Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

Résumé

Les auteurs décrivent une méthode pour quantifier l’agrégation des protéines mal repliées. Les détails de notre protocole des gènes induits par cellulaires stables ligne génération automatisée d’imagerie confocale et analyse d’image des agrégats de protéine. Comme application illustrative, nous avons étudié l’effet de petites molécules dans la promotion de SOD1 agrégation en temps - et dose-dépendante.

Résumé

Sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative mortelle qui peut être causée par des mutations dans la gène codant cuivre-zinc superoxyde-dismutase 1 (SOD1) héréditaires. L’instabilité structurelle du SOD1 et la détection des inclusions SOD1 positifs chez les patients familial-ALS prend en charge un rôle causal pour SOD1 mal repliées ou agrégées en pathologie de l’ALS. Dans cette étude, nous décrivons le développement d’un test d’amplification cellulaire conçu pour quantifier la dynamique d’agrégation SOD1 dans les cellules vivantes par la haute teneur en approches de dépistage. À l’aide de vecteurs LENTIVIRAUX, nous avons généré des lignées stables exprimant sauvage et mutantes A4V SOD1 tag protéine fluorescente jaune et a conclu que les deux protéines ont été exprimés dans le cytosol sans aucun signe d’agrégation. Fait intéressant, seulement SOD1 A4V stablement exprimée en HEK-293, mais pas dans les lignées cellulaires U2OS ou SH-SY5Y, forment des agrégats par traitement inhibiteur du protéasome. Nous montrons qu’il est possible de quantifier d’agrégation basée sur l’analyse de la relation dose-réponse de divers inhibiteurs du protéasome et pour suivre la cinétique de la formation d’agrégats par microscopie Time-lapse. Notre approche introduit la possibilité de quantifier l’effet des mutations ALS sur le rôle de SOD1 dans la formation globale ainsi que de dépistage pour les petites molécules qui empêchent l’agrégation SOD1 A4V.

Introduction

Agrégation des protéines est un processus biologique par lequel pliée groupe de protéines vers le haut et peuvent agir comme agents responsables de maladies neurodégénératives (amylose). Caractériser l’agrégation des protéines est essentiel pour comprendre le rôle des agrégats en dysfonctionnement cellulaire ainsi qu’en facilitant la découverte de nouveaux facteurs qui influent sur l’apparition de la pathologie. La visualisation de protéines marquées fluorescence dans les cellules vivantes est une méthode puissante qui peut aider à l’élaboration d’essais applicables à haute teneur de dépistage (HCS)^1,2,3,4.

Sclérose latérale amyotrophique (SLA) est considérée comme une maladie proteopathic causée par la présence de protéines mal repliées à la propension d’agréger et de s’accumuler dans les motoneurones en ALS familiales (fALS) et sporadiques ALS (sALS)^5,6 . Un sous-ensemble de ~ 20 % des cas de fALS sont associées avec des mutations dominantes du gène codant l’enzyme cytosolique antioxydant dismutase de superoxyde cuivre-zinc de type 1 (SOD1)^7,8. Plusieurs causes possibles de ce dysfonctionnement génétiquement dérivé ont été proposés, y compris les changements dans la structure et la fonction des variantes SOD1, comme la stabilité aberrante, augmentation du rythme qui se déroule et propension au total^{9, 10}. Notamment, la seule propriété vérifiée et potentiellement toxique partagé par les deux variantes de ALS-linked SOD1 et sauvage (WT) SOD1 est une propension accrue à former des agrégats de protéine compartimentée ou inclusions protéiques^11,12 . Mal repliée mutant SOD1, est constamment polyubiquitinée et dégradés par le système ubiquitine-protéasome. Ainsi, un faible taux d’inhibition de l’activité du protéasome conduit à l’accumulation du mutant que SOD1 regroupe^13,14, quelles structures de forme amorphe comprenant d’éléments solubles qui peuvent échanger avec soluble mutant SOD1 dans le cytosol¹⁵. En particulier, SOD1 mutant A4V (alanine au codon 4 remplacé par la valine) est la plus commune mutation causant des ALS et mène à la neurodégénérescence rapide avec un temps de survie moyen de moins de 2 ans après l' apparition de la maladie¹⁶. Biochimiquement, SOD1 A4V a une tendance accrue à la monomerize, agréger et former des pores amyloïdes ; ses pores comme agrégats ressemblent aux pores amyloïdes d’autres formes mutantes liées à la maladie, comme la synucléine α et β-amyloïde protéine¹⁷. Afin d’étudier la dynamique de l’accumulation de SOD1-granulat, méthodes de surveillance solubles et insolubles SOD1 formes restent à être développé.

Nous avons déjà montré, en utilisant l’imagerie de cellules vivantes et cellules HEK-293 transfectées de manière transitoire avec fluorescent protein-tag SOD1, que les mutations associées à ALS atteinte SOD1 dimérisation et agrégation¹¹. Bien que les systèmes d’expression transitoire peuvent fournir des informations utiles sur les résultats biologiques de la surexpression de gène à court terme, qui fournit une intégration stable des gènes désirés peut être préférable pour le développement de l’analyse. Par conséquent, vecteurs LENTIVIRAUX offrent la possibilité de conférer à l’expression des gènes à long terme et réglementé sur cellules de mammifères, ¹⁸. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la génération des lignées cellulaires stables transduites avec recombinants lentivirus portant WT et mutant SOD1 estampillés de la protéine fluorescente jaune (YFP). À l’aide de la microscopie imagerie de cellules vivantes et quantification automatisée d’agrégation SOD1, nous avons déclenché et quantifié SOD1 événements d’agrégation sur l’inhibition du protéasome.

Protocole

1. production de lentivirus

Remarque : la production et la manipulation de vecteurs LENTIVIRAUX a été réalisée conformément aux lignes directrices du National Institutes of Health (NIH) pour la recherche impliquant recombinant ADN. Le plasmide codant le sauvage et le mutant A4V SOD1 tag YFP améliorée (SOD1WT-YFP et SOD1A4V-YFP) sont décrites dans Kim et al. ¹¹ les deux produits de fusion de gènes ont été amplifiées à l’aide de la paire d’amorces PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ et 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ et inséré dans le CMV de U3 pTRIP-delta plasmide ¹⁹ en utilisant des sites de restriction XhoI et BsrGI. Dans des expériences antérieures, les cellules HEK-293 t ont été répartis selon un ratio de 1:4 1:6 tous les deux jours. Évitement de plus de 20 passages et l’entretien des cellules au moins 60 % des aides confluency pour garantir l’efficacité de transfection bon.

1. Sur 1 jour, fractionner les cellules HEK-293 t au confluent de 30 à 40 % dans une plaque de culture de tissu de 10 cm de diamètre (3 x 10 ⁶ cellules/plat) dans 10 mL de milieu de culture cellulaire (haute-glucose DMEM avec 10 % FBS et 4 mM de L-glutamine) pour la production de virus.
2. Garder la culture de tissu de 10 cm de diamètre sur plaque du jour au lendemain dans un incubateur à CO ₂ (37 ° C, 5 % de CO ₂).
3. Le jour 2, préparer une solution de transfection d’ADN contenant 10 µg de vecteurs LENTIVIRAUX (pTRIP-delta U3 CMV - YFP-SOD1WT ou - SOD1A4V-YFP) ainsi que les gènes d’emballage (plasmides (5 µg de pVSVg ; 10 µg de CMVp-dR8.71) figure 2 a) ²⁰. Ajouter 125 µL de 1 M CaCl ₂ et régler le volume de 500 µL à l’aide d’eau distillée. Doucement ajouter 500 µL de 0,05 M HEPES dans le mélange et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante.
4. Remplacer HEK-293 t moyen avec 10 mL préchauffé milieu frais de culture sans antibiotique mélangé à 1 mL de solution de transfection ADN des cellules et incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO ₂.
5. Le jour 3, remplacer la cellule surnageante avec milieu de culture fraîche.
6. Le jour 4, récolter le surnageant dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 500 x g pour enlever les cellules mortes et les débris. Plus loin, purifier le surnageant en le faisant passer à travers un filtre de 0,45 µm à l’aide d’une seringue de grand 60 mL. Immédiatement les diluer dans des aliquotes à usage unique (300 µL) et conserver à-80 ° C. Pour maintenir l’activité maximale du produit, éviter un cycle de gel-dégel.

2. Transduction LENTIVIRAUX

1. diviser la lignée cellulaire d’être infectés au confluent de 60 % (cellules HEK-293 et SH-SY5Y ; 5 x 10 ⁵ cellules / puits et U2OS ; 1 x 10 ⁵ cellules / puits) dans la plaque de culture de tissu de 6 puits dans 2 mL de milieu DMEM avec 10 % de BF.
2. Garder la plaque de culture de tissu de 6 puits dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO ₂ durant la nuit.
3. Enlever le lentivirus congelé du congélateur-80 ° C et décongeler une partie aliquote sur la glace avant chaque utilisation ; ne pas recongeler.
4. Alors que le virus décongèle, réchauffer le milieu de culture cellulaire contenant le sérum compatible avec la lignée cellulaire d’intérêt. Une fois que le virus est complètement décongelé, préparer une série de dilutions (1:3, 01:10, 01:30 et au 1/100) en DMEM dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL.
5. Afficher le volume dans les tubes de 1 mL avec médias sérum réduit.
6. Ajouter 2 µL de Polybrene (à un stock de 4 µg/µL) à 1 mL de virus/médias. Mélangez bien en pipettant également et ajouter 1 mL de mélange dans les cellules. Incuber les cellules avec le virus pendant 24 h.
7. Retirez le support de virus et remplacer par normal milieu DMEM avec 10 % FBS. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5 % de CO ₂.
8. Surveiller la croissance des cellules et modifier les milieux de culture tous les deux jours. Au confluent, étendre le plat 6 puits dans une plaque de culture de tissu de 10 cm de diamètre.
9. Une fois que les cellules ont été suffisamment étendus, semences 1,5 x 10 ⁴ cellules / puits dans 50 µL de médias DMEM sur plaques 384 puits test pour vérifier le niveau d’expression de la YFP tagué protéine par microscopie. Si la YFP protéine cellulaire expression avec balises affiche un ratio signal-bruit ≥ 3, préparer le stock de cellules pour la ligne correspondante de la cellule.

3. Temps dépendant effet inhibiteur du protéasome sur l’agrégation des protéines

Remarque : effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope automatisé (voir documentation).

1. Distribuer 0,25 µL d’inhibiteur de DMSO ou du protéasome dissous dans 100 % DMSO (Erwan, 2 mM) sur des plaques de fond plat 384 puits.
2. Manuellement semences 1,5 x 10 ⁴ cellules par puits dans 50 µL de DMEM médias sur la même plaque de dosage. La concentration finale de protéasome inhibiteur (Erwan) devrait être de 10 µM.
3. Mis en place l’unité de contrôle de l’environnement système de microscope à 37 ° C et 5 % de CO ₂. Une capture d’écran de l’installation expérimentale est illustré à la Figure 3.
4. Utiliser le microscope à champ large fluorescence mode, en utilisant le logiciel avec les paramètres suivants : GDL 20 X objectif, mode confocal-non, 4 champs/puits, avec un intervalle de capture d’une heure. À la fin de chaque série, les images capturées sont automatiquement téléchargés vers le serveur.

4. Imagerie de laps de temps pour expression YFP dans les cellules vivantes et analyse (monocanal) d’image

Remarque : les étapes suivantes décrivent l’application du logiciel (p. ex., Columbus).

Algorithme de

1. Sélectionner le cas échéant à segmenter leurs principaux objectifs (cytosol et agrégats). Si nécessaire, réglez les paramètres de seuil et le contraste du fond ( Figure 4).
À l’aide de
2. cellules de numération ' trouver des cellules ' avec un seuil individuel de 0,1 pour le canal d’intensité YFP. Déterminer les agrégats en utilisant un ' trouver des points de ' algorithme avec une intensité relative de spot YFP > 0,2 et un coefficient de couplage de 1.0.

5. Doser l’effet des inhibiteurs du protéasome sur l’agrégation des protéines sur des cellules vivantes colorés pour leur noyau (deux canaux)

Remarque : effectuez l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope automatisé. Déterminer la gamme de concentrations d’inhibiteurs du protéasome (Erwan, Epoxomicin et MG132) basé sur la valeur attendue de ₅₀ IC pour assurer un ajustement de courbe optimale.

Plaque de

1. préparer des dilutions de composés sur un polypropylène de 384 puits de stockage par la norme série de dilution de 1:3. N’oubliez pas de mélanger les dilutions composées bien pour s’assurer que les concentrations de composés sont exactes.
2. Distribuer 0,25 µL d’inhibiteurs du protéasome sur plaques vide fond plat noir 384 puits assay. Nous utilisons un gestionnaire liquid équipé d’une tête de 384-capillaire capable de transférer des volumes.
3. Graine de 1,5 x 10 ⁴ cellules / puits dans 50 µL de DMEM médias sur des plaques d’essai. Incuber les boîtes de dosage à 37 ° C et 5 % de CO ₂ pendant 24 h.
4. Ajouter 10 µL de médias DMEM (préchauffé à 37 ° C) avec coloration solution (Hoechst 33342 à un stock de 10 mg/mL) et incuber à température ambiante pendant 10 min.
5. Lancer les microsface de logiciel d’exploitation. Une capture d’écran de l’installation expérimentale est illustré à la Figure 6. Sélectionnez le " Configuration " onglet et sélectionnez 20 X objectif et le type de plaque correcte. Assurer " collier " est définie sur la valeur correcte sur l’objectif permettant la mise au point correcte avec les types de plaques différentes.
6. Sélectionner le " Microscope " onglet définir l’exposition 1 as YFP (laser à 488) et l’exposition 2 comme Hoechst (405 laser). Activer le filtre sur les deux expositions et assignez exposition 1 caméra 1 et 2 d’exposition à la caméra 2. La valeur de temps d’exposition à ~ 800 ms pour l’exposition 1 et ~ 40 ms pour l’exposition 2.
Exposition de
7. select 1. A hauteur de la mise au point 0 µm. Select " Focus ". Une fois porté, exposer la caméra 1. Régler la hauteur de la mise au point afin d’optimiser le plan de l’exposition et cliquez sur " prendre hauteur ". Changer les temps d’exposition et laser de puissance pour donner une intensité de pixels maximum de 3 000 ~. Enregistrez les paramètres d’exposition. Répéter pour l’exposition 2.
8. Select " définition de l’expérience " onglet créer un layout et sublayout. Glissez et déposez la disposition pertinente, l’exposition, image de référence, fichier skewcrop et sublayout. Sauver l’expérience.
9. Select " expérience automatique " onglet et acquisition d’images. À la fin de chaque série, les images capturées sont automatiquement téléchargés vers le serveur.

6. Analyse des deux images de couche d’image

1. Sélectionnez l’algorithme logiciel pour segmenter les objets principales (noyaux, cytosol et agrégats) ( Figure 7).
2. Choisir la méthode qui segmente les noyaux avec précision par une inspection visuelle des objets segmentés. Objets colorés à Hoechst dans le canal 1 (Ch1) serviront à déterminer le nombre de cellules. La coloration YFP du mutant SOD1-A4V dans canal 2 (Ch2) serviront à déterminer la quantité de granulats.
3. Comte de cellules à l’aide de la ' trouver des noyaux ' algorithme comme Hoechst-coloration des régions > 20 µm ², avec un facteur de division de 7.0, un seuil individuel de 0,40 et un contraste > 0.10.
4. Créer la table de données et déterminer les EC ₅₀ pour chacun des composés à l’aide de la ' régression non-linéaire ' équation dans le logiciel graphique.

Résultats

Ligne de variétés de cellule stables de génération à l’aide de lentivirus : La stratégie globale pour la surveillance des agrégats de protéine SOD1 est illustrée à la Figure 1. Dans un premier temps, nous avons généré un vecteur d’expression des gènes pour livraison stable gène SOD1 dans les lignées cellulaires (étape 1). Deux vecteurs LENTIVIRAUX codant YFP-tag SOD1 WT et SOD1 A4V (YFP-SOD1WT et SOD1A4V-YFP, respectivement) avec emballage et...

Discussion

Il existe deux approches principales pour générer des lignées cellulaires stables. Le premier prend plusieurs semaines et nécessite transitoire sélection de transfection et la résistance des vecteurs ADN génomique plasmidique intégré. Le second tire quelques heures grâce à l’utilisation de lentivirus, ce protocole se prêtent à l’expression efficace de protéine cible dans plusieurs lignées cellulaires avec peu d’effort. Le voyage-CMV vecteur¹⁹ était un vecteur soutenu à utiliser, avec l’efficacité ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
Époxomicine (C 28H50N4O7)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell software	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Operetta	Perkin Elmer	OPRT1288
Harmony Logiciel d’imagerie	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Columbus Logiciel d’analyse d’images	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell manipulation des liquides	CyBio AG	OL 3387 3 0110