moelle osseuse légère pression peut s’exercer, pour diminuer l’épaisseur de la cellule de diffusion. Les avantages de la procédure d’aide d’un assistant qui peut manipuler les tubes de prélèvement. Un étiquetage précis des tubes avec le numéro de patient et le numéro du tirage séquentielle de la moelle osseuse est crucial.
   3. Bien sécher la lame et ensuite effectuer la coloration peut de Giemsa Grünwald (voir table des matières). Examiner au microscope léger pour la morphologie (voir Figure 1).
      Remarque : La Figure 1 a montre les frottis de moelle saine composée de types de cellules fonctionnelles différentes tout en Figure 1 b un patient AML avec blastes leucémiques principalement. Afin de mieux définir la charge résiduelle leucémique, immunophénotypage doit être effectuée.

2. transport de matières pour un traitement ultérieur

1. Préparation des échantillons pour le transport
   1. Afin de s’assurer que le matériau ne fuira pas et les tubes ne seront brisera pas, ce emballage correct (voir Figure 2).
      NOTE : Depuis notre et d’autres expériences de la viabilité des cellules est le mieux conservé lorsque la moelle osseuse est conservée à température ambiante. Pour le transport à long terme, ceci est mieux réalisé utilisant une température de chambre « gel-pack » pour aider à la stabilité de la température pendant le transport.
   2. Étiqueter les paquets et ajouter les formules appropriées pour éviter la perte du colis, transport prolongée ou commutation de patients.
      Remarque : Cela doit au moins contenir : données sur les patients (formule 1). Cela devrait inclure le nombre d’étude et communément la « Date de naissance ». Indispensable pour le bon traitement du matériau après l’arrivée au laboratoire de réception, est une déclaration claire de spécifiquement les analyses de laboratoire requis (diagnostic moléculaire, immunophénotypage, MRD etc.) dans le présent formulaire. (Formule 2) Adresse et numéro de téléphone d’une personne-ressource, et lorsque nécessaire, les documents pour les douanes. Pour éviter de perdre des paquets par la poste, le laboratoire envoi avertit toujours le laboratoire récepteur qu’un échantillon a été envoyé. Utilisation de « track and trace » est recommandée.
2. Recevoir des échantillons d’autres instituts
   1. S’assurer que la logistique appropriée est en place à l’Institut pour recevoir l’échantillon au laboratoire dès qu’il est remis à l’Institut.
      Remarque : Pour l’organisation logistique optimale préférence un laboratoire central est nécessaire, qui reçoit et recueille tout le matériel de la clinique locale et des hôpitaux extérieurs. En particulier, assignant des protocoles de distribution et une communication claire avec les laboratoires de l’exécutifs est essentiel.
   2. Après avoir reçu les échantillons, à noter avec précision la numérotation appropriée sous formes de copie papier et une base de données sécurisée contenant des domaines importants tels que le numéro d’identification du MRD, numéro d’identification spécifique de procès, numéro d’enregistrement de l’hôpital, Institut d’envoi, Date de naissance, matériel type (moelle osseuse ou du sang périphérique), globules blancs (WBC), date de la ponction de moelle osseuse, date de la mesure de l’échantillon et des remarques pertinentes pour la qualité de la mesure.
      Remarque : De préférence, cette base de données est également équipé pour contenir des données supplémentaires (ou être liés à d’autres bases de données) des résultats de l’analyse et autres données sur les patients tels que les données de suivi.

3. flux cytomètre Setup

Remarque : Cette section repose sur les instructions de Euroflow. ¹¹

1. Mettre en place des tensions de photomultiplicateur (PMT) pour les paramètres de FCS SSC et canaux fluorescence cible
   1. Paramètres pour FCS SSC démarre le cytomètre en flux et effectuer le « cytomètre Setup et suivi (CST) « courir sur le cytomètre de flux avec des perles de CST (voir table des matières). Lyse des globules rouges provenant d’un donneur sain (voir section 4.1).
      1. Créer une nouvelle expérience (dans le menu : expérience, expérience nouvelle, sélectionnez essai à blanc) à l’aide du logiciel du fabricant (voir le tableau des matériaux) avec un Forward scatter (FSC) versus latéralement (SSC) dot nuage de points permettant de configurer les paramètres FSC et SSC. Nommez cette expérience FSC/SCC PMT avec la date. Tout d’abord utiliser les paramètres actuels du cytomètre (faites un clic droit : « appliquer le CST actuelle »). Ces paramètres ont été générées avec la vérification de la performance CST à l’aide de perles CST-étalonnage (voir table des matières). Ajuster les FSC et SSC pour visualiser les lymphocytes dans « paramètres de l’expérience mondiale ». Remarque : dans notre cytomètre Voici les 285 V et 400 V respectivement. Cochez la Compensation « activer » : inspecteur/Instrument paramètres ou d’indemnisation.
      2. Afin d’évaluer la taille des cellules (FSC) et granularité (SSC) début de mesure sans étiquette lysées cellules du sang périphérique par la fonction « acquérir des cellules ». Les lymphocytes et ajuster/fine-tune FSC et SSC tensions pour atteindre les valeurs cibles moyennes suivantes pour la population de lymphocytes fermée la porte : FSC : 100 000 (plage de 95 000-105 000) ; SSC : 15 000 (plage de 13 000-17 000).
      3. Acquérir et enregistrer des données en mesurant au moins 10 000 événements. Vérifier la moyenne FSC et SSC cibler des valeurs pour les lymphocytes fermées et réajuster si nécessaire.
   2. Pour le paramétrage de la fluorescence de cible chaînes tensions PMT utilisent des particules de calibrage de perles 8-crête arc-en-ciel (voir table des matières).
      1. Créer une nouvelle expérience sur les FACS pour 7-pics. Créer une feuille de calcul « Cible moyenne intensité de fluorescence (MFI) » avec toutes les parcelles de la dot nécessaire (n = 2 ; FSC versus SSC, FITC et PE), histogrammes (n = 8 ; un histogramme pour chaque détecteur de fluorescence) et statistiques indiquant la référence de valeurs de crête (MFI et coefficient de variation (CV)) pour chaque canal de fluorescence.
      2. Préparer fraîchement une solution contenant 1 goutte (± 60 µL) de perles arc-en-ciel dans 1 mL de dH₂O. doucement vortex pour mélanger les perles dans la solution.
      3. Utilisez les paramètres de PMT des tensions FSC/SSC d’en haut et démarrer la fluorescence des perles d’arc-en-ciel de mesure en utilisant la fonction « acquérir » (sans enregistrement) à « Faible » débit avec un seuil de 5 000. Utiliser le bouton « porte rectangulaire » porte la population de perles singulet P1 dans le FSC versus plot point SSC. Porte de la 7^ème PEAK - Population P2 dans le FITC versus intrigue dot PE.
      4. Poursuivre l’acquisition de 7-pics Rainbow perle suspension et ajuster/fine-tune PMT tensions dans tous les canaux de fluorescence pour atteindre des valeurs IFM cibles selon les canaux de cible IFM annotés comme prévu avec les perles.
      5. Utilisez « Record » pour recueillir des données d’environ 10 000 événements et vérifiez l’IMF pour la 7^ème perles pic. Corriger les tensions PMT si nécessaire. Une fois les valeurs d’IMF cible pour le pic de^th 7 sont atteintes, enregistrement/remplacer le fichier pour les valeurs finales de la PMT.
      6. Enregistrer les valeurs finales de la PMT et nommez le fichier Setup de PMT avec la date, qui sera enregistrer dans le catalogue des logiciels du fabricant. Utilisez cette configuration PMT pour corriger le déversement sur chaque colorant de fluorescence.
2. Paramètres de compensation de fluorescence
   1. Étiqueter un tube pour le contrôle non coloré et chaque anticorps conjugué fluorochrome (voir tableau S1 pour les fluorochromes utilisés). Pipetter 100 µL de tampon dans chaque tube.
   2. Vortex le flacon de perles multicolore de compensation (voir table des matières) soigneusement puis ajouter 1 goutte complet (± 60 µL) de ces perles à chaque tube.
      Remarque : Éviter les gouttes les perles sur le côté du tube tout en ajoutant à chaque tube. Cela peut conduire à perle de faible concentration et pourrait avoir un impact les résultats de la matrice de compensation.
   3. Pipette le volume approprié, calculé pour un test d’anticorps conjugué fluorochrome suffisante (ce qui serait suffisant pour colorer 10⁶ cellules) dans le tube correspondant et vortex soigneusement. N’ajoutez pas d’anticorps dans le tube de contrôle non colorés. Incuber pendant 15 à 30 min à l’obscurité à température ambiante (RT).
   4. Ajouter 4 mL de tampon de lavage (solution saline tamponnée au phosphate (PBS)/0.05% azide-0.1% l’albumine sérique humaine (Ash) (voir la table des matières)) dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 300g pour 10 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot de perle en ajoutant 0,2 mL de tampon de lavage à chaque tube. Vortex les tubes soigneusement.
   5. Ouvrez le logiciel d’analyse du fabricant (voir table des matières) et créer une nouvelle expérience (dans le menu : expérience, expérience nouvelle, sélectionnez essai à blanc) et renommez l’en tant que fichier de compensation avec la date actuelle.
   6. Allez dans « paramètres du cytomètre » et réglez la PMT de l’article 3.1. N’oubliez pas que le seuil de FSC est 5 000 et les valeurs de compensation de toutes les fluorochromes utilisés sont nuls.
   7. Créer des contrôles de compensation, y compris les tubes étiquette spécifique, selon les besoins. Veillez à inclure un contrôle non coloré. Sélectionnez dans le menu : expérience, indemnité d’installation, créer des contrôles de Compensation.
   8. Charger le tube de contrôle non colorés et ajuster la porte P1 autour de la population de billes singulet et veiller à ce que le portail P1 contienne uniquement des perles de singulet.
   9. Avec le bouton droit de la porte de P1 et sélectionnez « Appliquer à toutes les commandes de Compensation ». Enregistrer des données pour tous les tubes de fluorescence étiquetées unique. Vérifiez que porte P2 englobe la population positive sur chaque histogramme de fluorescence. Si nécessaire ajuster la porte.
   10. Calculer la compensation. Sélectionnez Experiment, indemnité d’installation, calculer les compensations.
   11. Si le calcul de la rémunération n’est pas réussi, un message d’erreur s’affiche. Procéder aux ajustements nécessaires et recalculer. Lorsque le calcul de la compensation est réussi, une boîte de dialogue s’affiche incitant le nom pour la configuration de compensation.
   12. Entrez un nom (par exemple les paramètres de couleur 8 AA-MM-JJ) et cliquer, lien et sauvegarder. L’installation de compensation est également enregistrée dans le catalogue d’installation de compensation.
       Remarque : Les mêmes paramètres peuvent être utilisés pour toutes les expériences utilisant les fluorophores mêmes.

4. flow Cytometry évaluation (LAIP et LSC)

Remarque : Nous décrivons ici la procédure de lyse en vrac avant la coloration, qui permet de colorer une concentration préférée de la WBC. La plupart des protocoles MRD utilisent cette approche, bien que certains ont utilisé avec succès d’autres options telles que la coloration avant de lyse. Toute la moelle osseuse de coloration avant lyse minimise la cellule préférentiel perte¹², mais présente l’inconvénient de concentrations cellulaires imprévisibles, trop faible.

1. Lyse des cellules en vrac
   Remarque : Maintenez les échantillons non manipulés horizontal à RT, lors de l’acquisition de cytrometric de débit ne peut être effectuée le jour même afin de commencer la procédure dans son ensemble le lendemain.
   1. Remettre en suspension l’échantillon de moelle osseuse anticoagulé à l’homogénéité en retournant l’échantillon plusieurs fois. Déterminer la concentration de cellules de moelle osseuse (globules blancs (WBC)) en utilisant une cellule comptant chambre avec cellule Tuerk solution de coloration (voir table des matières).
   2. Pipette le volume nécessaire de la moelle osseuse dans un tube séparé 15 mL. La quantité de cellules dépend du nombre de tubes de coloration distinctes ; pour une coloration (un tube) utiliser environ 2 x 10⁶ cellules de sang blanches pour les mesures de LAIP et 8 x 10⁶ cellules de sang blanches pour mesurer le tube de la LSC.
   3. Lyse des globules rouges par l’ajout de solution de lyse (voir table des matières). Volume nécessaire de solution de lyse devrait être 10 fois le volume de la suspension cellulaire.
   4. Mélanger doucement, en le retournant et incuber pendant 10 min à température ambiante. Centrifuger pendant 7 min 800g à RT. jeter le surnageant (par exemple avec une pompe à vide ou d’une pipette Pasteur). Resuspendre le culot dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)/0.05% azide-0.1% l’albumine sérique humaine (Ash) (voir la table des matières) à RT. utiliser le volume maximal du tube.
   5. Centrifuger pendant 7 min 800g à RT. jeter le surnageant (par exemple avec une pompe à vide ou d’une pipette Pasteur). Resuspendre le culot dans PBS/0.05% azide-0.1% HSA à une concentration cellulaire de 100 x 10⁶ globules blancs/mL et diviser par le nombre de tubes destinés.
2. La coloration des cellules pour la cytométrie en flux
   1. Pipette anticorps monoclonal (MoAb) solution cocktail mélanger dans les tubes de trieuse (FACS) cellule appropriée activée par fluorescence et incuber avec les cellules lysées moelle pendant 15 minutes dans l’obscurité.
      NOTE : Ceci est très important lorsqu’on utilise des colorants en tandem. Voir, par exemple, les mélanges des panneaux standard utilisés dans notre laboratoire (tableau S1).
   2. Laver les cellules avec 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% a. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400g. Jeter le surnageant (par exemple avec une pompe à vide ou d’une pipette Pasteur) et la remettre le culot dans 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
   3. Pour la mesure de la LSC : Resuspendre le culot dans 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA et ajouter 4 µL de perles vides (par exemple Spherotech, voir la table des matières) à utiliser comme contrôle négatif de la population dans l’analyse.
   4. Ouvrez le MRD ou LSC expérience lay-out sur les FACS (voir table des matières) et mesure pour WBC MRD au moins 100 000 dépendants des événements pour la mesure des échantillons de patients AML au diagnostic et 1 X 10⁶ WBC pour échantillons AML lors du suivi. Pour le LSC expériences, mesurer au moins 4 x 10⁶ WBC tant au diagnostic et de suivi pour un résultat fiable de la LSC.
   5. Enregistrer les données en utilisant un nom de fichier approprié normalisé pour l’analyse des résultats. Dresser l’inventaire des différents marqueurs mesurées sur les cellules de l’AML et sur les cellules souches AML (positif, négatif, sur/sous l’expression) et stocker ces données dans le journal de laboratoire.
   6. Dans le cas où il n’y a aucun diagnostic LAIP disponible, mesurer tous les 4 tubes de suivi pour s’assurer que toute éventuelle LAIP mesurable peut-être être identifié dans une approche différentes de la normale.
   7. Choisir la plus fiable de LAIP(s)¹³ établi au moment du diagnostic et d’acquérir autant d’événements que possible, mais > nombres minimaux définis.

5. identification de la leucémie lié Immuno-phénotypes (LAIP) : Analyses des différentes populations cellulaires

Remarque : Les fichiers FCS peuvent être analysées avec plusieurs logiciel pour la visualisation optimale des populations cellulaires différentes (voir table des matières).

1. Population de globules blancs
   1. Porte les cellules positives CD45 et les cellules qui apparaît viables, en laissant de côté basse FSC (cellules non viables, les cellules érythroïdes) au sein de l’intrigue FSC/SSC ; ces documents contiennent le WBC (Figure 3 aj’ai). Montrer le WBC et utiliser un des marqueurs primitifs (par exemple CD34 ; Figure 3 aii) afin de déterminer la position finale de ces explosions dans la région de CD45dim (Figure 3 aiii).
   2. Les cellules CD45dim de la porte et porte arrière les cellules dans l’intrigue FSC/SSC (Figure 3 bj’ai). Retirer la porte CD34 (Figure 3Bii) tout en relevant les cellules % dans cette porte que les explosions % dans votre arborescence de population dans le programme. Montrer les explosions dans un SSC/CD34 tracer et porte les cellules CD34 (Figure3Biii).
2. Lymphocytes
   1. Utiliser des lymphocytes comme témoin interne : les populations myéloïdes comme contrôle négatif et une population lymphoïde comme témoin positif.
   2. Partir de la population de globules blancs (Figure 4 a). Lymphocytes porte que la population^élevéeCD45^faible /SSC (Figure 4 b).
   3. Assurez-vous qu’il n’y a aucune cellule myéloïde dans la porte à l’aide de CD34 et CD117, CD13 ou CD33, barrière pour les cellules négatives du négatif/CD33 CD13 (Figure 4C-E). Appelez cette population « lymphocytes » dans l’arborescence de la population (Figure 4F).
3. LAIP au moment du diagnostic
   1. Les explosions de la porte et par la suite les cellules CD34 positifs un SSC/CD34 tracer et appellent ces « marqueur primitif » dans l’arborescence de la population.
   2. Tracer les cellules primitives, dans ce cas CD34 positifs et les lymphocytes dans un nouveau complot avec un marqueur lymphoïde (CD7) contre un marqueur myéloïde (CD33). Porte la population aberrante (voir lignes directrices supplémentaires fichier 1) et de les appeler « LAIP positif » dans l’arborescence de la population.
      Remarque : La finale choisie LAIP est signalée comme % LAIP sur la population de l’explosion. La sensibilité, la spécificité et la stabilité des LAIPs peuvent être établis que par un personnel avec une grande expérience dans les mesures de MRD. Le total de ces paramètres détermine la qualité de la LAIP. Exemples de quatre évaluations de LAIP différentes au moment du diagnostic sont donnés en Figure 5 A-D.
   3. Déterminer l’expression de LAIPs (% sur les explosions) et de conserver ces données dans une base de données ou fichier excel.
   4. Faire des rapports des analyses FACS et les notes des LAIPs qui doivent être utilisés à des mesures de MRD.
      Remarque : La définition de LAIPs est autorisée dans une équipe d’experts, étant donné que c’est une caractéristique essentielle pour des mesures précises de MRD à suivre.
4. MRD lors du suivi
   1. Porte les explosions comme décrit en 5.1, mais selon le point de temps après le traitement ; une évaluation correcte de cette porte peut s’avérer difficile. Mettre l’accent sur le phénotype LAIP qui a été créé au moment du diagnostic et porte la population immature.
   2. Comme indiqué en 5.1. trouver la porte de souffle correct basé sur l’aberrancy défini et être au courant de la régénération de la moelle osseuse et les expressions normales afin de les sortir la porte
   3. Répétez le même blocage stratégie de suivi à tous les points et déterminer MRD comme le pourcentage de cellules LAIP dans la population entière de globules blancs. Voir par exemple Figure 6 a et 6 b.
   4. Rapport de positivité MRD lorsque le % de MRD est ≥ 0,1 % des globules blancs. Imprimer des données analysées dans un format standard de discuter chaque semaine avec l’équipe MRD. Enregistre les résultats après qu’un consensus soit atteint. Laissez les résultats autorisée par le superviseur avant de communiquer les résultats aux cliniciens.

6. l’analyse des souches cellulaires MRD (Tube simple LSC)¹⁴

1. Analyses de la LSC au diagnostic et suivi
   1. Porte les cellules blastiques tel que décrit à la section 5.1.
   2. Comme contrôle négatif potentiel pour CD38-, porte de globules rouges-fraction (c'est-à-dire autres globules rouges après lyse, qualifiée de SSC^bas/FSC^bas et CD45^négatif). Si nécessaire, les cellules mortes et les fragments de cellules peuvent être exclus par une porte supplémentaire dans ce complot.
   3. Déterminer au sein de la porte de leucémiques souffle la sous-population avec expression de CD34. Sélection au sein de cette population le CD34⁺ CD38 cellules^– (utiliser comme coupure : bord supérieur des perles blanc d’étalonnage pour la détermination du seuil (voir tableau des matériaux), la fraction rouge ou l’utilisation 10³ comme point de coupure). Appelez cette population « CD38 progéniteurs^faible » (Figure 7).
      Remarque : Voir supplémentaire 1 fichier pour plus de détails sur le réglage des niveaux CD38-coupure-off.
   4. Déterminer au sein de cette population^faible CD38 la vraie population de cellules souches^{très faible} de CD34 + CD38, en utilisant la médiane de la fraction rouge, la bordure inférieure des perles d’étalonnage vide ou choisissez 10² comme point de coupure (Figure 7 ). Voir 1 de fichier supplémentaire pour plus de détails sur la définition des niveaux de CD38-coupure-off.
   5. Dans les deux populations, porte les cellules souches leucémiques par rapport aux normale des cellules souches hématopoïétiques (LSC vs HSC) en analysant chaque marqueur leucémique prévu dans le panneau (c.-à-d. CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 et CD56 tout en PE), CD123, CD33 et CD44).
   6. Terrain de marqueur de cellules souches d’intérêt par rapport aux autres marqueurs de cellules souches pour comparer la positivité/négativité à la positivité/négativité d’autres marqueurs et pour affiner la LSC fonction de la fréquence HSC.
   7. Déclarer le pourcentage de blastes immatures, les lymphocytes, les cellules CD34 +. Pour les marqueurs tous distincts, la liste les nombres totaux de CD38^faible et CD38^suivent et les numéros de CD38^faible et CD38^suivent qui sont des marqueurs positifs (et donc néoplasiques).
   8. Sélectionnez le marqueur qui distingue mieux normale des cellules souches hématopoïétiques par rapport à des cellules souches leucémiques pour une analyse plus approfondie. Calculer le pourcentage du CSL et HSC en pourcentage du total WBC.
      Remarque : Un pourcentage du CSL de ≥ 0,004 % est signalé comme LSC positif au moment du diagnostic, alors que la coupure soit 0,0001 % lors du suivi. Les cellules souches aberrantes gating dans des échantillons de suivi est similaire à analyse comme au moment du diagnostic, cependant, nombre de cellules dans les populations de cellules souches peut être très faible. D'où la nécessité d’acquérir suffisamment d’événements.

Results

Dans 90 % des patients de l’AML au moins un LAIP peut être identifié. Afin de générer les pourcentages exacts de cellules LAIP + des cellules primitives blast au moment du diagnostic, le réglage approprié de la porte de l’explosion est crucial et a besoin de vérification comme visualisées à la Figure 3. Un exemple de chaque patient ayant un type spécifique d’aberrancy sur les cellules CD34 + primitives est visualisé dans la Figure 5. Pour les mesures de MRD à suivi, précédemment défini LAIP + cellules sont contrôlés et définis comme le pourcentage de cellules LAIP + de la WBC. Le réglage de cette porte est donc crucial pour atteindre les bons résultats MRD. La figure 6 montre un patient qui reste en rémission complète et un patient qui les rechutes après avoir eu des résultats positifs MRD (≥ 0,1 %) après le deuxième cycle de traitement d’induction.

Le protocole actuel convient uniquement à définir des cellules souches en cellules CD34 +, car la caractérisation complète de ce compartiment a montré que la CD38-population nourrit la cellule souche plus puissante comme fraction. Afin de séparer la LSC de la HSC dans cette fraction, marqueurs additionnels sont utilisés. Des marqueurs plus souvent sélectionnés pour distinguer la LSC sont CD45RA et le canal de combi héberger 6 marqueurs spécifiques de LSC étiquetés avec PE. S’inspirant davantage les évaluations cliniques, un seuil de ≥ 0,004 % a été défini comme LSC-positif et a été associé à une survie pire au moment du diagnostic alors qu’un seuil de concentration de 0,0001 % a été utilisé au filon-up¹⁰.

Figure 1 : Moelle épinière frottis. Donateur A) sain et patient B) AML (FAB 5 sous-type). Coloration Giemsa montrée au grossissement x 100. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Corriger le matériau d’emballage pour liquides biologiques. Plus de détails sur les règlements de transport des fluides biologiques se trouvent sur le site Web¹⁵ de centres pour la prévention et la lutte contre les maladies. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Gating stratégie permettant de définir les cellules blastiques. A) CD45dim, B de Gating) Gating CD34 + blastes.

Figure 4 : Gating lymphocytes. A) cellules bleues sont WBC montré dans complot FSC/SSC, cellules B) vertes sont des lymphocytes caractérisées par CD45^haut/SSC^bas, C) exemples de négativité pour CD34, D) négativité pour CD117 et E) négativité pour CD13, F) les différents types de cellules sont présentés dans un arbre de vue d’ensemble de la population. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : LAIPs au moment du diagnostic d’AML. A) LAIP basé sur Croix aberrancy lignée (CD7 sur cellules exprimant CD33), B) LAIP basée sur la différenciation asynchrone (CD11b sur cellules exprimant CD13), LAIP C) basé sur la surexpression par rapport aux cellules normales (CD34^{très élevé} sur CD13 exprimant des cellules), D). LAIP basé sur underexpression par rapport aux cellules normales (HLA-DR^faible sur CD33 exprimant des cellules). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : LAIP suivi pendant le traitement. Définition de LAIP A) au moment du diagnostic (CD34 + / CD13 + / CD33-) et la perte de LAIP durant le suivi chez un patient qui restaient en rémission complète continue, définition LAIP B) au moment du diagnostic (CD117 + / CD7 + / CD33 +) et la persistance de LAIP durant le suivi chez un patient qui cas de rechute. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Cellules souches gating. Un) Gating de la CD34 différents + / CD38 populations issu des perles (CD38^basse est située sous le bord supérieur des perles, tout en CD38^{très faible} sont définis comme les cellules négatives vrais représentant la LSC et sont situés au-dessous de la médiane des perles), B) deux exemples de patients avec distinction entre HSC et LSC à suivi basé sur CD45RA^neg et CD45RA^pos expression. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nombreuses données sont disponibles qui montrent des signes de positivité MRD étant associée à faible taux de survie, et donc évaluation MRD peut améliorer les résultats pour les patients en fournissant des informations pronostiques supplémentaires sur lesquels les décisions cliniques peuvent être faites. Une méthode cohérente et harmonisée pour évaluation immuno-phénotypique de MRD est donc essentielle pour finalement améliorer la thérapie patiente. C’est également important lors de la comparaison des études cliniques à travers différents sites cliniques, et peut finalement aide en clinique décision rendant et agissant comme un critère clinique de substitution pour la survie globale. La notion que des orientations solides sont garanties pour des mesures précises et cohérentes de MRD a conduit à une action concertée du réseau européen de leucémie (ELN) aux directives de conception de pointe. Ce document complet sera publié fin-2017 et jouera un rôle important pour beaucoup de groupes d’étude et de laboratoires va de l’avant.

Étapes critiques au sein du protocole

Un aspect important et souvent négligé d’analyse MRD est l’impact de la qualité de l’échantillon sur une détermination précise du MRD. C’est plus évident lorsque le matériel doit être transporté à d’autres instituts dans les essais cliniques internationaux étant donnés les considérations opérationnelles supplémentaires qui doivent être prises en compte dans ce cadre. Pour réduire le risque de mélanger patient information et en temps opportun de l’administration adéquate des échantillons est crucial. Encore une fois, à ce stade du transport les formules appropriées et/ou d’importer dans les systèmes électroniques de l’hôpital avec des missions claires de l’analyse demandée est nécessaire. Notant la scène à la thérapie d’échantillonnage MRD est également crucial puisqu’il peut s’appliquer aux décisions cliniques (par exemple après le deuxième cours de thérapie) et devrait donc être définie clairement. L’utilisation des données de simulation (comme par exemple le 1er janvier par année de naissance) augmente le risque de mélanger les patients ou les analyses. Si requis par la Loi, un autre moyen anonyme d’identification devrait être utilisé.

Tous les spécimens pour immunophenotyping doivent être traités préférentiellement dans les 24 h suivant le prélèvement. Bien que pas recommandable, la moelle osseuse et des échantillons de sang périphérique peuvent encore être traités et analysés lorsqu’ils sont conservés jusqu'à 72 h à température ambiante. En outre, toutes les manipulations avec du matériel mieux peuvent être effectuées dans des conditions stériles, donc plue cryoconservation des cellules dans les biobanques (locales) reste d’actualité : de nombreuses études cliniques ont des analyses supplémentaires pour approfondir l’étude des cellules leucémiques avec concernant les caractéristiques moléculaires, immuno-phénotypique et fonctionnelles à accomplir à un stade ultérieur. Cependant les détails des biobanques ne sont pas dans le cadre de ce manuscrit.

À l’aide de MRD comme outil de diagnostic implique qu’il a besoin d’un laboratoire accrédité, non seulement pour la cytométrie en flux, mais aussi au sujet du contrôle de la qualité de l’évaluation de MRD. Cela pourrait exiger la distribution d’échantillons à des laboratoires de référence spécifique ou (re) analyse des fichiers de flux avec les mesures de MRD par des équipes de référence.

Cet article décrit les mesures les plus importantes de la collection aspirat de moelle osseuse pour détermination du MRD dans les échantillons cliniques - exigeant que toute une équipe d’experts sur des tâches spécifiques, des responsabilités et avec une communication fréquente pour compter caractérisation et analyse. Étant donné que chaque tâche est cruciale pour la procédure, il est recommandé d’avoir son logistique, y compris des protocoles à chaque laboratoire et le personnel suffisant de sauvegarde qui ont été spécifiquement formé pour la tâche. En outre, puisqu’il y a quelques étapes relativement subjectifs dans une partie de la procédure (surtout LAIP et LSC marqueur aberrant d’identification), il est essentiel d’avoir des discussions sur le résultat final de l’équipe et le rapport final autorisé par une équipe de superviseurs. Les efforts actuels poursuivent le développement de logiciels permettant de standardiser l’analyse MRD (LAIP et LSC).

Modification et dépannage

Chaque laboratoire peut avoir son propre ensemble d’anticorps qui peuvent servir à définir les différentes sous-populations, bien qu’ayant une ossature normalisé de marqueurs est essentiel pour des résultats comparables, comme indiqué dans les lignes directrices de pointe ELN document mesures MRD mentionné plus haut. Indépendamment des marqueurs choisis il y a certaines questions qui peuvent compliquer l’analyse des résultats et doivent être prises en considération.

Limites de la technique

L’identification d’expression aberrante marqueur LAIP et LSC est tout d’abord évaluée au moment du diagnostic et suivie au fil du temps (pendant et après le traitement) pour la caractérisation précise du phénotype MRD. Alors que plus de 95 % des patients peuvent être évaluées via LAIP ou LSC (ou les deux), encore certains patients ont pas LAIPs définis ou pas CD34 + CD38-CSL présentent avec CD34 négatives explosions ou ont un échantillon de diagnostic manquant. Dans ces cas, il est toujours intéressant d’essayer de mesurer MRD avec un panel d’anticorps aussi larges que le nombre de cellules disponibles permet, puis sélectionnez le plus fiable (donnant la distinction plus forte des cellules leucémiques) LAIP. Considérant qu’une proportion de patients en fin de compte une rechute ne ressemble pas complètement le diagnostic lymphoblastiques, en raison de l’hétérogénéité de la maladie de l’AML, mesurant un large panel d’anticorps au MRD est recommandé en tout cas. Ces déplacements immunophénotypiques comprennent les cellules blastiques et CSL et auraient dû être divulgués à se produire au cours de la thérapie¹⁶ et la maladie mesurable peut être basée sur ces populations dites à venir. En ce moment toutefois, il n'a pas été déterminé si toutes les sous-populations immunophénotypiques conduira à la rechute de la maladie, et donc pas fréquent de rapport MRD adaptés-thérapie repose sur ces cellules lors d’essais cliniques. Il est important de noter que le risque de manquer de LSC en raison des déplacements de la population est réduit par l’approche d’un tube dans lequel les plus importants marqueurs définissant aberrancy sont dans un écoulement cytometry (PE) canal¹⁴.

Signification en ce qui concerne les méthodes existantes

La méthode décrite dans le présent Protocole s’appuie sur la définition d’un ou plusieurs LAIPs, dont les cellules sont suivis au cours du traitement. Un inconvénient de cette méthode est qu’il a été récemment démontré que LAIP peut changer au cours du traitement. De cette façon que peuvent manquer certaines populations à venir avec différents marqueurs aberrantes. Pour contourner cela, il serait préférable de mesurer tous les marqueurs aberrants au lieu de seulement ceux trouvés au moment du diagnostic. Ce serait alors semblable à l’approche « différent de la normale » qui est utilisée par plusieurs laboratoires¹⁷.

Applications futures

Récemment, le MRD a reçu une attention supplémentaire pour la nouvelle conception d’essais cliniques. À l’ère des options de traitement spécialisé et pharmacothérapie ciblée, l’utilisation de MRD comme un résultat de mesure permettra de réduire le temps nécessaire pour établir l’efficacité clinique des traitements novateurs, permettant en fin de compte plus rapide introduction de thérapeutique urgent options dans la clinique. L’importance de la logistique appropriée et mise à exécution pratique d’une évaluation harmonisée de MRD sont cruciaux pour la réussite future de traitement AML comme la FDA étudie actuellement la possibilité d’utiliser MRD comme un critère de substitution au lieu de la survie globale mesure¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	BD Biosciences	120995496,060996589 et 013729	FACS Canto II  ;
	BD Biosciences	555360	CD7 FITC
	DAKO	F076701	CD2 FITC
	Sanquin	M1613	CD36 FITC
	BD Biosciences	332778	CD15 FITC
	BD Biosciences	335039	CD45RA FITC
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345785	CD14 PE
	Miltenyi Biotec	130-080-801	CD133 PE
	BD Biosciences	562566	Clec12a PE
	BD Biosciences	565568	Tim-3 PE
	BD Biosciences	332774	CD7 PE
	BD Biosciences	333142	CD11b PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	347222	CD34 PERCP-CY5.5
	BD Biosciences	558714	CD123 PERCP-CY5.5
	Beckman Coulter	B49221	CD117 PE-CY7
	BD Biosciences	562854	CD33 BV421
	BD Biosciences	345791	CD19 APC
	BD Biosciences	333143	CD11b APC
	BD Biosciences	345800	CD33 APC
	BD Biosciences	345807	CD38 APC
	BD Biosciences	641411	HLA-DR APC-H7
	BD Biosciences	560532	CD44 APC-H7
	BD Biosciences	562596	CD13 BV421
	BD Biosciences	348811	CD34 PE-CY7
	Beckman Coulter	A96416	CD45 Krome Orange
	BD Biosciences	655873	CD45 HV500c
	BD Biosciences	655051	billes CST  ;
	BD Biosciences	555899	Pharm solution
	BD Biosciences	644204	Multicolor CompBeads
	BD Biosciences	655051	billes
	BD Biosciences		FACSDiva software
	Cytognos		Infinicyt ;
	Spherotech	Euroflow RCP-30-5a
	Sigma-Aldrich		Tuerk solution
	Spherotech	BCP-100-5	Billes de particules d’étalonnage à blanc
;   ;	;   ;	;   ;	HSA
;   ;	;   ;	;   ;	Azide
;   ;	;   ;	;   ;	jjH2O