Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Résumé

Détails de ce protocole la construction et l’exploitation d’un microscope de suivi en temps réel 3D seule particule capable de suivi échelle nanométrique fluorescent sondes à grande vitesse par diffusion et taux de comptage de photons de faible.

Résumé

Une seule particule tridimensionnelle en temps réel suivi (RT-3D-SPT) a le potentiel pour faire la lumière sur les processus rapides et 3D dans les systèmes cellulaires. Bien que diverses méthodes de RT-3D-SPT ont été présentés ces dernières années, haute vitesse de suivi 3D diffusant des particules à des taux de comptage de photons de faible reste un défi. En outre, des configurations de RT-3D-SPT sont généralement complexes et difficiles à mettre en œuvre, limitant leur application généralisée aux problèmes biologiques. Ce protocole présente un système de RT-3D-SPT nommé 3D dynamique Photon localisation Tracking (3D-DyPLoT), qui permet de suivre les particules à haute vitesse par diffusion (jusqu'à 20 µm2/s) au taux de comptage de photons de faible (jusqu'à 10 kHz). 3D-DyPLoT emploie un déflecteur d’electro-optiques 2D (2D-EOD) et une lentille de gradient acoustique accordable (TAG) d’entraînement axé sur un seul laser spot dynamiquement en 3D. Combiné avec un algorithme d’estimation de position optimisée, 3D-DyPLoT pouvez verrouiller sur les particules unique avec suivi haute vitesse et la précision de localisation haute. En raison de l’excitation unique et mise en page de chemin d’accès détection simple, 3D-DyPLoT est robuste et facile à mettre en place. Ce protocole décrit comment construire 3D-DyPLoT étape par étape. Tout d’abord, la disposition optique est décrite. Ensuite, le système est calibré et optimisé par une perle fluorescente de 190 nm avec la NANOPOSITIONNEUR piézoélectrique de balayage. Enfin, pour illustrer la 3D en temps réel suivi de capacité, 110 perles fluorescentes nm sont suivis dans l’eau.

Introduction

L’émergence des techniques avancées d’imagerie a ouvert une fenêtre pour visualiser la structure toujours plus détaillée des phénomènes cellulaires, tout le chemin jusqu’au niveau moléculaire. Méthodes telles que la reconstruction optique stochastique microscopie (tempête)^1,2,3, localisation photoactivation microscopie (PALM)^4,5,6,7 , structurée illumination microscopie (SIM)^8,9,<....

Protocole

1. configurer la mise en page et alignement

1. Installation et collimation de l’excitation de suivi laser
   1. Fixer le laser sur la table optique à l’aide d’une monture de construction artisanale. La monture est une plaque d’aluminium simple avec trous pour la tête du laser et la table optique. Le laser doit être fermement fixé à une monture en métal pour la stabilité et la dissipation thermique. Pour ce travail, utiliser un laser à état solide 488 nm pour l’éclairage (Figure 1), bien que la longueur d’onde peut être sélectionné pour convenir à un fluorophore particulière ou d’expérimenter. Un facteur critique est que la lo....

Résultats

Fixe particule balayage (Figure 4) et diffusant librement 110 nm fluorescent suivi (Figure 5) ont été effectuées selon le protocole ci-dessus. La particule de numérisation a été réalisée en déplaçant les photons NANOPOSITIONNEUR et bin piézoélectriques tandis que calculer simultanément de la particule estimé position à chaque point dans l’analyse. L’image de balayage montre un carré de même intensité (Figure .......

Discussion

Bien que beaucoup de variétés de particule unique 3D, méthodes de suivi est apparues ces dernières années, robuste suivi en temps réel de diffusion 3D haute vitesse au taux de comptage de photons de faible avec une simple configuration est encore un défi, qui limite son application aux important biologique problèmes. La méthode 3D-DyPLoT décrit dans cette adresses ces défis de plusieurs façons. Tout d’abord, les voies de l’excitation et la détection sont simplifiés grandement par rapport aux autres implémentations rendan.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Déflecteur électro-optique 2D  ;	ConOptics	M310A	2 Alimentation requise
pour EOD	ConOptics	412	Convertit la sortie FPGA en haute tension pour EOD
TAG  ; Lentille	TAG Optics	TAG 2.0	Utilisé pour dévier le laser le long de la direction axiale
du nanopositionneur piézoélectrique XY	MadCity Labs	Nano-PDQ275HS	Utilisé pour déplacer l’échantillon afin de verrouiller la particule dans le volume focal de l’objectif vers l’intérieur  ;
Nanoposiitoner piézoélectrique Z	MadCity Labs	Nano-OP65HS	Utilisé pour déplacer l’objectif afin de suivre la particule diffusante
Micropositionneur	MadCity Labs	MicroDrive	Utilisé pour positionner grossièrement l’échantillon et évaluer
l’objectif Objectif	Zeiss	PlanApo	Ouverture numérique élevée requise pour une meilleure sensibilité. 100X, 1,49 NA, M27, Zeiss
sCMOS caméra	PCO	pco.edge 4.2	Utilisé pour surveiller la position de la particule
APD	Excelitas	SPCM-ARQH-15	Réduction du nombre d’obscurité bénéfique Réseau
portes programmables sur le terrain	National Instruments	NI-7852r
Logiciel	National Instruments LabVIEW	d’excitation
de suivi	JDSU	FCD488-30
Objectif	ThorLabs	AC254-150-A-ML
L1 Lentille	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L2
Sténopé	ThorLabs	P75S	PH
Glan-Thompson Polariseur	ThorLabs	GTH5-A	GT
Plaque demi-onde	ThorLabs	WPH05M-488	WP
Lentille	ThorLabs	AC254-75-A-ML	L3
Lentille	ThorLabs	AC254-250-A-ML
L4 Lentille	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L5
Lentille	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L6
Dichroïque Miroir	Chroma	ZT405/488/561/640RPC
DC Filtre d’émission de fluorescence	Chroma	D535/40m	F
10/90 séparateur de faisceau	Chroma	21012	BS
PBS	Sigma	D8537
Nanoparticules fluorescentes 190 nm	Bangs laboratories	FC02F/9942
Nanoparticules fluorescentes 110 nm	Bangs laboratories	FC02F/10617
Coverslip	Fisher Scientific	12-545A
Powermeter	Thorlabs	PM100D
CMOS	Thorlabs	DCC1545M
SM1D12D		Iris	Thorlabs
	Mad City Labs	RM21

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