Un protocole simple pour la surexpression et la purification de la cis- prényltransférase humaine optimisée par codon, dans des conditions non dénaturantes, d' Escherichia Coli , est décrit, avec un dosage d'activité enzymatique. Ce protocole peut être généralisé pour la production d'autres protéines de cis- prenyltransférase en quantité et en qualité adaptées aux études mécanistiques.
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Article de méthode
La surexpression et la purification de l'être humain Cis -prenyltransférase dans Escherichia coli
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les prényltransférases (PT) sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l'aide d'isopentényl diphosphate (IPP) par de multiples réactions de condensation. DHDDS (déshydrodolichyl diphosphate synthase) est une e-eucaryote à longue chaîne cis -PT (formant des doubles liaisons cis de la réaction de condensation) qui catalyse l'allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d'isopentényle (IPP). DHDDS est d'une importance biomédicale, car une mutation non conservatrice (K42E) dans l'enzyme résulte en une rétinite pigmentaire , entraînant finalement la cécité. Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d'acquérir de grandes quantités de DHDDS purifié, adapté aux études mécanistiques. Ici, l'utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l'optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humain fonctionnellement actif dans cis -PT entre différentes espèces suggère que ce protocole peut être appliqué pour d'autres eucaryotes cis -PT aussi bien, comme ceux impliqués dans la synthèse du caoutchouc naturel.
Introduction
Les prenyltransférases sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l'aide d'isopentényl diphosphate (IPP) via de multiples réactions de condensation 1 , 2 . Z enzymes de type catalysent la formation de doubles liaisons cis à partir de la réaction de condensation, alors que les enzymes de type E catalysent la formation de double liaison trans 3. Les cis- phényltransférases ( cis -PT, enzymes de type Z) sont classiquement classées en fonction de leur longueur de chaîne de produi....
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Protocole
1 . Clonage de cis -PT pour surexpression à E. coli
- Obtenir le vecteur d'expression pET-32b, conçu pour le clonage et l'expression de haut niveau de séquences de protéines fusionnées avec la protéine 17aa thioredoxine (TRX) 17 et la séquence de codage 18 codée par E. codifié E. coli de cis -PT à longueur totale.
- Prenez soin d'avoir un site de clivage TEV-protease (protéine du virus de la gravité du tabac) (ENLYFQ / G, où "/" indique le point de clivage) 9 suivi d'un petit lieur flexible (SGSGSG, pour améliorer l'accessib....
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Résultats
Un aperçu général de la construction utilisée ici et le processus de purification sont illustrés à la figure 1 . Les échantillons obtenus à chaque étape de purification sont représentés sur la figure 2 . Cette analyse SDS-PAGE montre la purification par étapes de DHDDS, ce qui donne un produit hautement purifié. La figure 3 montre les résultats de la SEC analytique de l'enzyme purifiée, révélant que.......
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Discussion
Le protocole décrit ici pour la purification de la DHDDS humaine fonctionnelle dans les cellules de E. coli est simple et efficace, permettant de surexprimer et de purifier la protéine en 3 à 4 jours une fois qu'une construction appropriée est disponible. De tels protocoles pour la purification des protéines sont d'une importance particulière compte tenu des percées dans le séquençage du génome, ce qui a fourni une pléthore d'informations concernant la génétique de nombreuses maladies
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été financé par le Centre d'excellence en recherche (I-CORE) de la Science Israel Science Foundation (1775/12) et la Fondation scientifique israélienne accorde 1721/16 et 2338/16 (YH) et 825/14 (DK ). Le soutien de Fields Estate Foundation à DK est très apprécié. Ce travail a été réalisé par Ilan Edri et Michal Goldenberg dans l'accomplissement partiel des exigences de thèse MD de la Faculté de médecine de Sackler, Université de Tel Aviv.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express ; lysY ; Compétent ; E. coli ; (Haute efficacité) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, sans EDTA Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow résine | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 colonne de dessalage ; | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200² | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 augmentation de 5/150 GL ; | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC ; | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Références
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., K....
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Réimpressions et autorisations
