Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Résumé

Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour la préparation axée sur la sublimation du formol fixé tissu destiné à la spectrométrie de masse d’imagerie.

Résumé

L’utilisation de désorption-ionisation laser assistée par matrice, spectrométrie de masse (MALDI MSI) d’imagerie a rapidement élargi, car cette technique analyse une foule de biomolécules de médicaments et de lipides à N-glycans. Bien qu’il existent de différentes techniques de préparation d’échantillon, détection des peptides de formaldéhyde préservé des tissus reste l’un des défis plus difficiles pour ce type d’analyse par spectrométrie de masse. Pour cette raison, nous avons créé et optimisé une méthodologie robuste qui conserve les informations spatiales contenues dans l’échantillon, tout en suscitant le plus grand nombre de peptides ionisables. Nous avons visait également à atteindre cet objectif de manière simple et rentable, éliminant ainsi l’erreur potentielle de partialité ou de la préparation, qui peut se produire lorsque l’utilisation automatisée instrumentation. Le résultat final est un protocole reproductible et peu coûteux.

Introduction

Spectrométrie de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) d’imagerie a été employée comme technique d’image basé pendant deux décennies^1,2, analyser une gamme de biomolécules, y compris : lipides³, peptides^{2 ,4}, protéines^2,5, métabolites^6,7, N-glycans⁸et des molécules synthétiques tels que les médicaments thérapeutiques^9,

Protocole

ATTENTION : Toutes les précautions de sécurité en vigueur devraient suivre lors de l’exécution de cette procédure, y compris l’utilisation d’équipement de protection individuelle approprié (PPE) (p. ex., les sarraus de laboratoire, gants en nitrile, lunettes de sécurité, etc.)

1. préparation des réactifs et du matériel

1. Préparation des solutions
   1. Pour préparer 500 mL de liquide de Carnoy, mélanger 100 % éthanol (EtOH), le chloroforme et acide acétique glacial dans un 6 : rapport de 3:1 v/v/v dans une bouteille propre Schott.
   2. Pour rendre liquide nitrocellulose (NC), dissoudre m....

Résultats

Si suivies correctement, ce protocole produit des images qui représentent clairement la morphologie générale du tissu sans les égratignures ou autres déformations (Figure 1). La validation idéale pour une préparation de l’échantillon correctement exécutée, est la capacité de distinguer entre les différentes structures physiques en changeant la molécule étant lus (Figure 2).

Discussion

Ce protocole a été conçu pour maximiser la génération des espèces moléculaires ionisables tout en éliminant les délocalisation d’analytes. Les principaux facteurs impliquent en utilisant le même principe primordial lors de l’application de matrice, digérer l’échantillon ou recristalliser après sublimation²⁴; savoir, qu’un même dépôt de vapeur, de matrice ou autrement, doit être créée et maintenue. Pipetage solvants nettoyants pour recristallisation et digestion, uniformément sous l’échantillon, em.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cryo Microtome	Leica	CM3050	Pour la préparation et la section des tissus.
Lames de microscope à l’oxyde d’indium et d’étain	Bruker	8237001	Pour la préparation et la section des tissus.
Coplin Pots	Sigma Aldrich	S5516	Pour la préparation et la section des tissus.
Autocuiseur	Kambrook	KPR620BSS	Pour la préparation et la section des tissus.
Sublimator	Chem Glass	NA	Pour la procédure de sublimation. De conception similaire à celle du CG-3038, il a cependant été fabriqué sur mesure.
Bain de sable	NA	NA	Pour la procédure de sublimation. Sable de rivière de qualité fine maintenu dans une feuille d’aluminium pliée provenant de l’extérieur et non d’une entreprise spécifique
Boîte de Pétri en verre	Sigma Aldrich	CLS70165100	Pour la procédure de sublimation.
Pompe à vide	NA	NA	Pour la procédure de sublimation. Provenant en pièce détachée d’un vieux spectromètre de masse  ;
Piège à froid	Chem Glass	CG-4510-02	Pour la procédure de sublimation.
Plaque chauffante	John Morris	EW-15956-32.  ;	Pour la procédure de sublimation.
Boîte de Pétri en plastique	Sigma Aldrich	Z717223	Pour la procédure de sublimation.
37 ° ; C INCUBATEUR	N.A.O	Pour	la procédure de sublimation. Sans objet, l’incubateur est non stérile et âgé de plus de 30 ans.
Papier buvard	Sigma Aldrich	P7796	Pour la procédure de sublimation.
Nitrocellulose	Sigma Aldrich	N8395	Pour le lavage des lames.
Acétone	Sigma Aldrich	650501	Pour le lavage des lames.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	Pour le lavage des lames.
100 % EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Pour le lavage des lames.
70 % EtOH	Sigma Aldrich	NA	Pour le lavage des lames. Fabriqué en laboratoire à partir de 95 % d’éthanol stock.
Chloroforme	Sigma Aldrich	C2432	Pour le lavage des lames.
Acide acétique glacial	Sigma Aldrich	ARK2183	Pour le lavage des lames.
Tris HCL pH 8,8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Pour le clivage protéolytique. Poudre fabriquée à 1M suivie d’un équilibrage avec 32 % HCl à PH 8.8
Milli Q Eau ultra-pure	Sigma Aldrich	NA	Pour le clivage protéolytique. Purification réalisée en interne par le système de purification de l’eau sartorique
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	Pour le clivage protéolytique.  ;
Trypsine	Sigma Aldrich	T0303	Pour le clivage protéolytique.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Pour la recristallisation.
Acétonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	Pour la recristallisation.
Acide trifluoroacétique (TFA)  ;	Sigma Aldrich	302031	Pour la recristallisation.

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