Article de méthode

Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1+ + Tim-3 CD8+ T Cells

DOI :

10.3791/56606

⸱

8 février 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Étudier le microenvironnement tumoral peut identifier des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de la réponse clinique à l’immunothérapie. Présentée ici, une méthode innovatrice repose sur in situ par fluorescence multispectrale d’imagerie permettant d’analyser et de compter automatiquement différentes sous-populations de CD8+ T des cellules. Cette technique fiable et reproductible est adaptée pour les analyses de cohorte importante.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules immunitaires sont des composantes importantes du microenvironnement tumoral et influer sur la croissance tumorale et l’évolution à toutes les étapes de la cancérogenèse. Notamment, il est maintenant bien établi que le système immunitaire infiltrent dans les tumeurs humaines peut corréler avec le pronostic et la réponse au traitement. L’analyse de l’infiltrat immunitaire dans le microenvironnement tumoral est devenu un enjeu majeur pour la classification des patients et la réponse au traitement.

La co-expression de récepteurs inhibiteurs tels que le programme Cell Death Protein 1 (PD1 ; également connu sous le nom CD279), Lymphocyte T cytotoxique associé protéines 4 (CTLA-4), lymphocytes immunoglobuline et mucine contenant des protéines-3 (Tim-3 ; également connu sous le nom CD366) lymphocytaire Activation de gènes 3 (gal-3, aussi connu sous le nom CD223), est une caractéristique de l’épuisement de lymphocytes T. Nous avons développé une immunofluorescence multiparamétriques in situ afin d’identifier et de quantifier au niveau cellulaire la co-expression de ces récepteurs inhibiteurs de coloration. Sur une série rétrospective de tissus congelés de carcinomes des cellules rénales (CCR), à l’aide d’une technologie d’imagerie multispectrale fluorescence couplée avec une analyse d’images, il a été constaté que la co-expression de PD-1 et Tim-3 sur tumeur infiltrant CD8+ T des cellules est corrélée à un mauvais pronostic dans la RCC. À notre connaissance, cela représente la première étude démontrant que cela automatisé technologie multiplex in situ peut avoir une certaine pertinence clinique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans quelques années, l’immunothérapie est devenue un traitement très prometteur pour de nombreux types de cancers, dont le RCC. En particulier, immunothérapie, basée sur l’inhibition des points de contrôle inhibiteurs comme PD-1 et CTLA-4 a été signalé à être cliniquement efficace1,2,3,4,5, 6. anticorps monoclonaux contre CTLA-4, PD-1, ou programme mort Ligand 1 (PD-L1) ont déjà été approuvés dans plusieurs types de cancers et conduire à des réponses cliniques durables dans plus de 20 % des patients7. Néanmoins, pas tous les patients sont les intervenants, le coût du traitement est élevé, et ces traitements sont toxiques, conduisant à des potentiels graves effets secondaires de type auto-immune. Par conséquent, le défi actuel est d’identifier des marqueurs prédictifs de ces nouvelles immunothérapies. Le taux de mutations dans la tumeur, l’expression de PD-L1 ou les niveaux d’intratumorale CD8+ infiltration de lymphocytes T ont été signalés en corrélation avec la réponse clinique. Cependant, cette association est encore trop faible pour recommander l’utilisation de ces biomarqueurs cliniques en pratique clinique, à l’exception de l’essai de compagnon pour PD-L1 avant l’administration de la Pembrolizumab en non-small cell lung cancer (NSCLC) patients8 ,9,1011,12. Il a été démontré que la co-expression de nombreux récepteurs inhibiteurs comme PD-1, Tim-3, 3-Lag, et CTLA-4, induit un phénotype épuisement cellulaire et la résistance à la thérapie13,14,15. Puisque le sang périphérique n’est pas représentatif du microenvironnement tumoral, c’est d’un grand intérêt à analyser les caractéristiques phénotypiques de la cellules in situ. PD-1 et Tim-3 cellules T exprimant conjointement sont connus pour être des cellules fonctionnellement altérées dans plusieurs contextes13,16,17. Dans cette étude, l’impact pronostique de la co-expression des deux récepteurs inhibiteurs PD-1 et Tim-3 sur CD8+ T des cellules a été évaluée.

Jusqu'à présent, étudier la co-expression de multiples marqueurs sur tumeur infiltrant les lymphocytes (TILs) a principalement été réalisée par analyse en cytométrie en flux, rend nécessaire de travailler sur les tumeurs fraîches et donc excluant des analyses rétrospectives. Traditionnels in situ de coloration, coloration seule à la fois peut être effectuée, et la caractérisation du type qui a exprime les marqueurs n’est pas possible. Par exemple, PD-L1 est exprimée par de nombreux types de cellules du microenvironnement tumoral, rendant difficile de définir par immunohistochimie conventionnelle analyse quelles cellules exprimant PD-L1 sont les plus pertinents pour les études de corrélation. Dans ce travail, nous avons développé une méthode d’immunofluorescence multiparamétriques innovatrice in situ avec comptage informatique pour mettre en corrélation la co-expression de PD-1 et Tim-3 par tumeur infiltrant CD8+ T-cellules, avec des résultats cliniques dans la RCC. Cette technique présente plusieurs avantages, y compris la possibilité d’analyser au niveau unicellulaire et marqueurs multiples en même temps à l’aide d’une caméra multispectrale qui peut capturer des intervalles limités > 10 nm à travers des cristaux liquides filtres18. En outre, la procédure est automatique ce qui permet une reproductibilité entre opérateurs et une analyse raccourcie par rapport aux techniques manuelles19. Dans le domaine du cancer, plusieurs études ont rapporté convaincre plusieurs salissures des molécules immunitaires comme PD-1, PD-L1 et CD8 dans la cellule de Merkel carcinome, cancer du poumon et tête et du cou du cancer20,21,22, 23. le nombre d’éléments automatisés est possible avec une formation par l’utilisateur (étape de la détermination du phénotype). La fluorescence est mesurée dans les compartiments cellulaires (membrane, cytoplasme et noyaux).

Ici, les différents sous-ensembles d’infiltration tumorale de CD8+ T des cellules exprimant PD-1 et/ou Tim-3 dans une grande cohorte de RCC étaient comptés et les résultats ont été corrélés avec des scores de gravité clinique et les paramètres de survie. Il était également possible d’analyser l’intensité de fluorescence membranaire à la résolution cellulaire avec des données de Fluorescence de moyenne intensité (MFI) comme en cytométrie en flux. Pour autant que nous le savons, cela représente les première déclaration pronostique résultats de l’étude à l’aide de cette technique de comptage des fonction d’imagerie multispectrale.

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Protocole

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Cette étude a été réalisée conformément à la déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le Comité d’éthique local (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consentement éclairé a été obtenu par le participant dans les cohortes.

1. tissu matériel

  1. Recueillir des échantillons de tissus RCC le jour de la chirurgie. Gérer le spécimen chirurgical à température ambiante (département de pathologie).
  2. Prélever un échantillon de la tumeur d’environ 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taille dans un tube sec. Composant logiciel enfichable congélation dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
  3. Enrober les échantillons dans la température de coupe optimale composée. Section des échantillons avec un cryostat à-20 ° C en coupes épaisses de 4-6 µm. Laisser les échantillons d’air sec sur les diapositives pour 12 h et de les stocker directement à-80 ° C pour éviter la dessiccation.
  4. Vérifier la qualité de l’échantillon en affichant un hématoxyline et éosine teinté de section.

2. in Situ Immunofluorescence souillant de TILs

  1. Lignes directrices procédurales
    1. Exécutez toutes les étapes expérimentales à la température ambiante.
    2. Pour toutes démarches, effectuer des dilutions avec Tris tampon salin (SCT, voir Table des matières).
    3. Effectuer le lavage au SCT pour toutes les étapes sauf après l’incubation de l’anticorps primaire. Pour ces derniers, utilisez Tween20 Saline de tampon Tris (TBST, voir Table des matières). Pour la composition du tampon et reconstitution Voir le tableau1 supplémentaire.
    4. Utiliser une chambre humide pour les incubations d’anticorps et un pot de coloration pour le lavage.
    5. Ne laissez pas la section sécher au cours de la procédure.
  2. Prétraitement
    1. Décongeler la diapositive contenant l’échantillon de tissu et sécher soigneusement la lame autour de l’échantillon avec une serviette en papier. Délimiter la zone de réaction contenant le tissu avec un stylo de barrière hydrophobe (voir Table des matières). Sécher pendant 2 min.
    2. Fixer les échantillons dans l’acétone à 100 % pendant 5 min, sec pendant 2 min et laver avec le SCT pendant 10 min.
  3. Saturation et blocage
    1. Prétraitez les diapositives pendant 10 min avec 3 gouttes d’avidine 0,1 %, robinet et/ou flick la diapositive pour distribuer l’avidine et enlever les bulles d’air et ensuite traiter pendant 10 min avec 3 gouttes de biotine 0,01 % (voir Table des matières), tap, et/ou feuilleter. Laver avec les directives du SCT.
    2. Effectuer un blocus de récepteurs Fc. Déposer 100 µL d’un volume/volume de 5 % de sérum normal dilué dans du sérum de directives du SCT. utilisation de la même espèce d’hôte que l’anticorps secondaire ou tertiaire (voir Table des matières) ; ici, sérum de l’âne a été utilisé. Incuber pendant 30 minutes.
    3. Pendant l’incubation, brièvement tourner l’anti-CD8, PD-1 et des anticorps de Tim-3 (Table des matières). Préparer le mélange des anticorps primaires au SCT comme décrit dans la Table 2.
  4. Immunomarquage pour CD8, PD-1 et Tim-3
    1. Préparer le mélange de l’anticorps primaire. Reportez-vous à la Table des matières et la Table 2 pour les anticorps utilisés (anti-CD8, PD-1, Tim-3 et leurs anticorps secondaires correspondants) et leurs concentrations.
    2. TAP et/ou feuilleter le sérum âne restants (ajouté à l’étape 2.3.2). Incuber les lames avec 100 µL du mélange des anticorps primaires non marqué pendant 1 h dans une chambre humidifiée.
    3. Pendant l’incubation, brièvement tourner la Cyanine 5 anti-lapin AF488-anti-chèvre et anticorps anti-souris biotinylés et préparer le mélange des anticorps secondaires tel que décrit dans la Table 2.
    4. Laver les lames dans un mélange TBST pendant 5 min sec les diapositives.
    5. Incuber les lames avec 100 µL de l’anticorps secondaires pendant 30 min dans une chambre humidifiée.
    6. Préparer le mélange d’anticorps supérieur contenant streptavidine-Cy3 tel que décrit dans la Table 2.
    7. Laver les lames au SCT pour min. 10 sec les diapositives.
    8. Incuber les lames avec 100 µL du mélange anticorps tertiaire pendant 30 min.
    9. Laver les lames au SCT pour min. 10 sec les diapositives.
  5. Montage de la cellule
    1. Monter les lames dans un 4', 6-Diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate DAPI-contenant (1,5 µg/mL DAPI) le milieu avec un lamelle couvre-objet compatible pour la microscopie de fluorescence de montage (voir la Table des matières).
      Remarque : Comme contrôle négatif pour chaque expérience, une diapositive avec anticorps appariés selon l’isotype servait à la même concentration que les anticorps correspondants. Pour cette coloration, nous avons utilisé des souris IgG1 et lapin IgG anticorps de chèvre IgG contrôle négatif (voir Table des matières). Comme témoin positif, nous avons utilisé des amygdales hyperplasique humain qui sont appelé à être positifs pour les marqueurs testés, pour chaque expérience. Une coloration typique est décrite dans les résultats (Figure 1). Mono-coloration des CD8, PD-1 et Tim-3 doivent être réalisées individuellement (une coloration par lame) avec le même traitement préalable et sans DAPI. Une diapositive dans les mêmes conditions expérimentales sans anticorps et seulement le milieu de montage DAPI doit également être effectuée. Une diapositive doit être photographiée en utilisant des conditions expérimentales identiques sans n’importe quel anticorps ni DAPI.

3. fluorescence analyse et numération automatisée

  1. Acquisition d’images avec le microscope automatisé
    1. Création d’un protocole.
      1. Ouvrir le logiciel automatisé microscope et l’illuminateur de fluorescence.
      2. Dans la barre de menus, cliquez sur « Fichier », « créer le protocole, » sélectionnez « DAPI, » « FITC » et « TRITC. »
      3. Cliquez sur « Next », « Section de tissus » et cliquez sur « Suivant, » « Nom du protocole ». Choisir un clic de nom, par exemple, « CD8-PD-1-Tim-3, », « Next » et « enregistrer ».
      4. Manuellement, placez une lame sur la scène.
      5. Dans la barre de menus, cliquez sur « Configuration", » « paramètres ». Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur « set maison Z ».
      6. Ajuster la durée d’exposition avec un contrôle positif glisser c'est-à-dire un CD8, PD-1 et Tim-3 triple teint avec échantillon DAPI.
      7. Dans la barre de contrôle, cliquez sur « régler l’exposition. »
      8. Ajuster la durée d’exposition pour chaque filtre jusqu'à l’obtention d’un signal suffisant mais non saturante.
      9. Pour l’imagerie monochrome, procédez comme suit :
      10. Sélectionnez acquisition, puis sous « autofocus » filtre DAPI.
      11. Dans la « limite de zone de scan », déplacer l’objectif supérieur vers le coin supérieur gauche de la diapositive. Cliquez sur « Marque ». Faites de même pour le coin inférieur droit.
        Remarque : Cette étape delimitates la zone de faible puissance d’imagerie (imagerie LP) à 4 X ; n’oubliez pas de placer la marque et si quant à entourer tous les échantillons de la série.
      12. Pour haute puissance (HP) imaging, procédez comme suit :
      13. Sous « Autofocus », choisissez « DAPI ».
      14. Sous bande de « Acquisition », choisissez « DAPI », « FITC », « Cy3 » et « Cy5 ». Cliquez sur « OK ». Dans la barre de menu cliquez sur « Fichier », « enregistrer le protocole ».
    2. Numérisez les diapositives.
      1. Charger le protocole en cliquant sur « Fichier », « charger le protocole » dans la barre de menus. Cliquez sur « Démarrer ».
      2. Entrez « ID Lab » (emplacement de dossier pour le stockage de l’image). Entrez l’ID de diapositive pour identifier la diapositive. Cliquez sur « Suivant ».
      3. Cliquez sur « Monochrome Imaging » (pour balayer la diapositive entière sous la lumière du champ lumineux et d’acquérir des images séquentielles à l’aide d’un objectif 4 x).
        Remarque : Il produit une vue d’ensemble de niveaux de gris de la diapositive.
      4. Cliquez sur « Trouver ». Sélectionnez la zone de tissu à analyser à basse résolution (x 4) : maintenez enfoncée la touche « Ctrl » et cliquez sur un champ en utilisant le curseur pour sélectionner ou désélectionner les champs (Figure 2 a).
      5. Pour l’acquisition d’images rouge vert bleu fluorescente de chaque champ, cliquez sur « LP imagerie » (4 x imagerie).
      6. Pour la sélection de HP de champ, maintenez la touche « Ctrl » enfoncée et cliquez sur un champ en utilisant le curseur pour sélectionner ou désélectionner les champs qui correspondent à la zone des tissus qui seront numérisés à haute résolution (x 20). Sélectionnez 5 champs (Figure 2 b).
      7. Cliquez sur « HP Imaging » (20 x imagerie) pour une acquisition d’images multispectrales de chaque champ (Figure 2).
      8. Cliquez sur « Mémoire » pour stocker les images dans le dossier qui a été sélectionné au début en laaroussi.
        Remarque : Le processus est résumé et illustré à la Figure 2. Pour chaque étape (détection de tissu, sélection de champ), un algorithme peut être incrémenté et formé par l’utilisateur pour un processus de balayage automatisé ensemble.
  2. Analyse d’images de fluorescence et cellules automatisés avec logiciel d’analyse accouplée
    1. Construire la bibliothèque spectrale.
      1. Ouvrez le logiciel d’analyse de l’image.
      2. Dans le volet gauche, ouvrez « Construire des bibliothèques ». Sous « load image », cliquez sur « Parcourir » et sélectionnez une image teinté mono (p. ex., CD8/Cyanine 5).
      3. Sélectionnez le fluorophore, (p. ex., Cyanine 5). Cliquez sur « extraire ». Cliquez sur « Enregistrer » pour stocker dans la bibliothèque. Cliquez sur « Enregistrer ».
      4. Répétez le même processus pour PD-1, Tim-3 et lames DAPI mono afin d’intégrer le spectre de chaque molécule d’intérêt.
        NOTE : La bibliothèque spectrale de construction intègre le spectre pour chaque fluorophore utilisé pour les tissus spécifiques (ici, rein), mais « synthétiques » bibliothèques déjà existants peuvent être utilisés. Comme le spectre de l’autofluorescence est strictement par rapport au tissu, il est important d’effectuer une auto-fluorescence et bibliothèque spectrale par projet.
    2. Créez un nouveau projet.
      1. Dans la barre de menu, cliquez sur « Fichier », « Nouveau projet ». Dans l’onglet « Fonction Rechercher », sélectionnez « segmentation cellulaire ». Dans l’onglet « Phénotypage », sélectionnez « phénotypage ». Cliquez sur « Créer ».
      2. Intégrer les images représentatives dans le projet.
        1. Dans l’onglet « Fichier », cliquez sur « Ouvrir l’image ». Le choix de 10 à 30 images représentatives de toute la série. Ajouter la diapositive non teinté pour supprimer l’autofluorescence. Sur le panneau de droite : source de la bibliothèque select. Sélectionnez un fluorophore et choisir ceux qui correspondent à la bibliothèque spectrale déjà construite.
      3. Pour enlever le tissu autofluorescence, cliquez sur le bouton « AF » et puis sélectionnez la zone d’autofluorescence dans la diapositive vide.
      4. Traitement d’images et production d’image composite.
        1. Cliquez sur « Préparer ensemble » pour intégrer la bibliothèque de fluorescence et les spectres de l’autofluorescence pour générer l’image composite (Figure 3). Cliquez sur l’icône « œil » pour ouvrir le panneau « éditeur de vue » et sélectionner les données affichées : sélectionnez les marqueurs CD8, PD-1, Tim-3 et DAPI. Supprimer l’autofluorescence. Suivez les étapes présentées par le logiciel.
      5. Segmenter les cellules.
        1. Pour segmenter les cellules, dans le « Compartiment », sélectionnez « Noyaux » et « Membrane ». Dans l’onglet « Noyaux », figurant le contre-colorant nucléaire DAPI.
        2. Dans l’onglet « Maximum et Minimum taille (px) » Entrez « 40 » et « 176 » comme les tailles minimales et maximales, respectivement. Pour le signal « Minimum », définir « 0,13 ». Dans l’onglet « Split », définir « 2,60 ». Dans l’onglet « Noyaux », définir « 0.81 ». Sélectionnez « utiliser le signal de la membrane à l’aide de segmentation ».
        3. Cliquez sur le « Segment de cellules » dans la partie inférieure de l’écran. Vérifiez la segmentation des noyaux et des membranes des cellules et réessayer avec des paramètres différents, si elle ne correspond pas à la fluorescence DAPI et la membrane des cellules.
          Remarque : Le logiciel reconnaît les cellules avec le nucléaire DAPI souillant et selon la taille de la cellule. Ajustez les paramètres de la cellule (taille, split, pixels) selon le projet.
      6. Phénotype des cellules.
        1. Dans l’onglet « Phénotype », cliquez sur « Ajouter ». Créer des catégories de phénotype cellulaire : CD8 (point bleu) / CD8-PD-1 (point rouge) / CD8-PD-1-Tim-3 (point vert) / autre (point noir) (Figure 4).
        2. Sélectionner plus de 5 exemples de cellules de chaque catégorie. Cliquez sur « Classificateur de Train ».
          Remarque : Cette opération génère un algorithme de classification statistique par le logiciel.
        3. Cliquez sur « Tous de phénotype » pour obtenir le phénotype de chaque cellule.
          Remarque : Le logiciel donne le phénotype d’une cellule avec un intervalle de confiance (IC) de précision.
        4. Améliorer l’algorithme par le logiciel de formation jusqu'à ce que la différence entre le œil et décompte automatisé est concordante (erreur < 5 %). Choisissez un CI qui soit acceptable pour les cellules d’intérêt.
          NOTE : Nous avons choisi de faire la formation sur la base de 55 % CI comme acceptable.
      7. Enregistrez le projet et l’algorithme.
      8. Sous « Fichier », sélectionnez « projet ». Nommez-le et cliquez sur « Enregistrer ».
    3. Effectuer l’analyse de lots de la série.
      1. Sélectionnez « Analyse de lot ». Sélectionnez le projet. Ajouter les images à analyser. Sélectionnez un dossier de stockage pour les données. Cliquez sur « Exécuter ». Vérifier la qualité de l’image composite. Vérifiez le phénotypage pour toutes les images de la série.
        Remarque : Le logiciel d’analyse accouplée image intègre tous les signaux de compartiments (membrane/cytoplasme/noyaux) des cellules. L’étape de la détermination du phénotype est cruciale, bien que la formation de l’algorithme peut être un pas beaucoup de temps. Toutes les données de chaque image sont dans un fichier .txt. Toutes les données d’une cellule (en particulier son phénotype donné par son CI) sont sur une seule ligne. Pour chaque diapositive, l’acquisition d’images et comtes subséquentes ont été effectuées sur 5 domaines.
  3. Intégration des données brutes et de génération du comptage cellulaire automatisée
    1. Calculer les données avec un programme statistique.
      1. Calculer toutes les données à partir des 5 images correspondant aux 5 domaines analysés pour 1 patient. Utiliser une plateforme de statistique et ont un statisticien expérimenté, le gestionnaire de données ou Scientifque de l’analyse. Créer un script qui compte automatiquement les cellules selon leur phénotype, sélectionnant les CI > 55 %.
      2. Mettre tous les fichiers .txt de la série dans le même dossier.
    2. Extraire les données.
      1. Mettre tous les fichiers .txt dans un dossier. Exécutez le script automatique construit à l’étape 3.3.1. Ouvrez le fichier .csv de sortie généré par le script de R. Enregistrer en tant que format de .xl. La sortie rassemble le nombre de cellules pour chaque phénotype (c.-à-d., CD8 seul, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) pour chaque patient.
      2. Calculer le nombre moyen de cellules pour chaque patient par champ : diviser le nombre de cellules par le nombre de champs (c'est-à-dire5) pour normaliser le nombre de cellules pour chaque patient par champ.
      3. Calculer le pourcentage de cellules de PD-1+ chez total CD8+ T cellules et Tim-3 de PD-1+ + chez total CD8+ T des cellules. Voir la Figure 5 pour le résumé de cette étape.
        Remarque : R langue (ou autre logiciel de programmation de choix) est nécessaire pour créer et exécuter les commandes correctement, et un utilisateur expérimenté ou un statisticien/données scientifique est donc essentiel. Le programme de R permet de calculer les données d’un même patient, mais le nom des fichiers .txt 5 d’un patient devrait avoir un début identique, correspondant à un identifiant unique du patient.
  4. Analyse statistique
    1. Utiliser un logiciel de statistique pour l’analyse statistique des résultats.
    2. Effectuer des analyses statistiques appropriées à l’aide d’un statisticien.
      1. Utilisation du Wilcoxon non-paramétrique signé rang tests comparaison d’IFM PD-1 entre les deux phénotypes cellulaires (Figure 6). Corrélation entre les covariables et les caractéristiques histologiques et test khi-deux de Pearson, un.
      2. Utilisez une méthode de Kaplan-Meier pour estimer la survie sans progression et les modèles de régression de Cox pour estimer les effets des covariables sur les résultats de temps-à-l’événement, tels que la survie globale et la survie sans maladie.
      3. Examiner les p-valeurs inférieure à 0,05 comme significatif.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant le protocole général décrit ci-dessus, l’étude visait à quantifier intratumorale CD8+ T cells co exprimant les récepteurs inhibiteurs PD-1 et Tim-3 dans les tissus de patients atteints d’hypernéphrome et de corréler les résultats avec les résultats cliniques25congelés.

Optimisation de la coloration de CD8/PD-1/Tim-3 :

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modifications et dépannage :

La qualité du tissu est un paramètre important ; Il peut être facilement vérifiée par coloration hématoxyline et éosine.

Un des avantages de la technique est la possibilité de salissures multiplexé, mais pour éviter tout débordement de fluorophore, il est recommandé de choisir des longueurs d’onde d’émission avec delta de 10 minimum nm. Ici, parce que nous avons eu 4 salissures y compris DAPI, nous avons choisi d’étaler ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut National du Cancer (INCA) (HE), Ligue contre le Cancer (HE), Université Sorbonne Paris Cité (HE), ANR (Selectimmunco) (HE), Labex Immuno-oncologie (HE), SIRIC CARPEM (CG, ET). GDE a été financée par une bourse de la Fondation ARC. EV et CD ont été financées par une bourse de l’APHP (recherche de bourse d’année). ChB est financé par une bourse de recherche de l’Université Sorbonne Paris Cité (contrat doctoral). Les auteurs remercient Bristol Myers Squibb pour leur financement dans ce projet. Les auteurs remercient le département de pathologie de l’Hôpital Européen Georges Pompidou et Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel et Gisèle Legall). Les auteurs remercient la plate-forme de l’histologie des rendez-vous, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vectra 3 Imagerie Quantitative Pathologique Automatisée  ;Perkin ElmerCLS142338
l’analyse cellulaire inForm 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen stylo de délimitationDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 comprimés
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7,6 100 comprimés
Système de blocage de la biotineDakoX0590Avidin 0,1 % et Biotine 0,01
d’ânesse normalJackson Immunoresearch017-000-001Concentration de 5 % vol./vol. Fluoroshield
avec DAPISigma-aldrichF60571.5 µ ; g/mL concentration
Knittel lamelle en verreKnittel Glä ; ser,10003924x60 mm 100 lamelles
Lapin anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055utilisation chez 4µ ; g/mL
Souris anti--1 Clone NATabcam ab52587utilisation à 2 µ ; g/mL
Chèvre anti-Tim-3R& DAF2365utilisation à 3 & micro ; g/mL
Rabbit anti--L1 Clone SP142Roche7309457001utilisation chez 1 µ ; g/mL
Souris AF647 marquée pan- Clone de kératine C11Signalisation cellulaire4528utilisation à 0,5 & micro ; g/mL
Chèvre anti-humain gal9R& DAF2045utilisation à 0,3 & micro ; g/mL
Cyan 5 âne conjugué anti-lapinJackson Immunoresearch711-175-152utilisation à 5 & micro ; g/mL
de F(ab' biotinylé 2) âne anti-souris IgGJackson Immunoresearch715-066-150utilisation à 3 & micro ; g/mL
Alexa Fluor488 âne conjugué anti-chèvre IgGabcamab150133utilisation à 5 µ ; g/mL
de streptavidine Amersham marquée Cy3PA43001utilisation à 3 & micro ; g/mL
souris témoin négatif IgG1DakoX0931utilisation à 2 µ ; g/mL
d’IgG de sérum de chèvreSigma-aldrichI5256à 3 & micro ; g/mL
d’IgG provenant du sérum de lapinSigma-aldrichI5006à 4µ ; g/mL
 % sérum

Références

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Multiplexed ImmunofluorescencePD 1 Tim 3 Co expressionTumor Infiltrating CD8 T CellsFluorescence Multispectral ImagingCell Segmentation AnalysisPhenotyping AlgorithmAutofluorescence RemovalRenal Cell CarcinomaImmune Checkpoint MarkersClinical Prognosis Correlation

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