Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre

Summary

Microinjection des embryons de poisson-zèbre et des larves est une technique cruciale mais difficile utilisée dans de nombreux modèles de poisson-zèbre. Nous présentons ici une gamme d’outils de micro-échelle pour aider à la stabilisation et l’orientation du poisson-zèbre pour microinjection et l’imagerie.

Abstract

Poisson zèbre sont apparus comme un puissant modèle de diverses maladies humaines et un outil utile pour un nombre croissant d’études expérimentales, s’étendant sur la biologie du développement fondamentale grâce aux grands écrans chimiques et génétiques. Cependant, beaucoup d’expériences, en particulier celles relatives à l’infection et des modèles de xénogreffes, dépendre de la microinjection et l’imagerie des embryons et des larves, qui sont laborieux techniques qui requièrent des compétences et l’expertise. Afin d’améliorer la précision et le débit des cours techniques de microinjection, nous avons développé une série de dispositifs microstructurées à orienter et à stabiliser les embryons de poisson-zèbre à 2 jours après la fécondation (dpf) en orientation ventrale, dorsale ou latérale avant le mode opératoire. Pour vous aider dans l’imagerie des embryons, nous avons également conçu un appareil simple avec les canaux qui orientent le poisson-zèbre 4 latéralement en parallèle contre une lamelle de verre. Ensemble, les outils que nous vous présentons ici démontrent l’efficacité des approches photolithographiques pour générer des dispositifs utiles pour l’optimisation des techniques de poisson-zèbre.

Introduction

Poisson zèbre ont émergé comme un puissant modèle pour beaucoup de domaines, des études fondamentales biologie du développement à grande échelle génétique et chimique écrans^1,2. Les manipulations génétiques courantes, telles que la surexpression du gène, précipitation, CRISPR/Cas9 mutagénèse et transgénèse dépendent de la microinjection de matériel génétique dans le zygote unicellulaire, qui a conduit au développement de simple, facile à utiliser, dans le commerce outils disponibles pour orienter et stabiliser les oeufs pour injection³. Autres approches, notamment la transplantation et ....

Protocol

Microinjection des larves a été approuvée par le sous-comité d’hôpital général Massachusetts sur recherche animalier sous protocole 2011N000127.

1. Fabrication de dispositifs

Remarque : Tous les assistée par ordinateur (CAD) fichiers de dessin utilisés pour la conception des masques de photolithographie décrites ici (Figure 1) sont disponibles en téléchargement. Voir Table des matières pour les liens.

1. Fabriquer la plaquette maître moule dans une salle blanche de classe 1 000 à l’aide de techniques photolithographiques standard⁷. Pour les tableaux de ....

Results

L’approche décrite ici illustre la conception (Figure 1) et la fabrication de dispositifs à utiliser avec 2 dpf zebrafish, utilisant photolithographique (Figure 2) et techniques de soft-lithographiques (Figure 3). Cette méthode permet de tester rapidement de nombreuses itérations de conception et les modifications et altérations et optimisation des dimensions de la microstructure à utiliser avec le p.......

Discussion

Nous décrivons ici l’utilisation de périphériques, nous avons développé récemment pour faciliter 2 dpf zebrafish microinjection⁵et mettre en place un dispositif simple montage sans gel d’agarose pour l’imagerie commode d’embryons. Ces outils mettent en évidence l’utilité des techniques photolithographiques pour la fabrication de dispositifs utiles pour les techniques de poisson-zèbre.

Nous avons identifié les dispositifs MSA particulièrement utile pour l’injection de ce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydiméthylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Pour la coulée des appareils. Le kit comprend un monomère PDMS et un initiateur
Agarose à basse température de gélification	Sigma Aldrich	A9414-10G	Pour la coulée de dispositifs d’agarose
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	Pour la coulée de moules PDMS négatifs
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	Pour anesthésier le poisson zèbre
Rhodamine Dextran 70 000 Da	ThermoFisher	D1818	Pour tracer les microinjections
Leucotriène B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Chimioattractant des neutrophiles
N-Formylméthionine-leucyl-phénylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Chimioattractant des neutrophiles
15 cm Boîte de Pétri	Fisher scientific	08-757-148	Pour couler à partir de la plaquette maîtresse
Plaques à 6 puits à fond de verre	MatTek	P06G-0-20-F	Pour les appareils d’imagerie
Microcapillaires en verre borosilicaté	World Scientific Instruments	TW-100-4	Pour les aiguilles de micro-injection Pipettes
transfert	Sigma Aldrich	Z350796	Pour le transfert d’embryons de poisson-zèbre
Embouts de microchargeur	Fisher scientific	E5242956003	Pour le chargement des aiguilles de micro-injection
Harris Uni-Core 1,5 mm	Ted Pella Inc.	15111-15	Pour perforer les ports des appareils d’imagerie PDMS
N° 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	Pour couper PDMS
Dumont N° 5 Pince	Fine Science Tools	11252-10	Pour déchoionner des embryons et casser les pointes d’aiguille de micro-injection
Micromanipulateur Marzhauser	ASI	MM33-R	Pour manipuler l’aiguille de micro-injection
Support magnétique	MSC	SPI - 87242624	Pour le montage du micromanipulateur
MPPI-3 Contrôleur de picopompe	ASI	MPPI-3	Pour le contrôle du volume et du temps des micro-injections
Microscope à fluorescence inversée EVOS ThermoFisher		EVOS FL	Pour imager les embryons injectés Microscope
de dissection	Nikon	SMZ745	Pour visualiser la micro-injection
Logiciel AutoCAD			Téléchargez les fichiers AutoCAD à partir de : https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 et sur la page wiki des protocoles de la communauté ZFIN : https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki   ;