Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

Résumé

La présente étude décrit une méthode simple de détecter des taux endogènes de la phosphorylation de Rab10 de leucine-rich repeat kinase 2.

Résumé

Mutations de leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) ont été démontrées d’être liée à la maladie de Parkinson familiale (FPD). Étant donné que l’activation anormale de l’activité de la kinase de LRRK2 a été impliquée dans la pathogénie de PD, il est essentiel d’établir une méthode permettant d’évaluer les niveaux physiologiques de l’activité de la kinase de LRRK2. Des études récentes ont révélé que LRRK2 phosphoryle des membres de la famille Rab GTPase, y compris Rab10, dans des conditions physiologiques. Bien que la phosphorylation de Rab10 endogène par LRRK2 dans des cellules cultivées puisse être détectée par spectrométrie de masse, il a été difficile de le détecter par immunotransfert en raison de la sensibilité médiocre d’anticorps de phosphorylation spécifiques actuellement disponibles pour Rab10. Nous décrivons ici une simple méthode de détecter les niveaux endogènes de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 basée sur immunoblotting utilisant sur gel de polyacrylamide sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) combinée avec une étiquette de liaison phosphate (P-tag), qui N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-méthyl) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Le présent protocole non seulement fournit un exemple de la méthode utilisant la balise P mais permet également l’évaluation de comment les mutations comme inhibiteur traitement/administration ou tout autre facteur modifie la signalisation en aval de LRRK2 dans les cellules et tissus .

Introduction

PD est l’un des maladies neurodégénératives plus répandues, affectant principalement les neurones dopaminergiques dans le midbrain, ce qui entraîne un dysfonctionnement des systèmes moteurs dans personnes âgées¹. Alors que la plupart des patients développent des PD de manière sporadique, il y a des familles qui héritent de la maladie. Mutations dans plusieurs gènes ont été retrouvées à être assemblé avec le FPD². Un des gènes responsables de FPD est LRRK2, dans lequel huit mutations faux-sens (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S et I2020T), liées à un FPD principalement héréditaire appelé PARK8 ont été jusqu'à présent signalé^3,4,5. Plusieurs association pangénomique (GWAS) des patients atteints de la MP sporadiques ont également recensée variations génomiques du locus LRRK2 comme un facteur de risque pour PD, suggérant que l’anomalie dans le fonctionnement du LRRK2 est une cause fréquente de neurodégénérescence dans deux sporadiques et PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 est une grosse protéine (2 527 acides aminés), consistant en un domaine riche en leucine, un liant le GTP de Ras du domaine des protéines complexes (ROC), un C-terminal du domaine, un domaine kinase de sérine/thréonine protéine et un domaine de WD40⁹ROC (COR). Les mutations de FPD huit localiser dans ces domaines fonctionnels ; N1437H et R1441C/G/H/S dans le domaine ROC, Y1699C dans le domaine de la CDR, G2019S et I2020T dans le domaine kinase. Car la mutation G2019S, que l'on trouve le plus souvent de mutation du PD patients^10,11,12, augmente l’activité de la kinase de LRRK2 par 2-3 fois in vitro¹³, on fait l’hypothèse que l’augmentation anormale du phosphorylation de fonction LRRK2 est toxique pour les neurones. Cependant, il a été impossible d’étudier si la phosphorylation des substrats de LRRK2 physiologiquement pertinents est altérée dans les patients Parkinsoniens familial/sporadiques en raison du manque de méthodes évaluant dans les échantillons de patients dérivées.

La phosphorylation des protéines est généralement détectée par immunotransfert ou dosage immuno-enzymatique (ELISA) utilisant des anticorps reconnaissant spécifiquement l’État phosphorylé de protéines ou par spectrométrie de masse. Toutefois, la stratégie de l’ancienne parfois impossible d’appliquer à cause des difficultés dans la création d’anticorps spécifiques à la phosphorylation. Un marquage métabolique des cellules avec phosphate radioactif est une autre option à examiner les niveaux physiologiques de la phosphorylation quand la phosphorylation propres anticorps ne sont pas facilement disponibles. Toutefois, elle nécessite une grande quantité de matières radioactives et implique donc un équipement spécialisé pour la radioprotection¹⁴. L’analyse par spectrométrie de masse est plus sensible par rapport à ces méthodes immunochimiques et est devenu populaire dans l’analyse de la phosphorylation des protéines. Cependant, la préparation de l’échantillon est fastidieux et coûteux instruments sont requis pour l’analyse.

Un sous-ensemble de la famille Rab GTPase, y compris Rab10 et Rab8 a été récemment rapporté que des substrats physiologiques directs pour LRRK2 basée sur le résultat d’une analyse de phosphoproteomic à grande échelle¹⁵. Ensuite, nous avons démontré que la phosphorylation de Rab10 a été augmentée de mutations de FPD dans les fibroblastes embryonnaires de souris et dans les poumons des souris¹⁶de knockin. Dans ce rapport, nous avons choisi d’employer une électrophorèse de gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)-méthode dans laquelle une molécule de P-tag est co polymérisée en gel SDS-PAGE (balise P SDS-PAGE) pour détecter les niveaux endogènes de la phosphorylation de Rab10, fondée sur parce qu’un anticorps très sensible spécifique pour Rab10 phosphorylés manquait encore. Nous n’avons pas réussi à détecter la phosphorylation de Rab8 endogène en raison de la faible sélectivité des anticorps actuellement disponibles pour Rab8 total. Par conséquent, nous avons décidé de mettre l’accent sur la phosphorylation de Rab10. LRRK2 phosphoryle Rab10 à Thr73 localiser au milieu de la région hautement conservée « switch II ». Haute conservation des sites de phosphorylation des protéines Rab est peut-être une des raisons pour lesquelles phosphospecific anticorps reconnaissant les protéines Rab distinctes sont difficiles à faire.

La phosphorylation de Rab8A par LRRK2 inhibe la liaison du Rabin8, un facteur d’échange de nucléotide de guanine (FEM) qui active la Rab8A en échangeant le PIB lié avec GTP¹⁵. La phosphorylation de Rab10 et Rab8A par LRRK2 inhibe aussi la liaison des inhibiteurs de la dissociation du PIB (GDIs), qui sont essentiels à l’activation des protéines Rab en extrayant Rab PIB lié aux protéines des membranes¹⁵. Collectivement, c’est l’hypothèse que la phosphorylation des protéines Rab par LRRK2 les empêche d’activation bien que le mécanisme moléculaire précis et les conséquences physiologiques de la phosphorylation demeurent flous.

P-tag SDS-PAGE a été inventé par Kinoshita et al. , en 2006 : dans cette méthode, acrylamide était par covalence associée à P-tag, une molécule capturant des phosphates avec une haute affinité, qui copolymérisés en SDS-PAGE gélifie¹⁷. Parce que les molécules de P-tag dans un gel SDS-PAGE retardent sélectivement la mobilité électrophorétique des protéines phosphorylées, P-tag SDS-PAGE peut séparer des protéines phosphorylées de ceux non-phosphorylés (Figure 1). Si la protéine d’intérêt est phosphorylé sur les résidus de multiples, on observera une échelle des bandes correspondant aux formes phosphorylées différemment. Dans le cas de Rab10, nous n'observons qu’une bande décalée, indiquant que Rab10 est phosphorylé uniquement à Thr73. L’avantage majeur de P-tag SDS-PAGE immunoblotting avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation est que Rab10 phosphorylés peuvent être détectées par immunotransfert avec des anticorps non spécifiques à la phosphorylation (c.-à-d., reconnaissance Rab10 total) Après avoir été transféré sur la membrane, qui est généralement plus spécifiques, sensibles et disponible de sources commerciales et universitaires. Un autre avantage d’utiliser la balise P SDS-PAGE, c’est qu’on peut obtenir une estimation approximative de la stoechiométrie de la phosphorylation, ce qui est impossible par immunotransfert avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation ou par marquage métabolique des cellules avec radioactif phosphates.

Hormis l’utilisation peu coûteuse balise P acrylamide et quelques modifications mineures liées à celui-ci, la présente méthode pour la détection de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 suit un protocole général d’immunoblotting.Par conséquent, il devrait être simple et facilement exécutable dans les laboratoires où immunoblotting est une pratique habituelle, avec tous les types d’échantillons, y compris des homogénats tissulaires, lysats cellulaires et protéines purifiées.

Protocole

1. préparation pour la balise P SDS-PAGE

1. Enlever et jeter les médias de la vaisselle de 10 cm dans laquelle les cellules croissent en utilisant une aspiration et laver les cellules avec tampon phosphate salin de Dulbecco 5 mL (SPD) de première SPD ajoutant au côté des plats pour ne pas perturber la couche cellulaire rock manuellement les plats arrière et plusieurs fois de suite.
2. Retirer et jeter le SPD à l’aide d’une aspiration et ajouter 2 mL de trypsine de 0,25 % (p/v) diluée dans du SPD et balancer doucement les plats pour couvrir la couche de cellules. Mettre les plats dans un incubateur à CO₂ (37 ° C, l’air humidifié, 5 % de CO₂) pendant 5 min.
3. Après avoir effectué de haut en bas en utilisant une pipette jetable pour briser les cellules individuelles, recueillir la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et mesurer la densité des cellules à l’aide d’un hematocytometer sous un microscope¹⁸.
4. Diluer les cellules à 2,5 × 10⁵ cellules/mL avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionnés de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Ajouter 2 mL (5 × 10⁵ cellules) de la suspension cellulaire dilué dans chaque puits de plaques 6 puits.
5. Cultiver les cellules pendant la nuit dans un incubateur à CO₂ (37 ° C, l’air humidifié, 5 % de CO₂).
6. Transfection dans les cellules HEK293
   Remarque : Si la phosphorylation de Rab10 endogène doit être examinée, passer au point 1.7. On trouvera des plasmides utilisés dans le présent protocole auprès des auteurs sur demande. Voir Table des matières pour brèves informations et Figure S1 pour leur DNA sequences.
   1. Aliquote à 200 µL de DMEM dans des tubes de 1,5 mL.
   2. Dans chaque tube, ajouter les deux 0,266 µg (concentration finale des 1,33 µg/mL) d’un plasmide codant HA-Rab10 et 1,066 µg (concentration finale de 5,33 µg/mL) d’un plasmide codant 3 × drapeau-LRRK2 provenant des stocks de plasmide 500 µg/mL. Ajouter ensuite 4 µL de solution de 1 mg/mL de POLYÉTHYLÈNEIMINE (dissous dans 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) et mélanger immédiatement la solution au Vortex pendant 5 s.
   3. Laisser les tubes reposer à température ambiante pendant 10 min et ajouter le contenu d’un tube goutte à goutte d’un bien en utilisant une micropipette. Doucement et manuellement de roche les plaques de culture plusieurs fois en arrière pour permettre le mélange de transfection diffuse uniformément tout au long du puits.
7. Laisser les cellules à se développer pendant encore 24 à 36 h dans un incubateur à CO₂ (37 ° C, l’air humidifié, 5 % de CO₂).
8. Si la phosphorylation de Rab10 endogène est à examiner, traiter des cellules avec ou sans inhibiteurs LRRK2 pendant 1 h avant la lyse des cellules.
   1. Préparer les solutions d’inhibiteurs LRRK2 en dissolvant les inhibiteurs dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 mM. Nous vous recommandons d’utiliser IML-2 et GSK2578215A, qui sont très spécifiques et puissants inhibiteurs LRRK2. Stocker les solutions mères à-80 ° C.
   2. Préparer des stocks de travail des inhibiteurs en diluant les solutions mères avec le DMSO : pour IML-2, préparer 10 µM et 30 µM endogène et surexprimée LRRK2, respectivement. Pour GSK2578215A, préparer 1 mM et 3 mM pour endogène et surexprimée LRRK2, respectivement.
   3. Ajouter 2 µL des stocks travail d’IML-2 ou GSK2578215A au milieu d’un bien à l’aide d’une micropipette, faisant doucement tourner la plaque manuellement en arrière à plusieurs reprises de laisser les inhibiteurs diffuse uniformément tout au long du puits.
   4. Ajouter 2 µL de DMSO à un puits différent comme témoin négatif d’une manière similaire à l’inhibiteur dans l’étape 1.8.3.
   5. Remettre les plaques dans l’incubateur et la culture des cellules pendant 1 h.
9. Lyse des cellules.
   1. Mettre les plaques de culture sur la glace. Retirez et jetez les médias. Laver les cellules premier ajout 2 ml SPD au côté des plats pour ne pas perturber la cellule couche et de roche manuellement les plats en arrière à plusieurs reprises.
   2. Retirer et jeter le SPD et ajoute les cellules 100 µL de la mémoire tampon de lyse (50 mM Tris-HCl de pH 7.5, 1 % (v/v) polyoxyethylene(10) octylphényle éther, 1 mM EGTA (éthylène glycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tétraacétique), orthovanadate de sodium 1 mM, 50 mM le fluorure de sodium, 10 mM β-glycérophosphate, pyrophosphate de sodium 5 mM, 0,1 µg/mL microcystine-LR, saccharose 270 mM, inhibiteur de la protéase cocktail).
   3. Inclinez les plaques sur la glace et raclez les cellules en utilisant un grattoir de cellules pour recueillir autant cellule lysat que possible. Recueillir les lysats à l’aide d’une micropipette dans des tubes de 1,5 mL (préalablement refroidis sur la glace).
      ATTENTION : Microcystine-LR peut être fatal si avalé ou contact avec la peau.
10. Laisser les tubes sur la glace pendant 10 min pour la lyse complète. Clarifier les lysats cellulaires par centrifugation (20 000 × g, 10 min à 4 ° C) et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 mL préalablement refroidis sur la glace.
11. Mesurer la concentration de protéines (µg/µL) des lysats défrichées par analyse de Bradford.
    1. Établir l’albumine sérique bovine (BSA) des normes propres (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1 mg/mL) en diluant la solution-mère avec de l’eau distillée. Diluer les lysats de cellules défrichées par 20 fois avec de l’eau distillée.
    2. Mettre 5 µL/puits des normes de BSA, blank (eau distillée) et chaque cellule dilué lysat dans une plaque à 96 puits en triple exemplaire.
    3. Ajouter 150 µL/puits de réactif d’analyse de la Bradford à l’aide d’une micropipette 12 canaux et laisser la plaque à température ambiante pendant 5 min.
    4. Mesurer l’absorbance à 595 nm sur un lecteur de plaques et de la comparer aux normes de la BSA.
12. Préparer 100 µL d’échantillons SDS-PAGE. La concentration de protéine des échantillons est de 1 µg/µL pour surexprimée HA-Rab10 et 2 µg/µL pour Rab10 endogène.
    1. En utilisant les concentrations quantifiées de l’étape 1.11.4, calculer le volume (µL) des lysats cellulaires équivalant à 100 µg (surexprimée HA-Rab10) ou 200 µg (Rab10 endogènes) en divisant la quantité de protéine (100 µg ou 200 µg) par la concentration de protéines de lysats (µ g/µL).
    2. Ajouter 25 µL de tampon de Laemmli 4 × SDS-PAGE (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8 % (p/v) SDS, 40 % (v/v) de glycérol, bleu de bromophénol 0,02 % (p/v), 4 % (v/v) de β-mercaptoéthanol) dans de nouveaux tubes de 1,5 mL conservés à température ambiante.
    3. Ajouter de la valeur de la cellule lysats à chaque tube et mélangent au Vortex pendant 5 s à température ambiante.
    4. Porter le volume total à 100 µL avec le tampon de lyse et mélanger au Vortex pendant 5 s à température ambiante.
13. Supplément de 10 mM MnCl₂ pour étancher l’agent chélatant. Ajouter 1 µL de 500 mM MnCl₂. Mix au Vortex pendant 5 s à température ambiante.
    Remarque : Les échantillons contenant MnCl₂ peuvent ne pas convenir pour SDS-PAGE normale.

Cette étape est nécessaire en raison de la présence de l’agent chélateur (tels que l’acide tétraacétique (EDTA), EGTA, etc.) dans le tampon de lyse. Sinon, ions Mn^{2 +} couplées à l’acrylamide P-balise seront dissociées par les agents chélatants et P-tag SDS-PAGE ne fonctionnera pas correctement.

Faire bouillir tous les échantillons à 100 ° C pendant 5 min et stocker les échantillons inférieures à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Les bouillie échantillons peuvent être conservés jusqu'à au moins 6 mois.

2. moulage Gels pour P-tag SDS-PAGE

Remarque : Les Gels doivent être effectuées sur le même jour que les gels en cours d’exécution. Gels en vertu des conditions de luminosité ambiantes.

1. Préparer 5 mM P-tag acrylamide solution première dissoudre 10 mg de poudre/solide P-tag acrylamide complètement avec 100 µL de méthanol et ensuite porter à 3,3 mL en ajoutant de l’eau bidistillée.
   Remarque : L’acrylamide P-tag est sensible à la lumière. La solution ainsi préparée doit être stockée dans l’obscurité à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. Plaques propre clair et entaillées par pulvérisation de l’éthanol à 70 % et essuyer avec une serviette de papier. Assembler les plaques de gel. Les dimensions des plaques gel utilisés dans ce protocole particulier sont 80 ou 100 mm de long par 100 mm de large. Entretoises de silicium pur sont mis entre plaine et plaques entaillées et l’assemblé sont fixés avec des clips de liant.
   Remarque : N’importe quel type de plaques de gel qui fonctionnent pour SDS-PAGE ordinaire peut être utilisé.
3. Mettre un peigne pour être utilisé (peigne en plastique 17 puits) dans la marque sur la plaque de gel la position du fond des puits et des plaques de gel assemblé avec un marqueur permanent.
4. Préparer 10 mL de mélange de gel d’acrylamide 10 % (10 % (p/v) d’acrylamide (acrylamide:bis-acrylamide = 29 : 1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 % (p/v) SDS) dans un tube de 15 mL.
   Remarque : La concentration optimale d’acrylamide peut varier selon les réactifs utilisés. Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et ammonium persulfate (APS) ne doit pas être ajouté à ce stade.
5. Ajouter 100 µL d’acrylamide P-balise de 5 mM et 10 µL de 1 M MnCl₂ solutions à la concentration finale de 50 µM et 100 µM, respectivement.
   Remarque : Les concentrations optimales de l’acrylamide P-tag et le MnCl₂ peuvent également varier selon les réactifs utilisés.
6. Ajouter 15 µL de TEMED dans le mélange de gel à une concentration finale de 0,15 % (v/v) et ensuite 50 µL de 10 % (p/v) : APS à une concentration finale de 0,05 % (p/v). Bien mélanger en agitant doucement le tube pendant 5 s et verser dans les boîtes assemblées immédiatement jusqu'à une hauteur de 2 mm ci-dessous la position indiquée à l’étape 2.3.
7. Doucement la couche 2-propanol dans la solution de gel pour aplatir le dessus de séparer les gels.
8. Les gels, laissez reposer pendant 30 min à température ambiante. Il n’est pas nécessaire de protéger les gels de la lumière.
   NOTE : Il pourrait prendre plus de temps pour les gels en vertu de la température de la pièce froide. Le mélange de gel de dégazage avant d’ajouter le TEMED et APS permet d’accélérer cette étape. À cette fin, le mélange de gel peut être préparé dans un erlenmeyer de 100-200 mL relié à une aspiration. Dégazer la solution pendant 10 min.
9. Enlever le couches 2-propanol en absorbant avec du papier absorbant.
10. Laver l’espace supérieur des gels en remplissant l’espace avec de l’eau distillée d’un flacon laveur et jeter l’eau de décanter dans le bassin. Répéter 3 fois de lavage.
11. Enlever l’eau résiduelle restant dans l’espace supérieur des gels en absorbant avec du papier absorbant.
12. Préparer 3 mL de mélange de gel d’acrylamide 4 % (4 % (p/v) d’acrylamide (a: crylamide:bis-acrylamide = 29 : 1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 % (p/v) SDS) dans un tube de 15 mL.
    Remarque : N’ajoutez pas de balise P acrylamide ou MnCl₂ solution pour le mélange de gel de gerbage.
13. Ajouter 7,5 µL de TEMED et 24 µL de 10 % (p/v) : APS à la concentration finale de 0,25 % (v/v) et 0,08 % (p/v), respectivement. Bien mélanger en agitant doucement le tube pendant 5 s et versez le mélange sur le dessus du gel de séparation. Mettre immédiatement les peignes appropriés (les peignes en plastique 17-bien accueillir jusqu'à 25 µL d’échantillons, par exemple).
14. Les gels, laissez reposer pendant 30 min à température ambiante. Il n’est pas nécessaire de protéger les gels de la lumière. Après que les gels empilement défini, exécutez-les sans être stockées.

3. SDS-PAGE et immunoblot

1. Retirez les peignes de gels. Supprimez les entretoises de silicium et puis clips de gels.
2. Mettre les gels coulées dans des réservoirs de gel et fixer le gel au réservoir en pinçant avec les clips de liant.
3. Verser le tampon en cours d’exécution (25 mM Tris, 192 mM, Glycine, 0,1 % (p/v) SDS) en bas et haut des gels. Puits propres en rinçant le tampon en cours d’exécution à l’aide d’une seringue de 5 mL et une aiguille de 21G pour enlever les morceaux de gel.
4. Enlever les bulles d’air de l’espace en bas des gels à l’aide d’une aiguille tordue, attachée à une seringue. Pour rendre une aiguille tordue, courber manuellement une aiguille 21G au milieu de l’aiguille pour que l’angle entre la pointe et la base de l’aiguille devient 30-45 °.
5. Tournez en bas précipités causées par l’ajout de MnCl₂ à 20 000 × g pendant 1 min à température ambiante pour prélever des échantillons de claires.
6. Charger 10 µg de protéines pour la détection de la phosphorylation de Rab10 surexprimée et 30 µg de protéines pour Rab10 endogène.
   Remarque : Il est essentiel de charger un volume égal d’échantillons dans tous les puits. Les ruelles vides doivent être chargés avec tampon de Laemmli de × 1 SDS-PAGE. Si les échantillons contiennent MnCl₂, ajouter la même concentration de MnCl₂ aux échantillons factices.
7. Le bien chargé avec un marqueur de poids moléculaire (MWM) devrait également être complété avec tampon de Laemmli 1 × SDS-PAGE donc le volume d’échantillons chargés est la même dans tous les puits.
   Remarque : Encore une fois, si les échantillons contiennent MnCl₂, s’ajoute la même concentration de MnCl₂ le MWM. Par ailleurs, un MWM sans EDTA peut être utilisé.
8. Exécuter les gels à 50 V pour le gerbage (environ 30 min) jusqu'à ce que le front de colorant traverse dans le gel de séparation.
9. Après que les échantillons de la pile, changer la tension de 120 V pour séparation jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le fond des gels (environ 50 et 80 min pour 80 et 100 mm long gels, respectivement).
   Remarque : Les habitudes migratoires de la MWM devrait être différente de celle sur les gels de SDS-PAGE normales. Il ne doit pas être utilisé pour estimer le poids moléculaire des protéines sur gel SDS-PAGE de P-tag, mais peut être utilisé pour vérifier la reproductibilité des gels P-tag. Pour plus d’informations, voir analyse .
10. Laver les gels pour retirer les gels de MnCl₂ .
    1. Versez le transfert tampon (48 mM Tris, 39 mM, Glycine, méthanol 20 % (v/v)) contenant 10 mM EDTA et 0,05 % (p/v) : SDS dans un récipient (par exemple, gros bateaux de pesage).

Le volume de la mémoire tampon doit être suffisant pour couvrir un gel.

Retirez les gels de séparation les plaques de gel et mis un gel dans un récipient. Jeter le gel de concentration.

Laissez les gels sur un agitateur basculant (~ 60 tr/min) pendant 10 min à température ambiante.

Répétez les étapes de lavage au total 3 fois.
Remarque : Utiliser la mémoire tampon fraîche pour chaque lavage.

Laver les gels une fois pendant 10 min avec le tampon de transfert contenant 0,05 % (p/v) SDS pour enlever l’EDTA. Le volume de la mémoire tampon doit être suffisant pour couvrir un gel.

Electro-transfert de nitrocellulose ou polyvinylidène difluoride (PVDF) membranes à l’aide de chars humides.

1. Placer un filtre en papier (10 x 7 cm) sur un plateau en mousse pour le transfert. Placer le gel sur le papier filtre. Assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air entre le gel et le papier filtre.
2. Mettre une membrane (10 x 7 cm) sur le gel et assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air entre le gel et la membrane.
3. Mettre un autre filtre en papier (10 x 7 cm) sur la membrane et, encore une fois, assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air entre la membrane et le papier filtre.
4. Mettre un autre plateau en mousse sur le papier filtre. Placez la pile de papiers/filtre à membrane dans une cassette pour le transfert.
5. Mettre la cassette dans un réservoir de transfert, en veillant à ce que la membrane se situe entre le gel et l’anode chargé positivement.
6. Connectez le vase sur un bloc d’alimentation et mettre le réservoir dans une boîte de mousse de styrène remplie d’eau glacée. Démarrer le transfert à 100 V à 180 min.
   NOTE : Déplacement prolongé est nécessaire étant donné que le transfert des protéines à partir de gels P-tag SDS-PAGE ne sont pas aussi efficace que celui de normales gels SDS-PAGE. Un refroidissement efficace est essentiel pour éviter la fonte des gels pendant le transfert.

Vérifier le transfert

1. Retirer les membranes les gels à l’aide de la pince à épiler et tremper les membranes dans une solution de Ponceau S (0,1 % (p/v) Ponceau S, 5 % (v/v) d’acide acétique) pour colorer les protéines transférées sur les membranes dans un récipient en plastique. Le volume de la solution devrait être suffisant pour couvrir une membrane.
2. Incuber les membranes pendant 1 min à température ambiante en poussant manuellement.
   Remarque : Une échelle des bandes devienne visible dans chaque ruelle.
3. Ramasser la membrane par la solution de coloration avec des pincettes et voir si l’échelle des bandes a schéma uniforme et l’intensité dans chaque ruelle où les échantillons ont été chargés.
4. Après avoir vérifié la coloration, retirer la solution colorante et ajouter un tampon TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate). Le volume de la mémoire tampon doit être suffisant pour couvrir une membrane.
   Remarque : La solution de Ponceau S peut être collectée et réutilisé plusieurs fois.
5. Balancer les membranes dans TBST sur un agitateur basculant (~ 60 tr/min) à température ambiante jusqu'à ce qu’aucune bande visible sur les membranes.
6. Répétez l’étape de lavage avec un mélange TBST frais pendant 5 min.

Retirer et jeter la TBST. Bloquer en ajoutant 5 % (p/v) de lait écrémé dissous dans un mélange TBST et bascule sur un agitateur (~ 60 tr/min) pendant 1 h à température ambiante. Le volume de la solution de blocage doit être suffisant pour couvrir une membrane.

Préparer les solutions d’anticorps primaire en diluant les anticorps primaires (anticorps anti-Rab10 pour Rab10 endogènes) et les anticorps anti-HA HA-Rab10 surexprimée dans 10 mL par la membrane de la solution de blocage (voir la Table des matières pour les concentrations).

Retirez et jetez la solution de blocage et ajoutez l’anticorps primaire. Incuber les membranes sur un agitateur basculant (~ 60 tr/min) pendant la nuit à 4 ° C.

Enlever la solution de l’anticorps primaire et ajoute un mélange TBST pour laver les membranes. Le volume de la mémoire tampon doit être suffisant pour couvrir une membrane.

Incuber les membranes pendant 5 min sur un agitateur basculant (~ 60 tr/min) à température ambiante. Répéter le lavage (étape 3.16) au total 3 fois en utilisant un mélange TBST frais chaque fois.

Préparer les solutions d’anticorps secondaire en diluant anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort (HRP) dans 10 mL par la membrane de la solution de blocage. Utiliser des anticorps de type IgG anti-lapin étiqueté avec HRP pour membranes sondés avec l’anticorps anti-Rab10 et les anticorps de type IgG antisouris marqué avec HRP pour ceux sondés avec l’anti-HA anticorps (voir Table des matières pour la concentration).

Retirer et jeter la TBST après le troisième lavage et ajouter la solution d’anticorps secondaire. Incuber les membranes sur un agitateur basculant (~ 60 tr/min) pendant 1 h à température ambiante.

Laver les membranes dans TBST pendant 10 min. répéter l’étape de lavage au total 3 fois, semblables à l’étape 3.17.

Développer les membranes à l’aide de chimiluminescence améliorée (ECL).
NOTE : Temps d’exposition peut varier selon la solution ECL et le système utilisé pour la détection de chimiluminescence.

1. Allumez un imageur équipé d’une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD) et un ordinateur connecté à l’imageur. Démarrez le logiciel de contrôle pour l’imageur. Attendez que la température de la caméra CCD a atteint-25 ° C.
2. Mettre 1 mL de la solution ECL pour une des membranes sur une pellicule de plastique sur un banc.
3. Mettre un membrane gel-côté-vers le haut sur la solution ECL et puis rapidement Retournez-le afin que les deux côtés de la membrane sont enduites avec la solution.
4. Ramasser la membrane et égoutter en laissant un côté de la touche de membrane papier absorbant pendant 5 s.
5. Mettre la membrane entre clair films (par exemple, papier clair poches).
   NOTE : Le film plastique n’est pas recommandé pour envelopper les membranes. Les films clairs utilisés pour l’emballage de la membrane doivent être aussi plate que possible sans rides visibles afin d’éviter le fond inégal.
6. Placer la membrane sur un plateau noir. Placez le plateau dans l’imageur et fermer la porte.
7. Cliquez sur le bouton « Mise au point » dans la fenêtre du logiciel de contrôle. Vérifier que la membrane est correctement positionnée. Cliquez sur le bouton « Retour ».
8. Sélectionnez « Précision » pour « Type d’exposition ». Sélectionnez « Manuel » pour « Temps d’exposition » et définissez la durée d’exposition à 1 s.
9. Sélectionnez « Élevé » pour « Résolution/sensibilité ». « Ajouter des images de numérisation » laissez désactivé. Cliquez sur le bouton « Start » pour prendre la photo.
10. Enregistrez l’image qui apparaît sur l’écran de l’ordinateur au format TIFF.
11. Répéter de prendre des photos avec la durée d’exposition de 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s et jusqu'à 180 s. Lorsque vous prenez la dernière image, cochez « Ajouter des images de numérisation » afin de l’image numérique, pas de la chimiluminescence, de la membrane peut être pris simultanément.
12. Sélectionnez la meilleure image avec la plus grande gamme dynamique et sans n’importe quel pixel saturante (indiqué en rouge) dans les bandes d’intérêt.
    NOTE : Films radiographiques classiques peuvent également servir pour détection¹⁹.

Résultats

Surexpression système : Phosphorylation des HA-Rab10 de 3 × drapeau-LRRK2 dans HEK293 cellules :

Les cellules HEK293 ont été transfectées avec 0,266 µg d’HA-Rab10 sauvage et 1,066 µg de 3 × drapeau-LRRK2 (mutant sauvage, kinase-inactive (K1906M), ou des mutants FPD). La phosphorylation de Rab10 a été étudiée par P-tag SDS-PAGE, suivi par immunotransfert à l’aide d’un anti-HA anticorps (Figure 2). 10 µg...

Discussion

Nous décrivons ici une méthode facile et robuste de détecter Rab10 phosphorylation par LRRK2 niveaux endogènes basé sur la méthodologie P-tag. Parce que l’anticorps actuellement disponibles contre phosphorylés Rab10 fonctionne uniquement avec des protéines surexprimée¹⁵, la présente méthode utilisant la balise P SDS-PAGE est la seule façon d’évaluer les concentrations endogènes de la phosphorylation de Rab10. En outre, la présente méthode permet l’estimation de la stoechiométrie de la phosphorylat...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saline tamponnée au phosphate (DPBS)	maison		150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 dans de l’eau MilliQ et stérilisé par autoclave
Chlorure de sodium	Nacalai Tesque	31320-34
Hydrogénophosphate disodique de sodium 12-Water	Wako	196-02835
Chlorure de potassium	Wako	163-03545
Dihydrogénophosphate de potassium	Wako	169-04245
2,5 % Trypsine (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Diluer 10 fois avec du DPBS stérile pour la préparation d’une solution
de travailDulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Sérum fœtal	bovin BioWest	S1560	Inactivé à la chaleur à 56 ° ; C pour 30 min
Pénicilline-Streptomycine (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Hydroxyde de sodium	Wako	198-13765
Polyéthylénimine HCl MAX, Linéaire, Mw 40 000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	solution mère a été préparée dans 20 mM d’HEPES-NaOH pH 7,0 à 1 mg/mL, puis le pH a été ajusté à 7,0 avec
du NaOH Diméthylsulfoxyde	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Acide chlorhydrique	Wako	080-01066
Polyoxyéthylène(10) Octylphényléther	Wako	160-24751	Équivalent au Triton X-100
Éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA)	Wako	346-01312
Orthovanadate(V)	Wako	198-09752
Fluorure de sodium	Kanto Chemical	37174-20
&beta ;-Acide glycérophosphorique Sel disodique Pentahydraté	Nacalai Tesque	17103-82
Sodium pyrophosphate décahydraté	Kokusan Chemical	2113899
Microcystin-LR	Wako	136-12241
Saccharose	Wako	196-00015
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	11873580001	Dissoudre un comprimé dans 1 mL d’eau, qui peut être conservé à -20 ° ; C pendant un mois. Utilisez-le à une dilution de 1:50 pour la lyse cellulaire
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23200
Dodécylsulfate de sodium	Nacalai Tesque	31607-65
Glycérol	Wako	075-00616
Bleu de bromophénol	Wako	021-02911
&beta ;-mercaptoéthanol	Kanto Chemical	25099-00
Éthanol	Wako	056-06967
Méthanol	Wako	136-01837
Marqueur de liaison au phosphate acrylamide	Wako	AAL-107	P-tag acrylamide
40 % (p/v) solution d’acrylamide	Nacalai Tesque	06119-45	Acrylamide :Bis = 29:1
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
Persulfate d’ammonium (APS)	Wako	016-08021	Solution à 10 % (p/v) a été préparée en dissolvant la poudre de persulfate d’ammonium dans de l’eau MilliQ
2-propanol	Wako	166-04831
Chlorure de manganèse tétrahydraté	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Marqueur de poids moléculaire utilisé dans le protocole
WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	Membrane nitrocellulosique
Durapore Membrane Filter	EMD Millipore	GVHP00010	Membrane PVDF
Papiers filtres No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Acide acétique	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	polyoxyéthylènesmonolaurate d’orbitan
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Wako	345-01865
Lait écrémé en poudre	Laboratoires Difco	232100
Immunostar	Wako	291-55203	Solution ECL (Sensibilité normale)
Immunostar LD	Wako	290-69904	Solution ECL (Haute sensibilité)
Solution de coloration CBB	maison		1 g de CBB R-250, 50 % (v/v) de méthanol, 10 % (v/v) d’acide acétique dans 1 L d’eau MilliQ
CBB R-250	Wako	031-17922
Décoloration CBB solution	maison		12 % (v/v) de méthanol, 7 % (v/v) d’acide acétique dans 1 L d’eau MilliQ
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	>Comments
Antibodies
anti-HA Sigma-Aldrich		11583816001	Utilisé à 0,2 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
anti-Rab10	Cell Signaling Technology	#8127	Utilisé à 1:1000 pour l’immunoblotting. La spécificité a été confirmée par CRISPR KO dans Ito et al., Biochem J, 2016.
anticorps anti-pSer935	Abcam	ab133450	Utilisé à 1 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
anticorps anti-LRRK2	Abcam	ab133518	Utilisé à 1 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
anticorps anti-&alpha ;-tubuline	Sigma-Aldrich	T9026	Utilisé à 1 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
anticorps anti-GAPDH	Santa-Cruz	sc-32233	Utilisé à 0,02 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
Peroxydase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Utilisé à 0,16 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Utilisé à 0,16 &mu ; g/mL pour l’immunobuvardage.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
>Inhibitors
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	La solution mère a été préparée dans du DMSO à 10 mM et stockée à -80 ° ; C
MLi-2	Fourni par le Dr Dario Alessi (Université de Dundee)		solution mère a été préparée dans du DMSO à 10 mM et stockée à -80 ° ; C
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Plasmides
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	Fourni par Dr Dario Alessi (Université de Dundee)		Ce plasmide exprime le Rab10 humain marqué amino-terminal HA.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Ito et al., Biochimie, 46 : 1380&ndash ; 1388 (2007). Ce plasmide exprime amino-terminalement LRRK2 humain de type sauvage marqué 3xFLAG.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Ito et al., Biochimie, 46 : 1380&ndash ; 1388 (2007). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant inactif de la kinase K1906M marquée 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			Ce papier. Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant FPD N1437H marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimie, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441C FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441G FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441H FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			Ce papier. Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant R1441S FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant Y1699C FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime de manière amino-terminale le mutant FPD G2019S marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Fourni par le Dr Takeshi Iwatsubo (Université de Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimie, 48 : 10963&ndash ; 10975 (2013). Ce plasmide exprime amino-terminalement le mutant I2020T FPD marqué 3xFLAG de LRRK2 humain.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
>Equipments
CO2 incubateur	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110 Water-Jacketed
Auto	Pipette Drummond	Pipet-Aid PA-400
Micropipette P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5&ndash ; 10 &mu ; L
Micropipette P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20&ndash ; 200 &mu ; L
Micropipette P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100&ndash ; 1000 &mu ; L
Pointes pour micropipette P10	STAR	RST-481LCRST	Pointes stériles
pour micropipette P200	FUKAEKASEI	1201-705YS	Pointes stériles
pour micropipette P1000	STAR	RST-4810BRST	Pipette
disporable stérile 5 mL	Greiner	606180	Pipette disporable stérile
10 mL	Greiner	607180	Pipette disporable stérile
de 25 mL	Falcon	357535
Hématocytomètre	Sunlead	Glass A126	Microscope Neubeuer amélioré
	Olympus	CKX53
Boîtes de 10 cm	Falcon	353003	Pour la culture tissulaire
Plaques 6 puits	AGC Techno Glass	3810-006	Pour la culture
tissulaireMélangeur Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
Racleurs à cellules	Sumitomo Bakelite	MS-93100
Tubes de 1,5 mL	STAR	RSV-MTT1.5
Tubes de 15 mL	AGC Techno Glass	2323-015
Tubes de 50 mL	AGC Techno Glass	2343-050
Centrifugeuses	TOMY	MX-307
Plaques à 96 puits	Greiner	655061	Non destiné à la culture tissulaire
Lecteur de plaques	Dispositifs moléculaires	SpectraMax M2e
SDS&ndash ; PAGE réservoirs	Nihon Eido	NA-1010
Réservoirs de transfert	Nihon Eido	NA-1510B
Plaques de gel (crantées)	Nihon Eido	NA-1000-1
Plaques de gel (unies)	Nihon Eido	NA-1000-2
Entretoises en silicone	Nihon Eido	NA-1000-16
Peignes 17 puits	Nihon Eido	Sur
Pinces à reliure	Nihon Eido	NA-1000-15
Seringue 5 mL	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Centrale électrique 1000 VC	ATTO	AE-8450	Alimentation pour SDS&ndash ; PAGE et transfert
Grands bateaux de pesée	Ina Optika	AS-DL
Conteneurs en plastique	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
Agitateur à bascule	Titech	NR-10
Boîte en mousse de styrène	générique		Les dimensions intérieures doivent correspondre à un réservoir de transfert (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		Un imageur équipé d’une caméra CCD refroidie pour la détection de l’ECL