Article de méthode

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

DOI :

10.3791/56761

⸱

16 juin 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

Dans cet article

Résumé

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Un modèle animal est nécessaire pour décrypter le rôle des cellules tumorales (CTC) dans la promotion de la colonisation lors de métastases du cancer pulmonaire en circulation. Ici, nous avons mis en place et a effectué avec succès une in vivo test d’essai spécifiquement l’exigence de la fibronectine polymériques (polyFN) Assemblée sur CTC pour la colonisation de poumon.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Métastase est la principale cause de décès par cancer. Le rôle des cellules tumorales (CTC) dans la promotion des métastases cancéreuses, dans lequel la colonisation pulmonaire par CTC critique contribue à début processus métastatiques de poumon, de la circulation a été vigoureusement étudié. Ainsi, des modèles animaux sont la seule approche qui capture le processus systémique complète des métastases. Étant donné que les problèmes surviennent dans les modèles expérimentaux précédents pour examiner les contributions de PTC à l’extravasation des vaisseaux sanguins, nous avons établi un essai de colonisation en vivo poumon dans lequel un long-terme-fluorescence cellulaire-traceur, la carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE), a été utilisé pour étiqueter des cellules tumorales suspendu et la perfusion pulmonaire a été réalisée pour effacer non spécifiquement piégés CTC avant suppression pulmonaire, imagerie confocale et quantification. Fibronectine polymérique (polyFN) montée sur les surfaces de la CCT a été trouvée à la médiation de la colonisation dans l’établissement définitif des tissus de la tumeur métastatique pulmonaire. Ici, pour notamment tester l’exigence de l’Assemblée polyFN sur CTC pour la colonisation de poumon et extravasation, nous avons réalisé à court terme des essais de colonisation poumon dans lequel suspendu de cellules de carcinome de poumon Lewis (SARL) exprimant de manière stable FN-shARN (shFN) ou Scramble-shARN (shScr) et préalablement étiquetées avec 20 μM de CFSE inoculés par voie intraveineuse à des souris C57BL/6. Nous avons démontré avec succès que les capacités des cellules de shFN LLC à coloniser les poumons de souris ont été significativement diminuées par rapport aux cellules de shScr LLC. Par conséquent, cette méthodologie à court terme peut être largement appliquée pour démontrer précisément l’aptitude des PTC au sein de la circulation à coloniser les poumons.

Introduction

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Métastase est la principale cause de cancer mort1,2. Les cellules tumorales dérivées de tissus primaires entrer dans la circulation en suspension et survivent à divers défis hématogène, par exemple, anoikis, agressions immunitaires et dommages dus à la contrainte de cisaillement de la pression artérielle ou des contraintes géométriques, avant qu’ils soient capable de coloniser des organes éloignés, une étape clé dicter le succès de la métastase3,4,5,6. Par conséquent, vigoureux s’est efforcé actuellement en caractérisant les cellules tumorales circulantes (CTC) et la corrélation de ces caractéristiques avec les taux de survie du cancer patients7,8 , métastases et malignité de la tumeur , 9. étant donné que le processus de métastases du cancer représente précisément un événement in vivo , des modèles animaux sont la seule approche qui capture le processus systémique complète des métastases10,11,12 .

CTC devenue des tissus de la tumeur métastatique à travers de multiples événements cellulaires, y compris la colonisation des organes éloignés1,2. Cependant, les métastases plus couramment utilisés essais13,14,15 ne fournissent pas un moyen d’observer la colonisation de la CCT des organes éloignés. Par conséquent, une conception de test in vivo pour la visualisation de la colonisation de la CCT est absolument nécessaire. Bien que plusieurs in vivo et ex vivo courte colonisation de poumon à terme des essais ont été conçus, les problèmes et les inconvénients restent. Par exemple, alors que protéine de fluorescence verte (GFP)-tumeurs surexprimant les cellules ont été utilisées dans ces essais22,23, cela prend du temps à transfecter stablement et de cloner des cellules tumorales avec suffisamment d’intensité fluorescente GFP sous le microscope. De même, bien que la coloration transitoire des cellules tumorales avec le traceur de cellule à long terme CFSE a été employée pour remplacer les cellules tumorales exprimant le GFP, il reste difficile de juger si les cellules tumorales CFSE marqués sont attachées ou simplement présents au sein de la vascularisation des organes éloignés excisés16,17.

Fibronectine polymérique (polyFN) montée sur les surfaces des PTC s’est avérée critique contribuent à la mise en place finale de tumeur métastatique tissus18,19,20,21,22 . Ici, nous avons réalisé à court terme poumon essais de colonisation dans laquelle Lewis suspension de cellules de carcinome pulmonaire (SARL) stablement exprimant FN-shARN (shFN) ou scramble-shARN (shScr) et préalablement marquées avec CFSE inoculés par voie intraveineuse à des souris C57BL/6. Après 2 ou 3 jours, poumons de souris ont été tout d’abord perfusés avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), afin de supprimer complètement les seules CTC dans le système vasculaire avant d’être soumise à la microscopie confocale et quantification des SARL colonisant les poumons. Nous avons montré clairement que les numéros de colonisant les poumon shFN SARL et les nodules de tumeur ont été significativement réduits par rapport aux shScr SARL, corroborant considérablement le rôle de l’Assemblée polyFN sur CTC en facilitant la colonisation et la croissance des PTC dans le poumons. Notre étude garantit davantage enquête pour le rôle de polyFN dans les métastases du cancer.

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Protocole

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Toutes les expériences sur des souris ont été effectuées conformément aux lignes directrices de notre Institut (le Guide for Care and Use of Laboratory Animals, NCKU Medical College).

1. préparation des Instruments, les milieux de Culture et plats

  1. Avant de commencer les protocoles expérimentaux, obtenir les sutures chirurgicales stériles, seringues de 1 mL avec aiguille 26G/0,5 cm (pour queue injection dans la veine), seringues de 3 mL avec aiguille 24G/cm 3 (pour perfusion pulmonaire), modifié Eagle Media (DMEM de Dulbecco), solution de trypsine-EDTA (5 la trypsine g/L et 0,53 mM), sérum fœtal (SVF), 1 x PBS (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2PHO4et 1,8 mM KH2PO4) et récipients de culture de 6 cm.

2. la préparation et la récupération des cellules tumorales en Suspension

  1. Préparer stérile modifié Eagle Media (DMEM de Dulbecco) contenant 10 % ou 20 % FBS et fraîchement ajouter 0,05 %, solution 1 PBS x et 2 mM de L-glutamine la trypsine-EDTA.
  2. Les cellules de DMEM supplémenté de 10 % la culture FBS à 37 ° C et cultivez-les dans la boîte de Petri, il y a confluence de 70 à 80 %.
  3. Enlever les milieux de culture (DMEM) de la vaisselle, suivie de deux lavages avec 2 mL de PBS stérile 1 x.
  4. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA dans les plats pour couvrir complètement toutes les cellules. Retirer 800 μL de solution immédiatement et laissez seulement 200 μL dans les plats. Incuber les boîtes à 37 ° C pendant 30 s à 1 min (selon le type de cellule) et attendez jusqu'à ce que la plupart des cellules sont dans l’état suspendu.
  5. Ajouter 1 mL de frais DMEM contenant 10 % FBS directement dans les plats d’arrêter l’activité enzymatique de la trypsine et vigoureusement pipette de la suspension cellulaire haut et en bas avec une pipette de 1000 µL pour préparer une suspension monocellulaire.
  6. Les cellules de transfert de la capsule dans un tube de microtubes de 1,5 mL et tournez en bas les cellules à température ambiante à 162 x g pendant 3 min.
  7. Aspirer le surnageant et remettre les cellules de la tumeur dans 1,5 mL DMEM contenant 20 % de SVF et sur la fin tourner les cellules en suspension à 37 ° C pendant 2 h.
    Remarque : Si le milieu devienne jaune lors de la reprise, échanger le milieu vieux avec un milieu frais contenant 20 % FBS.

3. fluorescence la coloration et l’analyse des cellules tumorales en Suspension avec carboxyfluorescéine Succinimidyl Ester (CFSE)

  1. Après la récupération de cellules en suspension, compter le nombre de cellules viables approprié avec le bleu Trypan dans un Neubauer comptant chambre pour la titration de la fluorescence des doses de coloration et de queue de la veine injection.
  2. Tournez en bas les cellules à 162 x g à température ambiante pendant 3 mn et remettre que les cellules boulettes dans 1 mL de stérilisé 1 x PBS, suivi par centrifugation à 162 x g pendant 3 min à température ambiante.
  3. Remettre en suspension les cellules granulés 500 µL de 1 X PBS contenant 10 % FBS et 0, 5, 10, 20 ou 40 µM CFSE pour la titration de dose et incuber à 37 oC pendant 10 min dans l’obscurité, la suspension de cellules.
  4. Tournez en bas les cellules à 162 x g à température ambiante pendant 3 mn et remettre en suspension les cellules granulés avec 4 mL de DMEM contenant 1 % FBS. Répétez cette étape de laver trois fois plus. Remettre en suspension les cellules granulés avec 4 mL de DMEM seul pendant le lavage final.
  5. Mais les cellules marquées CFSE au fluorescence-lancée de cellules tri analyse (FACS) afin de quantifier l’intensité de la fluorescence d’une seule cellule, ou injection dans la veine de queue.
    Remarque : Conservez les cellules sur la glace avant d’effectuer les injections de veine FACS analyse ou de la queue.

4. poumon colonisation Assay

  1. Préparer les cellules marquées avec 20 µM CFSE (voir étapes 3.1 à 3.4).
    NOTE : Décider de la dose de travail du CFSE pour le marquage des cellules tumorales, basés sur les résultats de titrage de l’analyse de FACS (voir étape 3.3).
  2. Les queues de 4 à 6 semaines d’échauffement-vieilles souris C57BL/6 mâles (6 souris) avec une lampe à halogénures pendant 5-10 min sur une base de par-souris à dilater les veines de queue de souris.
  3. Bien mélanger et aspirer les cellules tumorales CFSE marqués avec une seringue de 1 mL (26Gx1/2), en évitant les bulles dans la suspension cellulaire (avec une densité finale de 5 x 106 cellules/mL).
  4. Soigneusement injecter 1 x106 cellules de tumeur CFSE marqués dans 200 µL de DMEM dans la veine de queue de souris, qui devrait être déposée dans une drisse de souris.
    Remarque : Pendant l’injection, si l’aiguille est placée directement dans la lumière de la veine caudale, cellules tumorales doivent être facilement transmises dans la circulation sans avoir besoin de pousser fort sur la seringue. S’il est difficile de pousser les cellules tumorales par, ils ont très probablement été injectés en dehors de la veine caudale, dans l’espace sous-cutané.
  5. Diviser les souris qui ont reçu par voie intraveineuse les cellules tumorales CFSE marqués en deux groupes : un groupe subira une perfusion pulmonaire suivie par microscopie confocale et quantification d’ImageJ dans l’essai de colonisation du poumon et l’autre sera laissée seul pendant 4-5 l’essai de semaines dans la colonisation de poumon à long terme.
  6. À 20, 38 ou 45 h et avec 1 x 106 cellules de tumeur injectés par voie intraveineuse pendant un titrage de cours - et dose-dépendante du temps, anesthésier avec tumeur de souris avec zoletil de 50 à 75 mg/kg 50, qui est un bien acceptée et bon anesthetizer23.
    Remarque : Utilisation vétérinaire onguent sur les yeux de la souris pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  7. Couper longitudinalement la peau et les tissus sous-cutanés de l’abdomen dans la région de la poitrine avec les ciseaux chirurgicaux. Ouvrir la cavité pleurale avec ciseaux chirurgicaux et forceps pour exposer entièrement le cœur et les poumons.
    Remarque : Veillez à éviter de couper les vaisseaux sanguins.
  8. Lier la veine cave supérieure (SVC) et la veine cave inférieure (VCI) avec des sutures chirurgicales stériles pour empêcher le reflux de la solution de perfusion durant la perfusion pulmonaire.
  9. Couper la paroi du ventricule gauche avec des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir une fissure (environ 2 à 4 mm) pour vidanger la solution de perfusion des poumons.
  10. Injecter la solution 1 PBS x dans le ventricule droit avec une seringue de 3 mL et éliminer la solution drainée avec aspiration constante durant la perfusion pulmonaire jusqu'à ce que les poumons tourner à partir d’une couleur rougeâtre à complètement pâle.

5. confocal Imagerie microscopique et l’analyse des cellules de tumeur poumon-colonisé

  1. Retirez les poumons maintenant-pale de la cavité pleurale et séparer les cinq lobes en coupant les trachée et du tissu conjonctif des ligaments avec ciseaux et pinces chirurgicales24.
  2. Préparer un support civière comme poumon comme illustré à la Figure 3 b par une suture en nylon d’enroulement autour de deux tiges de métal pour produire une texture réticulée avec un espace entre les deux tiges pour le placement des lobes du poumon. Définissez le titulaire du poumon dans un plat de 6 cm.
    Remarque : Le titulaire du poumon servira à stabiliser les lobes pulmonaires sous la lentille d’un microscope confocal.
  3. Introduire et fixer les lobes pulmonaires sur la texture réticulée du détenteur du poumon. Couvrir et humidifier les lobes pulmonaires avec 1 x PBS.
  4. Sous réserve de la boîte de Petri de 6 cm hébergeant les lobes du poumon sur le support de pulmonaire à microscopie confocale pour capturer des images de fluorescence enregistrant les cellules tumorales colonisant les poumons.
  5. Pour l’imagerie, utiliser les lentilles de l’objectif (5 X, MPLN, NA : 0.1, WD : 20, Air).
  6. Faire tourner la roue de filtre à NIBA (excitation/émission ; 470-495 nm/510-550 nm) et d’utiliser un laser à 488 nm pour exciter CFSE, de visualiser clairement les images de points de fluorescence dans les lobes pulmonaires.
  7. Faire tourner la roue de filtre à R690 (pour MaiTai HP DeepSee laser) pour balayer les 2,0 µs/pixel balayage vitesse et optimiser l’HV, Gain et offset niveaux.
  8. Capturer des images de fluorescence (512 x 512 pixels) en utilisant le logiciel de microscope avec un 10 µs/pixels vitesse de balayage.
  9. Quantifier et d’analyser statistiquement les images microscopiques à l’aide de logiciels ImageJ et GraphPad comme décrit précédemment21.

6. longue durée des essais de colonisation pulmonaire

Remarque : Répétez les étapes 4.1 à 4.5.

  1. Sacrifier les souris après l’inoculation de cellules de tumeur pendant 4-5 semaines et fixer leurs poumons avec liquide de Bouin25 pendant 1 à 2 jours.
  2. Quantifier et d’analyser statistiquement les nodules de tumeur des poumons de souris avec le logiciel21.

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Résultats

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Avant d’effectuer l’essai de colonisation en vivo poumon tel qu’illustré à la Figure 1 a afin de vérifier si polyFN sur les cellules tumorales suspension intervient dans la colonisation du poumon et/ou extravasation dans la facilitation des métastases, on titré tout d’abord différentes concentrations de CFSE, un composé fluorescent qui est cellule perméable et covalence conjugués intracellulaire contenant des amines molécules26

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Discussion

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Ainsi que de long terme poumon colonisation dosages, court terme méthodologie nous avons utilisé ici pour évaluer in vivo colonisation pulmonaire par PTC dans des organes éloignés clairement dévoilé et différencie le rôle spécifique de polyFN monté sur CTC en colonisant les poumons, qui a ensuite conduit à l’extravasation et les processus métastatiques18,19,20,21. Bien que le marquage ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Dr. Chang Ming-Min et Mme Ya-Hsin Cheng pour leur support technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et la technologie de Taiwan (la plupart-103-2325-B-006-009, plupart-104-2325-B-006-001, la plupart-105-2325-B-006-001 et MOST-106-2320-B-006-068-MY3) et le ministère de la santé et du bien-être social (MOHW106-SAB-B-211-144004). Nous sommes également reconnaissants pour le soutien du laboratoire de recherche de base de la College of Medicine, National Cheng Kung University, pour leur microscope confocal multiphotonique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
Bovine Serum Albuminsp ;( BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taïwan)101-9048-46-8
Bouin’s FluidMCC(medical chemical corporation)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferation Dyeebiosciences65-0850-85Nom complet : Carboxyfluorescéine succinimidyl ester
Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)  ;(Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-6381-92-6Pour une solution préparée de trypsine-EDTA( Concentration finale : 0,53 mM )  ;
Sérum fœtal bovin (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Carcinome pulmonaire de Lewis (LLC)ATCC, Manassas, VA, USACRL-1642
L-Glutamine, USP  ;(Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
Chlorure de potassium (KCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7447-40-7Pour préparé 1X PBS ( Concentration finale : 2,7 mM )
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7778-77-0Pour préparé 1X PBS ( Concentration finale : 1,8 mM )
Sodium chlorure (NaCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taïwan)101-7647-14-5Pour préparé 1X PBS ( Concentration finale : 137mM )
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-10039-32-4Pour préparé 1X PBS ( Concentration finale : 10mM )
Trypan BlueSigma AldrichT61460,5 g mélanger avec 100 mL 1X PBS
TrypsineSigma AldrichT4799Pour une solution préparée de trypsine-EDTA ( Concentration finale : 5g/L )
Zoletil 50VirbacÀ diluer avec 1X PBS  ;
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420KUBOTA Co.2420
Plat de culture (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.
Seringue jetable (avec aiguille)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm ;3 ml & 26G/0,5 cm ;1 ml
Mélangeur bout à boutC.T.I YOUNG CHENNTS-20Pour la récupération des cellules en suspension  ;
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
ForcepsDimeda10.102.14
Forma Direct Heat CO2incubateur Thermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Dispositif de contention pour souris (Dispositif de contention cylindrique 15-30 g)Stoelting51338
Microscope confocal multiphotonique BX61WIOlympusFV1000MPE
Chambre de comptage NeubauerMarienfeld-Superior640010
Ciseaux chirurgicauxDimeda08.370.11
Sutures chirurgicales  ;UNIK SUTURES CHIRURGICALES MFG. CO.N° 0034Noir Soie tressée ; non résorbable (25YD ; U.S.P. 4/0)
1,5 mL Tube à microcentrifugerWuxi NEST Biotechnology Co.
tube Greiner de 15 mLGreiner bio-one188271
705001615001

Références

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Cellules tumorales circulantesMarquage au CFSEPerfusion pulmonaireMicroscopie confocaleAssemblage de la fibronectineCarcinome pulmonaire de LewisInoculation intraveineuseSouris C57BL 6Imagerie de fluorescence

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