Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation d’élutriation centrifuge pour séparer les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes.

Résumé

La possibilité de synchroniser les cellules a été essentiel pour faire progresser notre compréhension de la régulation du cycle cellulaire. Les techniques courantes utilisées incluent la privation de sérum ; produits chimiques qui arrêtent les cellules lors des phases d’un cycle cellulaire différent ; ou l’utilisation de mitotique shake-off qui exploite leur adhérence réduite. Cependant, tous ces ont des inconvénients. Par exemple, la privation de sérum fonctionne bien pour les cellules normales, mais moins bien pour les cellules de la tumeur avec compromis cell cycle points de contrôle en raison de l’oncogène activation ou tumor suppressor perte. De même, populations cellulaires traité chimiquement peuvent abriter des dommages causés par les drogues et montrent des altérations liées au stress. Une technique qui contourne ces problèmes est élutriation centrifuge contre-courant (CCE), où les cellules sont soumis à deux forces opposées, la force centrifuge et vitesse du fluide, qui se traduit par la séparation des cellules sur la base de la taille et la densité. Étant donné que les cellules avançant à travers le cycle typiquement agrandir, CCE peut être utilisé pour séparer les cellules en phases de cycle de cellules différentes. Ici, nous appliquons cette technique à des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë primaire. Dans des conditions optimales, une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M peuvent être obtenus avec un excellent rendement. Ces populations de cellules sont idéales pour étudier des mécanismes dépendants du cycle cellulaire d’action des médicaments anticancéreux et pour d’autres applications. Aussi, nous montrent comment les modifications à la procédure standard peut provoquer des performances sous-optimales et discuter les limites de la technique. La méthodologie détaillée présentée devrait faciliter l’application et à l’exploration de la technique à d’autres types de cellules.

Introduction

Les cellules cultivées généralement croissent de façon asynchrone et des cellules individuelles sont présents dans les différentes phases du cycle cellulaire. Certains organismes présentent naturellement synchrone des cycles cellulaires ou peuvent être synchronisées par des stimuli physiologiques spécifiques. Par exemple, les noyaux dans les plasmodes géants du myxomycète Physarum polycephalum divisent dans un mode très synchrone¹et les cellules de l’algue que Desmodesmus quadricauda peuvent être synchronisés par une alternance de lumière et l’obscurité périodes². Tandis que ces organismes offrent des p....

Protocole

Remarque : ce protocole a été optimisé pour primaire B-toutes les cellules qui vont de diamètre d’environ 8 µm (phase G1) à 13 µm (phases G2/M). Ainsi, la centrifugeuse spécifique des vitesses et les débits pompe peut-être pas applicables aux cellules avec des gammes de tailles différentes. Néanmoins, les paramètres appropriés d’élutriation peuvent être estimées à l’aide de l’équation de vitesse de sédimentation. Les cellules sont cultivées dans un milieu sans sérum défini comme décrit ¹⁶ à une densité optimale de 1-3 x 10 ⁶ cellules/mL. À l’exception de la collection des fractions qui est réalisée à 4 ° C, en utilisant des t....

Résultats

Primaire toutes les cellules (3-4 x 10⁸) ont été soumis à élutriation centrifuge et recueilli dans deux fractions de lavage et vingt principales fractions, comme décrit dans le protocole. Le tableau 1 montre les données représentatives où le nombre total de cellules dans chacune des fractions ainsi que la vitesse du rotor correspondantes est présenté. Dans l’ensemble rendement dépassait généralement 80 %. Mesure du diamètre des cellules dans les différentes fractions a confirmé.......

Discussion

Nous avons décrit une méthode pour l’obtention de primaire toutes les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire à l’aide de la CCE. Dans des conditions optimales une population essentiellement pure des cellules en phase G1 et une population fortement enrichie de cellules en phases G2/M pourraient être facilement obtenus avec d’excellents rendements et cellules fortement enrichis en phase S peuvent également être obtenus si vous le souhaitez. Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide d’un primair.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline équilibrée de Hanks	Lonza	10-508Q Bouteille de	1 L
Sérum bovin Fetal Plus	Atlas Biologicals	FP-0500-A	Bouteille de 500 mL
Acide 2-napthol-6,8-disulfonique Sel dipotassique	Acros Organics	212-672-4	100 g en poudre
50 mL Tubes conciaux	Denville Scientifics	C1062-P	500/caisse
Membrane PES 0.22 et micro ; Unité de filtrage	m Millipore	SLGP033RB	250/paquet
Avanti J-26S XPI w/ Elut. Centrifugeuse non IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V	Beckman Coulter	B14544	compatible avec le système d’élutriation
Kit de rotor d’élutriateur JE 5.0	Beckman Coulter	356900	qui comprend le rotor, la clé hexagonale à poignée en T, l’ensemble de dégagement rapide (sans la chambre d’élutriation), le câble d’ancrage et l’ensemble stroboscopique
Chambre, standard, 4 ml, « A"Beckman	Coulter	356943	Chambre d’élutriation standard  ;
Tête de pompe Masterflex L/S Easy-Load	Cole-Parmer	EW-07518-10
Entraînement à vitesse variable Masterflex L/S	Cole-Parmer	EW-07528-10
Tube de pompe en silicone durci au platine Masterflex BioPharm, L/S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
25 G x 1,5 Aiguille Precision Glide	BD	305127	aiguilles stériles à usage unique
10 mL Luer-Lok seringue	BD	309604	seringues stériles à usage unique
Vi-Cell XR	Beckman Coulter	383556
tampon de coloration PI/RNase	BD Pharmingen	550825	tampon de coloration à l’iodure de propidium/RNase
cycline B1 (GNS1) anticorps monoclonal IgG	souris Santa Cruz Biotechnology	sc-245
cycline D1 (DCS-6) anticorps monoclonal IgG	de souris Santa Cruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) Anticorps monoclonal de lapin XPR	Technologie de signalisation cellulaire	8516s
GAPDH (14C10) Anticorps monoclonal de lapin	Technologie de signalisation cellulaire	2118s
Conjugué IgG (H+L)-HRP anti-souris de chèvre	BioRad	170-6516
Conjugué IgG (H+L)-HRP de chèvre		Référence 170-6515