Method Article

Méthodologie pour l’Induction de l’expectoration et traitement en laboratoire

DOI:

10.3791/56612

⸱

December 17th, 2017

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1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group, University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines), University of Liege

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici la technique de l’induction de l’expectoration. Ce protocole explique également les expectorations traitement pour effectuer un nombre d’éléments différentiels et de recueillir les crachats surnageant et les cellules pour une analyse ultérieure.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique d’induction de crachat et de traitement est une méthode non invasive reconnue permettant la collecte et l’analyse des cellules des voies respiratoires, ce qui est intéressant dans diverses maladies respiratoires comme l’asthme, maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), toux chronique, ou fibrose pulmonaire idiopathique. Cette technique est bien toléré, sûre et non invasive, mais est actuellement limitée aux services de recherche et de centres spécialisés dans la pratique clinique car il est techniquement difficile, chronophage et nécessite du personnel qualifié. Le taux de réussite de l’induction de l’expectoration et l’analyse est d’environ 80 %.

Nous décrivons ici le traitement d’induction et laboratoire des échantillons de crachat. Expectoration est induite par l’inhalation d’une solution saline hypertonique ou isotonique avec salbutamol. Pour le traitement, nous utilisons la technique crachat tout. Le dithiothréitol (DTT) est utilisé pour permettre le mucolysis des échantillons de crachat. L’objectif principal du traitement de l’expectoration est d’obtenir un nombre d’éléments différentiels afin d’étudier les types de cellules présents dans la lumière des voies aériennes. D’autres analyses peuvent être effectuées sur les expectorations surnageante et cellules de crachat, qui peuvent permettre également enquête sur les processus inflammatoires et les mécanismes immunitaires. Exemples : étude des médiateurs dans les expectorations surnageante et effectuant un large spectre d’analyse sur les cellules de crachat comme la cytométrie en flux, génomique et protéomique.

Enfin, des résultats représentatifs de l’analyse de l’expectoration témoins sains, asthmatiques et les patients BPCO sont présentés.

Introduction

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Plusieurs méthodes sont utilisées pour étudier l’inflammation des voies respiratoires : direct des mesures (telles que les biopsies bronchiques ou lavages broncho-alvéolaire) et des méthodes indirectes (comme l’évaluation des symptômes, du sang échantillon pulmonaires et analyse de tests de fonction)1. Les techniques directes ont l’avantage d’évaluer avec fiabilité l’inflammation des voies respiratoires, mais elles sont envahissante et pas réalisable à grande échelle en raison de l’inconfort pour le patient et le risque encouru1. En ce qui concerne les méthodes indirectes, ils mal corrèlent avec l’évaluation directe de l’inflammation des voies respiratoires1.

Collection de l’expectoration est une autre façon à des échantillons de cellules des voies respiratoires et permet l’évaluation directe de l’inflammation des voies respiratoires. Néanmoins, produisant des crachats spontanément peut conduire à des échantillons de mauvaise qualité et n’est pas possible pour tous les patients2. Ce problème a été résolu en utilisant une solution saline hypertonique par ultrasons nébulisée pour induire la production de crachat2. Cette méthode a été initialement utilisée chez les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) pour le diagnostic de pneumonie à Pneumocystis carinii pneumonie3 et a été adaptée pour des sujets sains et les asthmatiques en 19924. Induction de l’expectoration est également possible chez les patients plus graves à l’aide de sérum physiologique isotonique5. Bien que généralement bien toléré, l’inhalation d’une solution saline peut provoquer des bronchospasmes chez les patients hypersensibles airways5. Par conséquent, il est recommandé d’administrer un agoniste bêta de courte durée d’action avant la procédure1. En outre, nous avons déjà montré que l’ajout de salbutamol à la solution saline dans le nébuliseur ultrasonique encore diminué ce risque6. Les avantages de l’induction de l’expectoration est qu’il est non invasif2 et sécuritaire lorsqu’il est approprié précautions5.

Pour le traitement des échantillons d’expectoration, deux méthodes sont actuellement utilisées dans la littérature : la technique de crachats entière et la sélection de fiche7. Dans notre laboratoire, la technique de crachats tout est exécutée. L’objectif principal du traitement de l’expectoration est d’obtenir un nombre d’éléments différentiels afin d’étudier le type d’inflammation présent dans la lumière des voies aériennes. Cependant, beaucoup d’autres analyses sont également possibles étudier davantage les processus inflammatoires et les mécanismes immunitaires, en étudiant les médiateurs dans le surnageant de crachats8 ou en effectuant une étude détaillée sur les cellules de crachat (par exemple , débit cytometry9, cell cultures10,10de la génomique, protéomique10, immunocytochimie7, in situ hybridation7, etc.)

La technique d’induction de l’expectoration et d’analyse est actuellement limitée à la recherche de services et les centres spécialisés dans la pratique clinique parce qu’il est techniquement difficile, chronophage et nécessite un personnel qualifié1. Inflammation des voies respiratoires peut-être être étudiée grâce à cette méthode pour diverses maladies respiratoires comme l’asthme, maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), une toux chronique ou de fibrose pulmonaire idiopathique,11.

Protocol

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Toutes les méthodes décrites dans cette section ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’hôpital de l’Université de Liège et tous les sujets en bonne santé a donné consentement éclairé pour la participation.

1. Induction de l’expectoration

  1. Spirométrie pré et post bronchodilatateur
    1. Effectuer une spirométrie (forcé du volume expiratoire maximal en 1 seconde [FEV1] et la manœuvre de la capacité vitale forcée [Rec]) selon l’American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) critères standard12.
    2. Administrer 400 µg de salbutamol par voie inhalée d’un aérosol-doseur (MDI) à travers un dispositif espaceur.
      Remarque : Chez les adultes, indésirables de salbutamol par voie inhalée comprennent les tremblements et la tachycardie13.
    3. Répétez spirométrie (FEV1 et la manœuvre de CVF) 15 min plus tard, selon les critères standard de ATS/ERS12.
  2. Préparation du nébuliseur ultrasonique
    Remarque : Le nébuliseur doit être soigneusement nettoyé et désinfecté avant chaque utilisation selon les instructions du fabricant.
    1. Remplir la chambre de nébulisation d’eau distillée jusqu’au niveau recommandé.
    2. Placez une tasse propre dans la chambre de nébulisation.
    3. Couvrir la coupe avec le couvercle approprié.
    4. Remplir la tasse avec soit 50 mL de solution saline hypertonique (5 %) pour un patient présentant après utilisation du bronchodilatateur FEV1 > 65 % de la valeur ou 50 mL de solution saline isotonique (0,9 %) pour un patient présentant après utilisation du bronchodilatateur FEV1≤65 % prévus.
    5. Ajouter 1,75 mL de solution de sulfate de salbutamol (5 mg/mL) à la coupe.
    6. Connecter les tubes et valves conformément aux instructions du fabricant.
  3. Collection de nébulisation et expectorations
    Remarque : Effectuez la technique sous surveillance médicale.
    1. Expliquer la procédure pour le patient.
    2. Demander au patient d’utiliser un pince-nez.
    3. Allumez le nébuliseur et sélectionnez le niveau le plus bas des paramètres d’aérosol et ventilateur.
    4. Demander au patient d’inhaler de l’aérosol à travers l’embout buccal avec la marée de respirer pendant 5 min.
      NOTE : Paramètres d’aérosol et le ventilateur peuvent être augmentés selon la tolérance du patient.
      1. En cas de toux insupportable ou nausées, mettre fin à la procédure et passez à l’étape 1.3.5.
      2. Dans le cas d’une oppression thoracique ou une gêne respiratoire, passez à l’étape 1.3.8.
    5. Désactiver le nébuliseur.
    6. Demandez au patient d’enlever la pince nez, rincer la bouche avec de l’eau et se gargariser deux fois avant de jeter dans l’évier.
      NOTE : Les cellules de salive peuvent contaminer l’échantillon de crachats et conduire à un échantillon inutilisable.
    7. Demander au patient de la toux des crachats dans un récipient en plastique.
    8. Effectuer une spirométrie (manœuvre expiratoire forcé) pour mesurer la FEV1.
    9. Évaluer la chute de1 FEV comme suit : (FEV1 mesuréà étape 3.8 [mL]) - (après utilisation du bronchodilatateur FEV1 mesurée à l’étape 1.3 [mL]) / (après utilisation du bronchodilatateur FEV1 mesurée à l’étape 1.3 [mL]) * 100.
      1. Si le FEV1 tombe à 20 % ou plus de la valeur après utilisation du bronchodilatateur, interrompre la procédure. Mesure FEV1 à nouveau 10 min plus tard. Si le FEV1 tombe 20 % ou plus, demandez au médecin de bromure d’ipratropium nébulisée (0,25 mg/2 mL) de gérer et maintenir le patient en observation médicale. Passez à l’étape 1.3.10.
      2. Si le FEV1 n’est pas de 20 % ou plus de la valeur après utilisation du bronchodilatateur, répétez les étapes de 3,2 à 3,9 une à trois fois pour atteindre un temps de nébulisation total de 10 à 20 min.
        NOTE : Le temps de nébulisation total dépendra de qualité (présence de bouchons ou de parties visqueux) et quantité de l’échantillon de crachats. Si la qualité des échantillons et/ou la quantité est faible après 10 min de nébulisation, la procédure devrait être étendue pour atteindre un temps de nébulisation total de 15 à 20 min.
    10. Conserver l’échantillon de crachats au réfrigérateur jusqu’au traitement.

2. expectorations traitement

NOTE : Traiter les crachats dans les 3 heures d’échantillonnage pour la viabilité cellulaire optimale.

ATTENTION : Porter une blouse de laboratoire, gants et lunettes de protection.

  1. Préparations préliminaires
    1. Réaliser une dilution de 10 fois de la solution concentrée le dithiothréitol (agent mucolytique) avec de l’eau distillée stérile pour obtenir 10 mL d’une solution de 6,5 mM, conformément aux instructions du fabricant.
      NOTE : Afin d’éviter la solution concentrée le dithiothréitol mélange avec l’air ambiant, retirer la solution dans le flacon avec une seringue stérile et une aiguille. Une fois ouvert, le flacon de solution concentrée doit être conservé à température ambiante et utilisé dans les 5 jours. La solution diluée est préparée tous les jours.
      ATTENTION : En raison des risques d’irritations oculaires et cutanées, porter un équipement de protection (vêtements, gants et lunettes de protection).
    2. Réaliser une dilution 5 fois de la solution de bleu de trypan (0,4 %) avec de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (SPD) pour obtenir une solution de 0,08 %. Gardez cette solution diluée à la température ambiante et dans les 2 semaines.
      ATTENTION : À cause de risques cancérigènes, porter un équipement de protection (vêtements, gants et lunettes de protection).
  2. Collection d’expectorations surnageant
    1. Transférer les crachats entier dans un tube en plastique fond conique de 50 mL et peser l’échantillon.
    2. Ajouter un poids de 3 voies de solution de SPD.
    3. Lentement le vortex l’échantillon pendant 30 s.
    4. Centrifugeuse à 800 x g et 4 ° C pendant 10 min.
    5. Filtrer l’échantillon par le biais de 2 couches de gaze stérile et recueillir le surnageant dans un tube en plastique de 50 mL fond conique.
    6. Aliquoter le surnageant dans 2 mL plastique tubes et les stocker à-80 ° C.
      NOTE : Surnageants échantillons sont utiles pour analyser les composants phase fluide expectorations.
  3. Expectoration Mucolysis
    1. Si nécessaire, ajouter le SPD dans le culot cellulaire pour atteindre un volume total de suspension cellulaire de 5 mL.
    2. Diluer la suspension cellulaire et 1 volume de 6,5 mM dithiothréitol. Utilisez un rocker de banc au rock de la suspension cellulaire pendant 20 min à température ambiante.
      1. Répéter au moins 3 fois avec le SPD.
    3. Centrifuger la suspension cellulaire dilué à 550 x g et 4 ° C pendant 10 min.
Jeter le surnageant.
  • Resuspendre le culot dans environ 1 mL de SPD.
  • Évaluation des propriétés qualitatives de l’échantillon de crachats (concentration cellulaire, contamination des cellules squameuses et viabilité par la méthode d’exclusion au bleu de Trypan) par le comte hémocytomètre
    1. Évaluer et noter le volume exact de la suspension cellulaire.
    2. Ajouter 50 µL de suspension cellulaire dans 50 µL de la solution de bleu de trypan 0,08 % et homogénéiser.
    3. Mettre l’échantillon sous la lamelle d’un hémocytomètre (chambre Thoma) et placez-le sous le microscope optique (X 400).
    4. Compter les cellules malpighiennes, les vie non-squameuses (cellules non colorés) et les cellules mortes non-squameuses (cellules de couleur bleu).
      Remarque : En cas de densité trop élevée ou trop basse, se concentrer ou diluer la suspension cellulaire et répétez les étapes 2.4.1-2.4.3.
    5. Évaluer la concentration en cellules de la suspension, le pourcentage de cellules malpighiennes et le pourcentage de viabilité de cellules malpighiennes-non.
      Remarque : Calculer le total non épidermoïde comte/g d’expectorations : cellule de concentration de la suspension (étape 5.4) * volume de la suspension cellulaire (étape 4.8) * % de cellules malpighiennes-non / poids de l’échantillon de crachats (étape 2.2.1).
  • Préparation d’un cytospin colorée faites glisser avec la suspension cellulaire et le stockage des cellules résiduelles, si nécessaire
    Remarque : Si la suspension de cellules contient plus de 80 % de carcinome cellules, l’échantillon est considéré comme pauvre qualité et impropres à une diapositive de cytospin14. Dans ce cas, interrompre le traitement et envisager cet exemple infructueuse.
    1. Diluer une aliquote de la suspension cellulaire avec SPD d’obtenir au moins 350 µL d’une suspension de cellules à 500 000 cellules/mL.
    2. Assembler le concentrateur de cellules conformément aux instructions du fabricant.
    3. Remplir chacun des 3 compartiments du concentrateur portable avec 100 µL de cette suspension cellulaire.
    4. Dans un cytocentrifuge, tournent pendant 2 min à 150 x g et à température ambiante. Jeter le surnageant.
    5. Démonter le concentrateur de cellules conformément aux instructions du fabricant.
    6. Laisser sécher la lame à l’air.
      Remarque : À ce stade, les cellules résiduelles peuvent être stockés dans une mémoire tampon suffisant si nécessaire pour d’autres expériences.
    7. Tache la diapositive avec une coloration commerciale nécessaire (voir la Table des matières), conformément aux instructions du fabricant.
    8. Monter la lame avec un milieu de montage approprié et une lamelle couvre-objet.
    9. Placez la lame au microscope optique (X 600) avec immersion dans l’huile.
    10. Compter au moins 500 cellules non-squameuses : neutrophiles, éosinophiles, les macrophages, les lymphocytes et les cellules épithéliales.
      Remarque : La numération différentielle est habituellement réalisée par un seul ou deux dédié et formé des observateurs afin de limiter les écarts inter-observateurs.
    11. Enregistrement des valeurs absolues et les pourcentages de chaque type de cellule.

    • Results

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    Hémocytomètre
    Une image typique est illustrée à la Figure 1 qui est visualisée au microscope à l’aide de l’hémocytomètre. Cellules malpighiennes sont facilement identifiables, car ils sont beaucoup plus grandes que les cellules non-squameuses. Ces cellules malpighiennes sont des cellules épithéliales, venant de la bouche. Les deux types de cellules sont colorées par le bleu Trypan quand il est mort. Attention il faut éviter le comptage des levures, de bactéries et de débris.

    figure-results-1
    Figure 1 : Hémocytomètre photo montrant (A) une vie non-spino-cellulaire, (B) une mort non-spino-cellulaire et (C) un carcinome cellulaire. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Cytospin diapositive : la Figure 2 montre une image représentative d’une diapositive cytospin obtenue après transformation des expectorations. Les différents types de cellules (neutrophiles, éosinophiles, les macrophages, les lymphocytes et les cellules épithéliales) peuvent être différenciés par leur morphologie et leur coloration. Dans certains cas, la contamination par des cellules squameuses peut-être être importante et, si le pourcentage de cellules malpighiennes est supérieur à 80 %, l’échantillon est considéré comme échoué (Figure 3).

    figure-results-2
    Figure 2 : Photo de diapositive Cytospin montrant (A) un neutrophile, (B) un macrophage, (C) un éosinophile, (D) un lymphocyte et (E), une cellule épithéliale. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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    Figure 3 : Exemple d’une lame de cytospin de mauvaise qualité avec > 80 % des cellules squameuses. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Taux de réussite
    Dans notre département, le taux de réussite de la procédure (combinant une induction réussie et un cytospin lisible), basé sur un échantillon de 1 129 patients (patients BPCO, asthmatiques ou sujets sains), est de 82 % (924/1 129). Dans une analyse de sous-groupe selon le type de patients, le taux de réussite est de 75 % (57/76) chez des sujets sains, 82 % (827/1 004) chez les asthmatiques et 82 % (40/49) chez les patients BPCO.

    Résultats chez des sujets sains
    Dans une analyse rétrospective d’une série de 289 sujets sains de notre département, la médiane (intervalle interquartile) poids expectorations était 3,72 g (intervalle interquartile de 2,46 et 5,54 g) et le comte/g non-spino-cellulaire total médian de crachats 0,59 x (10)6 écart interquartile de 0,37 x 106 - 1,29 x 106).

    Dans ces sujets sains, la proportion de cellules malpighiennes est faible à 19 % (10 % - 34 %) et la viabilité est élevée à 66 % (54-78). Concernant le pourcentage des types de cellules différentes, les résultats sont résumés dans la Figure 4 a. Nous pouvons observer que le pourcentage des macrophages (49 % [31-68 %]) est plus élevé que le pourcentage des neutrophiles (34 % [14 % - 60 %]), tandis que les pourcentages de lymphocytes (2 % [1-3 %]), les éosinophiles (0 % [0 % - 0 %]) et les cellules épithéliales (4 % [2-11 %]) sont faibles. Ces résultats sont similaires lorsque les données sont exprimées en valeurs absolues (Figure 4 b).

    figure-results-4
    Figure 4 : Résultats représentatifs du comte cellulaires différentielles observées chez des sujets sains, exprimées en pourcentages (A) ou en valeurs absolues (B). Résultats sont affichés plus médiane (intervalle interquartile). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Il est également important de tenir compte de l’âge des patients. En effet, une forte corrélation existe entre l’âge du patient et la proportion des neutrophiles dans des échantillons de crachat (Figure 5). De même, lors du classement des patients selon les groupes d’âge de 10 ans (Figure 6), nous avons observé une augmentation significative du pourcentage de neutrophiles, groupe d’âge de plus en plus. Par conséquent, cette variable doit être considérée lorsque l'on compare les résultats de différentes cohortes, et il faut faire attention à l’adéquation entre les sujets.

    figure-results-5
    Figure 5 : Corrélation entre âge et expectorations pourcentage neutrophil. On a calculé la corrélation avec le test de Spearman. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    figure-results-6
    Figure 6 : Evolution du pourcentage selon la catégorie d’âge neutrophile. La valeur prédictive de l’ANOVA a été < 0,0001 pour la comparaison des neutrophil pourcentage entre classes d’âge. Plusieurs comparaisons ont été faites avec le test de comparaisons multiples de Dunn. Les valeurs p sont représentés comme suit : * p < 0,05, ** p < 0,01, et *** p < 0,001. Résultats sont affichés plus médiane (intervalle interquartile). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Résultats chez les patients souffrant de maladies respiratoires
    La technique de l’expectoration induite est couramment utilisée pour évaluer le profil de cellules inflammatoires chez les patients asthmatiques.Cette technique peut également être appliquée aux patients souffrant de BPCO, une autre maladie respiratoire inflammatoire. Lorsque l'on compare les sujets sains, asthmatiques et les patients BPCO (les 3 groupes étant appariés pour l’âge, le sexe et les habitudes de tabagisme), nous avons constaté que le profil de cellules inflammatoires est très différent entre ces cohortes (Figure 7). En effet, les patients asthmatiques sont généralement caractérisés par éosinophiles des expectorations surélevé, tandis que la proportion des neutrophiles expectoration est généralement plus élevée chez les patients BPCO par rapport aux témoins sains, qui est liée à la gravité de la maladie.

    figure-results-7
    Figure 7 : Profil de cellules inflammatoires de crachat de sujets sains (n = 45), patients asthmatiques (n = 108) et les patients BPCO (n = 54). Les trois groupes ont été appariés pour le sexe, l’âge et les habitudes de tabagisme. Les p-valeurs de l’ANOVA sont < 0,05, < 0,0001, et < 0,0001 pour la comparaison des neutrophiles, les éosinophiles et les macrophages entre groupes, respectivement. Plusieurs comparaisons ont été faites avec le test de comparaisons multiples de Dunn. Les valeurs p sont représentés comme suit : * p < 0,05 et *** p < 0,001. Résultats sont affichés plus médiane (intervalle interquartile). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    La méthode de l’expectoration induite est un outil utile pour étudier le compartiment des voies respiratoires. Il y a plusieurs applications possibles de cette technique. Tout d’abord, il peut améliorer les connaissances sur les cellules immunitaires et mécanismes impliqués dans diverses maladies respiratoires. Par exemple, cette technique a permis à l’enquête de l’inflammation des voies respiratoires dans les grandes cohortes de patients, et il a été démontré qu’environ la moitié des patients asthmatiques sont caractérisée par une voies respiratoires anormaux inflammation éosinophilique15, 16 , 17, tandis que la MROC présentent habituellement un neutrophile expectorations surélevé compter18. Cette technique a également contribué à une meilleure caractérisation de l’inflammation des voies respiratoires chez les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique et aux médiateurs de preuves qui peuvent contribuer à cette maladie à19. Ensuite, la technique de l’expectoration induite peut être utile pour prédire la réponse au traitement. Par exemple, la présence d’un pourcentage anormal d’éosinophiles des expectorations s’est avérée être un marqueur prédictif de corticostéroïde réactivité11,18. Dans l’asthme et la BPCO, adapter la dose de corticostéroïdes à normaliser le pourcentage d’éosinophiles des expectorations s’est avéré plus efficace dans la diminution du nombre des exacerbations qu’adapter le traitement selon les lignes directrices cliniques actuelles11 ,20,21. En troisième lieu, analyse de l’expectoration peut aider à développer des thérapies ciblées. Par exemple, la présence d’un nombre anormal de neutrophiles de crachat dans la BPCO et certains patients asthmatiques a mené au développement de traitements antineutrophilic11. Quatrièmement, la technique peut jouer un rôle dans le diagnostic. Par exemple, la présence d’éosinophilie expectoration est nécessaire de faire un diagnostic de bronchite éosinophiles non asthmatiques11.

    En plus d’obtenir un nombre d’éléments différentiels, la technique d’induction d’expectorations permet également l’exécution de nombreuses analyses supplémentaires, en étudiant les expectorations surnageante ou cellules d’expectorations. Exemples avec expectoration surnageante comprennent l’analyse des médiateurs8,19,22 et l’évaluation de l’activité chimiotactique de l’échantillon pour les éosinophiles22. Des cellules de l’expectoration, ARN peut être extrait et utilisé pour les micro-ARN ou analyse de l’expression des gènes19,23 . Les cellules de crachat peuvent également être analysés par écoulement cytometry9,23 , qui permet, entre autres, immunophénotypage et le tri des cellules. En outre, les expectorations cellules peuvent être cultivées10, et leur production du médiateur peut être mesurée in vitro24. Il est intéressant de noter que dans ce cas, le contenu de médiateur est différent de ce que peut être trouvé dans les expectorations surnageant. En effet, les médiateurs dans les expectorations surnageante peuvent être influencées par les sécrétions des cellules résidentes des voies respiratoires et par exsudation de plasma, à l’encontre de l’expectoration cell culture modèle24. Enfin, des immunocytochimie et in situ hybridation peut être effectuée à l’aide de cellules de crachats7.

    La technique de l’expectoration induite a quelques limitations. L’induction doit être effectuée sous surveillance médicale. Il est également essentiel pour l’opérateur de donner des instructions approfondies aux patients. Autres limitations incluent la coopération et l’état de santé des patients, que des efforts respiratoires sont nécessaires. Quant à la faisabilité de cette technique chez les enfants, plusieurs études ont rapporté qu’il était efficace et sans danger chez les enfants âgés de 6 ans,25. Données sur les enfants de < de 6 ans manquent de25, mais il est probable que l’induction de l’expectoration est difficile à réaliser dans ces enfants14. La technique est actuellement limitée à la recherche de services et les centres spécialisés parce qu’il est techniquement difficile, chronophage et nécessite du personnel qualifié1. Une autre limitation est que la technique de l’induction de l’expectoration et l’analyse n’est pas toujours couronnée de succès, ce qui signifie qu’un cytospin lisible n’est pas toujours obtenu26. Toutefois, le taux de réussite avoisine généralement 80 % dans différentes cohortes de patients4,26,27,28,29. Enfin, doit être prudent lorsque l'on compare les différentes cohortes de patients concernant l’adéquation de l’âge, comme il a été montré à l’impact de l’expectoration cellule comte30,31. De même, autres paramètres tels que les habitudes de sexe et de tabac doivent être mis en correspondance car ils peuvent également interférer avec les expectorations cell count29,32. Lorsque le patient correspondant n’est pas possible, une autre façon de tenir compte de l’âge, le sexe ou usage du tabac est d’ajuster l’analyse statistique pour ces caractéristiques.

    Par rapport aux autres techniques qui permettent de prélever des cellules des voies respiratoires, comme les biopsies et les lavages broncho-alvéolaire, la méthode de l’expectoration induite a l’avantage d’être simple, bien tolérée, sans danger, reproductible, rentable et non invasif. Ces avantages permettent la technique de l’expectoration induite à effectuer à grande échelle et à plusieurs reprises au fil du temps et rendent une alternative de choix pour l’échantillonnage des voies respiratoires. Bronchosorption est une autre technique permettant la collecte de la muqueuse fluide afin d’évaluer les voies aériennes médiateurs33. Bien que cette technique (nécessitant une bronchoscopie) est plus invasive que l’expectoration induite, il a l’avantage d’éviter toute contamination par la salive et obtenir des concentrations plus élevées de médiateurs que de lavage bronchoalvéolaire33.

    Étapes critiques ont besoin d’attention dans le protocole. Tout d’abord, mise en garde doit être prise concernant la concentration saline et le temps d’induction, car ces deux paramètres peuvent influencer les résultats et doivent donc être standardisés34,,35. En second lieu, la mucolysis avec TNT est une étape importante du traitement. Comparativement à PBS, TNT s’est avéré mieux disperser expectorations cellules7, qui améliore la qualité de glissière de cytopsin et est essentiel d’avoir une cellule reproductible nombre2. Toutefois, l’agent mucolytique peut interférer avec la mesure de composants biochimiques.Expériences de dopage puis doit être effectué lors de la mesure d’un nouveau composé biochimique36. Enfin, une autre étape cruciale de la procédure est la cellule de comptage des pas qui doivent être effectuées par un technicien qualifié pour garantir des résultats fiables et interprétables.

    Une autre méthode, utilisez des fiches de crachat (pièces visqueuse ou plus denses), au lieu des crachats ensemble, est également décrite dans la littérature7. Les deux techniques ont des avantages et des inconvénients. La technique d’expectorations entier permet plus rapide traitement7, mais est souvent contaminée par la salive, ce qui dilue l’échantillon et peut réduire la qualité de cytospins2,7. Avec la technique de sélection de fiche, la contamination de salive est diminuée, ce qui signifie que les échantillons sont souvent de meilleure qualité pour le dosage des médiateurs de la phase fluide et cytospin diapositives7. Le traitement est cependant plus longue7 et bouchons sélectionnés ne sont pas forcément représentatifs de l’ensemble de l’échantillon de37. Il est également intéressant de noter que pas tous les échantillons contiennent des fiches, qui peuvent être limitant. Les deux méthodes ont été validées et reproductibles, et il n’y a actuellement aucune preuve que le nombre de cellules différentiel obtenu à partir de ces deux méthodes est différentes14,38.

    À l’avenir, l’expectoration induite pourrait servir comme un outil clinique pour fournir des biomarqueurs pour l’enquête, diagnostic et gestion de toutes sortes de maladies respiratoires inflammatoires.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ce travail a été soutenu par l’hôpital universitaire de Liège (CHU Liège). Nous reconnaissons « Productions d’Instants » pour la production vidéo. Nous remercions également Cedric François, le patient qui est apparu dans le film.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Spiromètre - SpirobankMIR France
    Salbutamol MDI - VentolinGLAXOSMITHKLINECNK : 0135-913Voir le médicament disponible dans le pays
    Nébuliseur UltraNebDeVilbiss Healthcare USAUltraNeb U3000
    Devilbiss UltraNeb Gobelets jetables & CouverclesDeVilbiss Healthcare USA100HD-647
    Filtre bactérien DeVilbiss pour nébuliseurs UltraNebDeVilbiss Healthcare USA1001005879
    Vannes unidirectionnellesHudson RCI USA41664
    Vannes unidirectionnellesHudson RCI USA41665
    Connecteur en T d’aérosol.Hudson RCI USA41077
    Circuit de ventilation monobranche onduléInt’Air Medical FranceTA30A
    NaCl 5 %  ;//Produit par notre pharmacie hospitalière
    Mini-Plasco NaCl 0.9 %B.Braun Medical  ; Diegem Belgique
    Sulfate de salbutamol 5 mg/mL - VentolineGLAXOSMITHKLINECNK : 0094-987Voir le médicament disponible dans le pays
    Bromure d’ipratropium 0,25 mg/2 mL - AtroventBoehringer Ingelheim AllemagneCNK : 1543-305Voir le médicament disponible dans le pays
    Solution saline tamponnée au phosphate de DulbeccoLONZA BelgiqueBE17512F
    Réactif de sputolysineCalbiochem56000
    Trypan blue solution à 0,4 % 100 mLLONZA Bio Whittaker Belgique17-942E
    Hémocytomètre - ChambreThoma Labor Optik Lancing UK1500000
    Hemacolor Stainig setMerck Belgium1116610001Produit alternatif  ; : Diff Quik Staining Set
      ; Medion Diagnostic  ;
    Support de montage - EntellanMerck Belgium107960
    Statspin Cytofuge 12  ;Beckman Coulter BelgiqueX00-003066-001

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
    2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
    3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
    4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
    5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
    6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
    7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
    8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
    9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
    10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
    11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
    12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
    13. Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
    14. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
    15. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
    16. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
    17. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46(2016).
    18. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s(2002).
    19. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344(2017).
    20. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
    21. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
    22. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
    23. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
    24. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
    25. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
    26. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
    27. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
    28. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
    29. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
    30. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
    31. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
    32. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
    33. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
    34. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
    35. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
    36. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
    37. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
    38. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

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