Article de méthode

Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

DOI :

10.3791/56425

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4 octobre 2017

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1Automation & Logistics Management, Screening Sciences & Novel Assay Technologies, Institut Pasteur Korea, 2School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, 3Technology Development Platform, Institut Pasteur Korea

Dans cet article

Résumé

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Les auteurs décrivent une méthode pour quantifier l’agrégation des protéines mal repliées. Les détails de notre protocole des gènes induits par cellulaires stables ligne génération automatisée d’imagerie confocale et analyse d’image des agrégats de protéine. Comme application illustrative, nous avons étudié l’effet de petites molécules dans la promotion de SOD1 agrégation en temps - et dose-dépendante.

Résumé

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Sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative mortelle qui peut être causée par des mutations dans la gène codant cuivre-zinc superoxyde-dismutase 1 (SOD1) héréditaires. L’instabilité structurelle du SOD1 et la détection des inclusions SOD1 positifs chez les patients familial-ALS prend en charge un rôle causal pour SOD1 mal repliées ou agrégées en pathologie de l’ALS. Dans cette étude, nous décrivons le développement d’un test d’amplification cellulaire conçu pour quantifier la dynamique d’agrégation SOD1 dans les cellules vivantes par la haute teneur en approches de dépistage. À l’aide de vecteurs LENTIVIRAUX, nous avons généré des lignées stables exprimant sauvage et mutantes A4V SOD1 tag protéine fluorescente jaune et a conclu que les deux protéines ont été exprimés dans le cytosol sans aucun signe d’agrégation. Fait intéressant, seulement SOD1 A4V stablement exprimée en HEK-293, mais pas dans les lignées cellulaires U2OS ou SH-SY5Y, forment des agrégats par traitement inhibiteur du protéasome. Nous montrons qu’il est possible de quantifier d’agrégation basée sur l’analyse de la relation dose-réponse de divers inhibiteurs du protéasome et pour suivre la cinétique de la formation d’agrégats par microscopie Time-lapse. Notre approche introduit la possibilité de quantifier l’effet des mutations ALS sur le rôle de SOD1 dans la formation globale ainsi que de dépistage pour les petites molécules qui empêchent l’agrégation SOD1 A4V.

Introduction

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Agrégation des protéines est un processus biologique par lequel pliée groupe de protéines vers le haut et peuvent agir comme agents responsables de maladies neurodégénératives (amylose). Caractériser l’agrégation des protéines est essentiel pour comprendre le rôle des agrégats en dysfonctionnement cellulaire ainsi qu’en facilitant la découverte de nouveaux facteurs qui influent sur l’apparition de la pathologie. La visualisation de protéines marquées fluorescence dans les cellules vivantes est une méthode puissante qui peut aider à l’élaboration d’essais applicables à haute teneur de dépistage (HCS)1,2,

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Protocole

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1. production de lentivirus

Remarque : la production et la manipulation de vecteurs LENTIVIRAUX a été réalisée conformément aux lignes directrices du National Institutes of Health (NIH) pour la recherche impliquant recombinant ADN. Le plasmide codant le sauvage et le mutant A4V SOD1 tag YFP améliorée (SOD1WT-YFP et SOD1A4V-YFP) sont décrites dans Kim et al. 11 les deux produits de fusion de gènes ont été amplifiées à l’aide de la paire d’amorces PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ et 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ et inséré dans le CMV de U3 pTRIP-delta pl....

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Résultats

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Ligne de variétés de cellule stables de génération à l’aide de lentivirus : La stratégie globale pour la surveillance des agrégats de protéine SOD1 est illustrée à la Figure 1. Dans un premier temps, nous avons généré un vecteur d’expression des gènes pour livraison stable gène SOD1 dans les lignées cellulaires (étape 1). Deux vecteurs LENTIVIRAUX codant YFP-tag SOD1 WT et SOD1 A4V (YFP-SOD1WT et SOD1A4V-YFP, respectivement) avec emballage et.......

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Discussion

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Il existe deux approches principales pour générer des lignées cellulaires stables. Le premier prend plusieurs semaines et nécessite transitoire sélection de transfection et la résistance des vecteurs ADN génomique plasmidique intégré. Le second tire quelques heures grâce à l’utilisation de lentivirus, ce protocole se prêtent à l’expression efficace de protéine cible dans plusieurs lignées cellulaires avec peu d’effort. Le voyage-CMV vecteur19 était un vecteur soutenu à utiliser, avec l’efficacité .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention financée par le gouvernement coréen (MSIP) (FRO-2014K1A4A7A01074642) et le programme de soutien individuel scientifique National Research Foundation de Corée (NRF) (FRO-2013M3A9B5076486/FRO-2015R1D1A1A09057239).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ALLN (C20H37N3O4)Millipore208719
MG132 (C26H41N3O5)Sigma-AldrichC2211
Époxomicine (C 28H50N4O7)Sigma-AldrichE3652
Hoechst 33342InvitrogenH-3570
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
Opera EvoShell softwarePerkin ElmerVer 1.8.1
OperettaPerkin ElmerOPRT1288
Harmony Logiciel d’imageriePerkin ElmerVer 3.0.0
Columbus Logiciel d’analyse d’imagesPerkin ElmerVer 2.3.2
CyBi Hummingwell manipulation des liquidesCyBio AGOL 3387 3 0110

Références

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  1. Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).
  2. Honarnejad, K., et al.

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Mots-clés

Agr gation de SOD1criblage haut contenutraitement par inhibiteur du prot asomecellules HEK 293transduction lentiviralemicroscopie time lapseanalyse dose r ponsemarquage par prot ine fluorescentemicroscopie automatis e

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