Article de méthode

Un test pour identifier les agonistes des récepteurs couplés aux protéines G, antagonistes et MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES cinétiques basés sur la Fluorescence Ca2 + mobilisation

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DOI :

10.3791/56780

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20 février 2018

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1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Dans cet article

Résumé

Le test cellulaire décrit est conçu pour l’identification des récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4)-interaction des agents qui inhibent ou stimulent, soit compétitif ou façon allostérique,le Ca 2 + intracellulaire initiée par activation CXCR4.

Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont d’une grande importance pour l’industrie pharmaceutique car ils sont impliqués dans plusieurs maladies humaines et comprennent bien validées cibles d’intervention thérapeutique. Découverte de composés de plomb, y compris les petites molécules synthétiques, inhibent spécifiquement la fonction de receveur, est un premier pas important dans le développement de médicaments et s’appuie sur des analyses cellulaires sensibles, spécifiques et robustes. Nous décrivons ici une analyse cinétique cellulaire avec un afficheur fluorescent principalement destinée à identifier les antagonistes des récepteurs spécifiques qui inhibent la libération2 + Ca intracellulaire évoquée lors de l’activation du récepteur chimiokines CXC 4 (CXCR4) par ses ligand endogène, le ligand de chimiokines CXC 12 (CXCL12). Un avantage majeur de cette méthode est qu’elle permet aussi de dépister des composés dotés des propriétés agonistes intrinsèques (c'est-à-dire, composés provoquant une augmentation de Ca2 + concentration intracellulaire en l’absence de CXCL12) ou composés modulant la fonction du récepteur via l’interaction avec des sites de liaison allostérique (c.-à-d., des MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs (PAMs et NAMs, respectivement)). Sur le côté, auto-fluorescente composés pourraient interférer avec une lecture de l’essai, entravant ainsi l’interprétation des données fiables. Probablement ce dosage peut être implémenté, avec des adaptations minimes, comme un test de découverte de médicaments génériques pour de nombreux autres RCPG dont l’activation entraîne une libération de Ca intracellulaire2 +.

Introduction

RCPG est une super-famille important de protéines de surface de cellules qui activent les cascades de transduction de signal lors de la liaison du ligand extracellulaire. Ils peuvent être activés par une grande variété de stimuli, y compris les peptides, hormones protéiques, les amines biogènes et lipides, qui se traduit par l’ouverture de diverses voies de signalisation intracellulaire et réponses biologiques éventuellement1,2 . En outre, RCPG est impliqués dans un grand nombre, si pas tous, les processus physiologiques et du développement et plusieurs maladies humaines sont associées à dysfonctionnelle surexpression de signalisation ou récepteur de RCPG. RCPG est donc parmi les cibles pharmacologiques plus validés en médecine1,3.

Typiquement, un flux de travail découverte de drogue GPCR commence avec des essais de criblage cellulaire permettant l’identification de composés tels que de petites molécules, des anticorps monoclonaux et des peptides qui peuvent moduler l’activité de l’un RCPG particulière. Dans la découverte de médicaments GPCR beaucoup de différents types de tests existe pour rechercher ces composés, dont la plupart est compatible avec les campagnes de milieu - de criblage à haut débit. Les analyses les plus utilisés sont des expériences de liaison du récepteur, fluorescence ou luminescence base de tests de détection des fluctuations du niveau de ce que l'on appelle messagers secondaires (p. ex., Ca2 +, adénosine monophosphate cyclique (AMP)), phénotypiques tests de dépistage et β-arrestine recrutement assays4. Le choix d’un type particulier de test peut dépendre de plusieurs facteurs, mais est également déterminé par la connaissance préalable des propriétés de signalisation d’un RCPG donnée. Agoniste liant aux un RCPG induit un changement conformationnel catalysant l’échange de diphosphate de guanidine (PIB) pour triphosphate (GTP) de la guanidine sur la sous-unité α des protéines G hétérotrimériques. Par la suite, la sous-unité de GTP - Gαse dissocie de la sous-unitéβγ G et les deux sous-unités lancera également les voies de signalisation. Hydrolyse de la GTP-molécule et re-l’association subséquente du Gα- PIB et sous-unitésβγ G restaurera la protéine G dans sa conformation inactive5,6. Basé sur la similarité de séquence de la sous-unitéα G désignent les différents types de protéines G (G,s, Gje, Gq, G12/13)7. Signalisation via le Gα sous-unité donne lieu à plusieurs réponses typiques tels que l’augmentation (via Gs) ou diminuer (via Gj’ai) de la production d’AMP cyclique et des mobilisation intracellulaire de Ca2 + (via Gq)5 ,,7. Sous-unitésβγ G sont également capables d’induire des voies effecteurs intracellulaires. Par exemple, lors de l’activation de Gj’ai-GPCRs couplés, Gβγ peuvent stimuler directement la phospholipase C (PLC-β) pour produire le triphosphate d’inositol (IP-3) qui déclenche la libération de Ca2 + des réserves intracellulaires7 . Suite à l’activation des récepteurs, les RCPG est phosphorylés par kinases GPCR (krg) qui favorise l’interaction avec le β-arrestins. Ce processus termine G protéines de signalisation et mène à l’internalisation et finalement la désensibilisation du récepteur. Β-arrestins sont également capables de former des complexes moléculaires multiples qui peuvent déclencher des autres voies de signalisation indépendantes de protéine G8de signalisation.

Au sein de la sous-famille des récepteurs de chimiokines, le Gj’ai-couplé CXCR4 est un RCPG qui a soulevé beaucoup d’intérêt comme une cible prometteuse pour la découverte de médicaments. Compte tenu de son rôle établi comme un corécepteur majeur pour le virus d’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) l’entrée virale et infection, composés ciblant CXCR4 étaient initialement développés comme de candidats médicaments anti-VIH9. Plus récemment, un nombre croissant de preuves a conduit à un rôle important pour CXCR4 dans la tumorigenèse et cancer du sein métastase, ce qui en fait une cible thérapeutique validée en oncologie ainsi10. CXCR4 est fortement exprimée dans plus d’une vingtaine de types de cancer chez l’homme et la survie des cellules tumorales contrôles, prolifération et migration ainsi que l’angiogenèse tumorale liés10. CXCR4 antagonistes des différentes classes chimiques ont été précédemment décrits11,12, mais seulement la petite molécule qu'amd3100 n’est actuellement homologué pour une utilisation en clinique comme agent de mobilisation des cellules souches utilisée pendant le traitement du lymphome et myélome patients13,14. Les essais cliniques sont en cours pour évaluer l’innocuité et l’efficacité de plusieurs autres antagonistes CXCR4 dans les maladies humaines différentes, mais avec un fort accent sur l’oncologie12. Étant donné les nombreuses applications potentielles pour CXCR4 antagonistes, la recherche de nouveaux composés avec des propriétés pharmacocinétiques améliorées, une biodisponibilité améliorée ou potentiellement moins d’effets secondaires est justifiée.

Dans les présentes, un cinétique dosage cellulaire à base de fluorescence est principalement utilisé pour dépister composés capables d’inhiber CXCR4 est décrite. La mesure fluorescente de cette méthode repose sur l’augmentation transitoire de la concentration2 + Ca intracellulaire évoquée lors de l’activation de CXCR4 par son agoniste endogène, le ligand de chimiokine CXCL12 (autrefois appelés cellules stromales dérivées (1α) facteur SDF1-α)) et l’inhibition éventuelle de cette réponse2 + Ca induite par CXCL12 de composés particuliers. Dans cet essai, U87 glioblastome humain cellules exprimant le récepteur CXCR4 humain de manière stable sont utilisés. Dans le même temps, ces cellules ne possèdent pas une expression endogène de CXCR7, un récepteur de chimiokine connexes qui lie également CXCL1215,16,17. CXCR7 a auparavant également avéré capable de former des hétérodimères avec CXCR4, modulant ainsi les propriétés de signalisation de ce récepteur ce dernier18. Fluctuations du niveau d’intracellulaire Ca2 + médiée par CXCR4 sont surveillées en chargeant le CXCR4 des cellules avec ester acétoxyméthyl fluo-2 (AM), une cellule perméable haute affinité fluorescent Ca2 ++ -lie de colorant. Fluo-2 AM est une molécule fluorescente de longueur d’onde unique qui peut être excitée à 490 nm tandis que sa fluorescence d’émission est mesurée à 520 nm. Cette fluorescence d’émission augmente à la fixation Ca2 + , avec une large gamme dynamique entre le Ca2 +-lié et non consolidé État. L’augmentation du signal fluorescent est transitoire, qui se produisent dans un intervalle de quelques minutes et décroîtra par la suite. La hauteur du pic des corrélats fluorescent d’émission supplémentaires au niveau de l’activation du récepteur. L’analyse elle-même est réalisée à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence équipé d’une caméra CCD intensifié (ICCD) qui possède un système de pipetage intégré qui permet la normalisation du pipetage lors de l’essai (voir Table des matières) . En outre, la mesure simultanée du signal fluorescent dans tous les puits d’une microplaque est un autre avantage majeur du lecteur de fluorescence qui est utilisé. Au cours de la première partie du dosage les composés incriminés (p. ex., un panel de petites molécules à une concentration fixe ou dans une série de dilutions) sont ajoutés à la fluo-2 AM chargé CXCR4+ U87 cellules suivie d’un ~ 10 min d’incubation au cours de laquelle l’effet agoniste potentiel des composés est continuellement mesurée en temps réel. Ensuite, l’agoniste endogène (c'est-à-direCXCL12) est ajouté aux cellules pour évoquer une augmentation transitoire induite par le CXCR4 au niveau intracellulaire Ca2 +. Durant cette partie de l’analyse de l’activité antagoniste potentielle des composés testés peut être évaluée. Un aperçu schématique du déroulement général de l’essai est présenté dans la Figure 1.

Bien que ce test Ca2 + mobilisation a d’abord été utilisé pour identifier et déterminer la puissance inhibitrice des antagonistes compétitifs de CXCR4 (c.-à-d., les composés qui empêchent l’agoniste endogène pour lier et stimuler le récepteur), elle aussi peuvent identifier les agonistes des récepteurs et, en outre, les composés qui exercent leurs fonctions en se liant à des sites allostériques (c.-à-d., les sites qui diffèrent sur le plan topographique du site de liaison d’orthosteric occupé par l’agoniste endogène). Exemples de cette dernière catégorie de composés agonistes allostériques et PAMs et NAMs19,20. Considérant que les antagonistes des récepteurs spécifiques, mais aussi les NAMs inhiberait la réponse induite par CXCL12 Ca2 + , PAMs renforcerait cette réponse ( Voir aussi section). Bien que le test décrit ci-après spécifiquement des cibles CXCR4, on prévoit que cette méthode peut être appliquée aux autres RCPG avec un effort minimal d’optimisation, au moins si ils le signal par l’intermédiaire de la libération d’intracellulaire Ca2 +.

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Protocole

Remarque : Toutes les étapes décrites aux chapitres 1 et 2 sont effectués dans des conditions stériles dans une enceinte à flux laminaire.

1. maintien de U87. Cellules CD4.hCXCR4

  1. Cultiver les cellules T75 flacons de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
    Remarque : La lignée cellulaire in vitro utilisée dans le présent protocole est une lignée de cellules de glioblastome U87 exprimant de manière stable cluster de différenciation 4 (CD4) et l’homme CXCR4 et a été décrit précédemment17. Expression à la surface cellulaire des CD4 et CXCR4 est surveillée de façon continue par cytométrie en flux et les niveaux d’expression demeurent constants au fil du temps (~ 100 % CD4+ et ~ 100 % CXCR4+ cellules). Une description détaillée de la génération de la lignée cellulaire utilisée et de la procédure de cytométrie de flux pour enquêter sur les niveaux d’expression de récepteurs n’est pas dans le champ d’application du présent protocole.
    1. Cellules de sous-culture à confluence de 80 à 85 %. Permettre à tous les réactifs atteindre la température ambiante (RT) avant mise en culture cellulaire.
    2. Enlevez le milieu de culture conditionné des cellules et lavez la monocouche de cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de 5 mL (PBS).
    3. Ajouter 3 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et répartir uniformément sur la monocouche de cellules. Puis enlever l’excès de trypsine-EDTA et incuber jusqu'à 5 min à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher.
    4. Ajouter 10 mL de milieu de croissance complète fraîche (de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10 % sérum bovin fœtal (SVF) + 0,01 M HEPES + agents de sélection appropriée). Remettre en suspension les cellules par pipetage doucement verticalement. Transférer la suspension de cellules dans un tube stérile de 50 mL.
    5. Compter le nombre de cellules viables à l’aide d’une méthode de choix. Dans le cas de cellules de glioblastome U87, viabilité atteint généralement ~ 100 %.
      Remarque : Le nombre de cellules peut être déterminé de plusieurs manières. Nous utilisons régulièrement un système d’analyse cellulaire automatisée basé sur (voir Table des matières) une coloration bleu trypan selon son standard de gestion des procédures, mais autres manières devrait fonctionner tout aussi bien.
    6. Ajouter 2 x 106 ou 3 x 106 cellules (viable) pour un volume final de milieu de croissance fraîche de 25 mL dans un flacon de culture T75 et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
      Remarque : Si les 3 x 106 cellules servent les cellules atteindra confluence de 80 à 90 % après 2 jours. Si 2 x 106 cellules sont utilisés, ils atteindront la confluence même après 3 jours. Le taux de croissance des cellules devrait d’abord être déterminé empiriquement si autres lignées cellulaires sont utilisées.

2. ensemencement des cellules pour le dosage de Ca2 + mobilisation

  1. Lors de la journée de cellule passage (jour 0), manteau noir à parois en polystyrène plaques à 96 puits avec clear le fond (voir la Table des matières) avec une solution de gélatine de 0,1 % pour faciliter la fixation des cellules.
    NOTE : Revêtement des plaques 96 puits avec de la gélatine peut être omise si revêtus de plaques, qui sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières), sont utilisés. Il est recommandé d’évaluer l’utilisation des plaques revêtus au lieu de revêtement manuelle dans chaque lignée cellulaire incriminé avant de continuer avec le protocole.
    1. Préparer la solution de gélatine en ajoutant 1 g de gélatine pour 100 mL de PBS pour obtenir une solution à 1 %. Diluer 10 x avec du PBS avant une utilisation ultérieure. Pour améliorer la solubilité de la gélatine, chauffer la solution à 37 ° C.
    2. Ajouter 100 µL de solution de gélatine 0,1 % / puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
  2. Entre-temps, préparer les cellules pour les semis en la plaque 96 puits.
    1. Détacher les cellules du flacon de culture, les remettre en suspension dans un milieu de croissance fraîche et les compter à l’aide de la méthode de coloration bleu trypan.
    2. Tournez en bas les cellules dans un tube de 50 mL pour 5 min à 400 x g à température ambiante.
    3. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance fraîche (DMEM + 10 % BF + 1 % HEPES, sans traitements antibiotiques) pour obtenir une densité de 0, 1 x 106 cellules/mL (viable).
  3. Enlever la solution de gélatine les plaques paroi noir avec fond transparent en renversant sur la plaque et en l’asséchant sur un mouchoir en papier. Ajouter 200 µL/puits de PBS pour enlever l’excès gélatine et retournez la plaque à nouveau.
  4. Pipeter 200 µL de la suspension cellulaire (correspondant à 0,2 x 105 cellules) / puits de la plaque de 96 puits enduit de gélatine (dorénavant un cette plaque va être ci-après dénommé la « plaque de mesure »).
  5. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.

3. chargement des cellules avec une fluorescence Ca2 + -colorant photosensible

  1. Jour 1 exécuter le réel Ca2 + mobilisation test, commençant par le chargement des cellules ensemencées avec le fluorescent Ca2 +-liaison teindre fluo-2 AM.
    1. Préparer du tampon en ajoutant 40 mL HEPES (1 M) de 200 mL Hank Balanced Salt solution (HBSS, 10 x, sans rouge de phénol, sans bicarbonate de sodium). Ajouter de l’eau ultrapure pour obtenir un volume final de 2 L et ajouter 4 g l’albumine sérique Bovine (BSA). Dissoudre la BSA par l’intermédiaire d’agitateur magnétique. Ajuster le pH à 7,4 (avec NaOH) et filtrer la solution.
      NOTE : Le même tampon, dénommé « tampon », est utilisé pendant toutes les étapes suivantes.
    2. Préparer une solution (4 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)) du fluorescent Ca2 +-sensibles aux colorants fluo-2 AM. Éviter une exposition excessive à la lumière. Dissoudre 1 mg fluo-2 AM (poids moléculaire : 1 061 g/mol) à 235,6 µL DMSO.
    3. Préparer une solution de fluo-2 AM. Pour une plaque de 96 puits assay mélanger 12,5 µL de solution mère de fluo-2 AM (4 mM) et 12,5 µL de solution de tensioactif nonionique polyol (p. ex., Pluronique f-127) (20 % poids/volume dans le DMSO, voir Table des matières). Ajouter 22 µL de ce mélange dans du tampon d’essai 11 mL dans un tube de 15 mL. La concentration finale de fluo-2 AM est 4 µM.
      Remarque : L’agent de surface non ionique est utilisé comme agent de dispersion pour améliorer la solubilité aqueuse de fluo-2 AM et, par conséquent, pour améliorer le chargement de la cellule. Pour solubiliser le surfactant dans le DMSO, chauffer l’échantillon à 37 ° C et mélanger régulièrement pour obtenir une solution homogène.
    4. Retirez le milieu de culture de cellules préalablement ensemencées dans la plaque de 96 puits mesure en renversant sur la plaque et sécher sur une serviette en papier.
    5. Ajouter 100 µL de solution de colorant par puits à l’aide d’une pipette multicanaux de chargement et incuber pendant 45 min à ta dans l’obscurité.

4. préparation de 96 puits polypropylène plaques contenant le Ligand de chimiokine CXCL12 ou les composés incriminés

  1. Obtenir des plaques de 96 puits fond rond polypropylène (PP) (voir la Table des matières).
    1. Laissez agir la solution stock de CXCL12 (1 mg/mL) et la solution des composés incriminés s’équilibrer à température ambiante.
      NOTE : La solution mère de CXCL12 est établie dans l’eau ultrapure additionné de 0,01 % Tween20 et conservé à-20 ° C comme parties aliquotes à usage unique.
    2. Préparer un 5 x solution concentrée de CXCL12 dans du tampon (250 ng/mL, ce qui équivaut à 31,25 nM) et une 5 x concentrée dilution de chaque composé (dans du tampon).
    3. Diluer la solution mère dans la plaque à 96 puits appropriée, selon un schéma prédéfini. Dispense de 75 µL/puits en la plaque contenant CXCL12 (la « plaque de chemokine »), distribuer 50 µL/puits dans la plaque contenant les composés (le « plat composé »).
      NOTE : Les composés et CXCL12 deviendra enfin dilué 5 x sur la distribution dans la plaque de la mesure. Il est également important d’inclure les puits de contrôle négatif contenant uniquement du tampon à la fois le plat composé ainsi que la plaque de chimiokine. Puits des témoins positifs doivent également être inclus (c.-à-d.puits CXCL12 dans la plaque de chemokine, mais avec du tampon d’essai dans les puits correspondantes de la plaque composée).

5. Protocole paramètres sur le lecteur de microplaques de Fluorescence

Remarque : Le lecteur de microplaques de fluorescence utilisé dans le présent protocole est dénommé dans la Table des matières.

  1. Allumer l’appareil refroidisseur du lecteur de plaque fluorescence tout d’abord et puis allumez le lecteur de fluorescence lui-même. Laisser initier pendant quelques minutes et ouvrir le logiciel.
  2. Créer le protocole de l’essai en utilisant le menu de drag-and-drop qui comprend les étapes suivantes :
    1. Dans la zone « Paramètres », sélectionnez « Read_Mode » longueur d’onde d’excitation : 470-495 nM ; longueur d’onde d’émission : 515-575 nM.
      Remarque : Les longueurs d’onde sélectionnées sont appropriés pour une utilisation avec le Ca2 +-fluo2 colorant photosensible.
    2. Inclure la zone « Mix avec TF » (fluide caloporteur) pour le mélange automatique des composés dans le plat composé, qui sera mis à la position de la source 2 de l’appareil (Voir l’étape 6.4). Choisissez 15 µL de solution dans chaque puits afin d’être automatiquement aspiré et mélangé trois fois. Régler la hauteur des pointes de pipette à 20 µL au-dessous de la surface du liquide. Régler la vitesse d’aspiration et de distribution à 50 µL/s.
      Remarque : La hauteur des pointes de pipette désigne le volume qui reste sous les pointes de pipette. Par exemple, si les puits d’une plaque composée contient 50 µL, une hauteur de 30 µL correspond à 20 µL au-dessous de la surface du liquide. Le volume des prises pour mélanger composé en solution, la vitesse de mélange, la position de la pipette conseils pendant le mélange, et le nombre de cycles de mélange peut tous être ajusté à l’aide du logiciel.
    3. Dans la boîte « Transfert du fluide », définir que 20 µL de chaque puits de la plaque composée sera transféré dans la plaque de la mesure. Placer les pointes de pipette à 20 µL ci-dessous le liquide de surface soità hauteur 30 µL au cours de l’aspiration des composés et à hauteur 60 µL pendant la distribution de la plaque de la mesure. Régler la vitesse d’aspiration à 50 µL/s et la vitesse de distribution à 25 µL/s.
      Remarque : Le plat composé contient 50 µL de solution par puits (voir étape 4.1.3), une hauteur de 30 µL correspond donc à un µL de position 20 au-dessous de la surface du liquide. La plaque mesure contient 80 µL de tampon / puits (voir étape 6.3), une hauteur de 60 µL correspond donc à une position semblable des conseils.
    4. Cliquez sur le bouton « Lire avec TF ». Durant le premier intervalle, sélectionnez 60 lectures (mesures fluorescents) avec un temps de lecture intervalle de 1 définir s. qui 10 lectures sont enregistrées avant la distribution des composés dans la plaque mesure et 50 lit par la suite. Définir l’intervalle de seconde avec un temps de lecture intervalle de 30 s et 18 lectures.
      Remarque : Au cours de cette étape fluorescence se mesurera cinétiquement (à des intervalles de temps définis) pour ~ 10 min au total.
    5. Le bouton de « Conseils de lavage » à inclure dans le protocole trois fois. Au sein de chaque étape de lavage, sélectionnez le type de fluide : liquide (l’eau ultrapure) ou fluide B (éthanol à 70 %), le nombre de cycles de lavage (1), la pompe à vitesse (rapide), et le nombre de coups (5) au cours de chaque étape de lavage.
      Remarque : Au cours de la première et la dernière étape de lavage liquide A est utilisé, durant le second fluide étape de lavage que b est utilisé.
    6. Inclure la fonction « Pause multipipette ». Définir la pipette pour faire une pause pour 300 s.
      Remarque : En incluant cette étape dans le protocole, le chef de la pipette, qui est intégré dans le dispositif de lecteur de plaque de fluorescence, se met en pause pendant 5 min avant de continuer le protocole.
    7. Inclure la zone « Mix avec TF » pour permettre un mixage automatique de la solution de CXCL12 dans la plaque de chimiokines, qui sera positionnée à la position de la source 3 du dispositif (voir étape 6.4). Choisissez 15 µL de solution dans chaque puits afin d’être automatiquement aspiré et mélangé trois fois. Pendant l’aspiration et le mélange, placez la pipette conseils 20 µL au-dessous de la surface du liquide. La vitesse d’aspiration et de distribution est fixée à 50 µL/s.
      NOTE : Semblable en ce qui concerne l’étape 5.2.2, ces paramètres peuvent être ajustés.
    8. Dans la boîte de « Transfert du fluide » ultérieure, définissez ce 25 µL de chaque puits de la chimiokine plaque est transféré dans la plaque de la mesure. Position conseils 20 µL au-dessous du liquide soità hauteur de 55 µL au cours de l’aspiration de la plaque de chimiokine qui contient 75 µL/puits de surface (voir étape 4.1.3) et à hauteur 80 µL pendant la distribution de la plaque de la mesure. Régler la vitesse d’aspiration à 50 µL/s et la vitesse de distribution à 25 µL/s.
    9. Inclure le bouton « Lire avec TF ». Durant le premier intervalle, sélectionnez 145 lectures avec un temps de lecture intervalle de 1 définir s. qui 5 lectures sont enregistrées avant toute distribution de CXCL12 dans la plaque mesure et 140 lit par la suite. Définir l’intervalle de seconde avec un temps de lecture intervalle de 6 s et sélectionnez 20 lectures.
      NOTE : Globalement, tout au long de l’ensemble du protocole 243 lectures (mesures fluorescents) sont enregistrées : 78 à étape 5.2.4 et 165 au cours de l’étape 5.2.9.
    10. Semblable à l’étape 5.2.5, inclure le bouton « Conseils de lavage » trois fois dans le protocole.
      Remarque : Cette étape à la fin du protocole permet de que les conseils peut être ré-utilisé pour effectuer un autre test sans devoir modifier les conseils.
  3. Régler la température de l’appareil à 37 ° C en cliquant sur le bouton « Régler la température de l’étape » 37 ° C.

6. Exécutez le test de Fluorescence

  1. Après la mesure, plaque a incubé avec tampon pendant 45 min de chargement (voir étape 3.1.5), retirer le tampon en basculant sur la plaque et sécher sur un mouchoir en papier.
  2. Laver les cellules ensemencées en ajoutant 150 µL/puits de tampon et incuber pendant 2 min.
  3. Retirez le tampon à nouveau en basculant sur la plaque. Ajouter 80 µL/puits de tampon avec une pipette multicanaux.
  4. Mettre toutes les plaques dans l’appareil à leur position appropriée : le plat composé à la position de la source 2, la plaque de chemokine postées sur la source 3 et la plaque de mesure à la position de lecture. Mettre une boîte de pointes noires postées sur conseils la source 1. Fermer la porte de l’appareil et laisser incuber 5 min avant de continuer le protocole.
  5. Sélectionnez le bouton « Test de signal de protocole » pour déterminer les unités relative de la lumière de fond (RLUs) et la variance de la fluorescence sur la plaque. Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Sélectionnez « Signal d’essai ».
    Remarque : Au cours de cette étape, fond RLUs sont déterminés par la caméra de l’ICCD, qui est intégrée dans le compartiment de l’optique de l’appareil lecteur de fluorescence. Ces RLUs résultent de l’excitation du Ca2 +-colorant photosensible (fluo-2) par diodes électroluminescentes (LED) (sortie de LED longueur d’onde 470-495 nm). Valeurs de 8 000-10 000 RLUs conviennent bien pour cette application. RLUs peuvent, si nécessaire, être adaptés en modifiant l’intensité d’excitation (sélectionnez Exc. intensité) ou la porte de l’appareil photo (sélectionnez porte ouverte). La variance sur la plaque devrait être idéalement moins de 7,5 %.
  6. Sélectionnez « Update » si on obtient des valeurs de fond de 8 000-10 000 RLUs. Enregistrez le protocole principal en cliquant sur le bouton "sauvegarder".
    Remarque : Ce faisant, les paramètres de l’essai de signal protocole nous reporterons au protocole principal.
  7. Exécutez le test en appuyant sur le bouton « Exécuter ».

7. qualité et analyse de données

  1. Une fois l’analyse terminée, ouvrez la boîte de « Analyse » dans le logiciel.
    1. Allez à « configurer les corrections » et choisissez « réponse au fil de la ligne de base ». Définir la ligne de base 1 pour commencer à mesure 1 et se terminera à mesure 5 ; la fluorescence moyenne sera calculée dans chaque puits entre mesure 1 et 5.
      Remarque : Toutes les mesures supplémentaires d’un particulier sont bien divisés par cette ligne de base bien spécifique 1.
      1. Définir la ligne 2 de base pour commencer à mesure 78 jusqu'à 83 (CXCL12 est dispensée après mesure 83 ; encore une fois la fluorescence moyenne est calculée dans chaque bien entre les deux mesure 78 et 83 et ce facteur de correction est appliqué à toutes les mesures après mesure, 83).
    2. Activez la case à cocher « Afficher en pourcentage » et de « soustraire le fond ».
    3. Allez dans « Configurer réduction cinétique ». Pour évaluer l’effet inhibiteur des composés sur la réponse induite par CXCL12 Ca2 + , choisissez Max-Min à partir de mesure 84 (c'est-à-dire, la première mesure après quoi CXCL12 est distribué) à 243 (c'est-à-dire, la mesure finale).
      Remarque : En choisissant Max-Min, la différence entre la réponse minimale et maximale sur base entre mesure 84 et mesure 243 est signalée. Si le Max-Min est choisi à partir entre mesure 11 et mesure 78, la différence entre la réponse minimale et maximale sur la ligne de base par rapport à 1 est signalée. Cette valeur peut être utilisée pour analyser l’activité agonistique potentielle des composés, voir Discussion).
    4. Les données vont être visualisées dans le logiciel. Le cas échéant, exporter les données brutes pour une analyse complémentaire et visualisation dans d’autres logiciels d’analyse commune.

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Résultats

L’effet de stimulation CXCL12 sur la mobilisation de Ca2 + intracellulaire en U87. CD4.CXCR4+ et U87. Cellules CD4 a été évaluée avec le test de Ca2 + mobilisation. Au lieu de 20 µL de substance d’essai qui serait normalement ajouté au cours de la première étape de pipetage du protocole (Figure 1), le tampon a été ajouté à la fluo-2 AM chargé U87. Cellules CD4.CXCR4+ dans la plaque de la mesure. Au cours de la deuxi...

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Discussion

Le Ca2 +-test de mobilisation décrit ci-après a déjà démontré pour être un outil précieux pour identifier et caractériser les antagonistes des récepteurs CXCR417de ciblage. On prévoit, toutefois, que cette méthode peut être plus généralement appliquée à un groupe important d’autres RCPG qui déclenchent une libération de Ca2 + cytosolique lors de leur activation, comme illustré pour le récepteur de chimiokine connexes CCR5. Considérant que dans le cas de CCR5 exactement les mê...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier Eric Fonteyn et Geert Schoofs excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la KU Leuven (subvention no. PF/10/018), le Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, grant no. G.485.08) et la Fondation Dormeur Vaduz.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fluo-2 AMAbcamab142775fluorescent Ca2+ colorant sensible
Pluronic F-127SigmaP2443-250Gacide pluronique Gélatine
SigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 mgantagoniste spécifique CXCR4
Maraviroctype don du, antagoniste CCR5
Ligand de chimiokine CXCL12PeproTech300-28A
Ligand de chimiokine CCL5PeproTech300-06
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA1933-25G
Medium modifié de Dulbecco (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnésium, sans rouge de phénolGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolGibco (Life Technologies)25200-056
saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Tubes Falcon, 50 mLGreiner Bio-One227 261
Fiole de culture tissulaire (T75)Corning353024
Plaque noire, 96 puits, fond transparent, avec couvercled’essai 10530753Costar/Fisher Scientific(96 puits), pour l’ensemencement cellulaire Plaques
polypropylène (PP) ThermoScientific (VWR)732-2661plaques utilisées pour préparer les plaques composées et les chimiokines Plaques à fond rond
Système de criblage cellulaire à haut débit FLIPR TetraDispositifs moléculaires Lecteurplaques fluorescentes avec tête de pipette intégrée et caméra ICCD
Module FLIPR Tetra LED 470 - 495 nmDispositifs moléculaires0200-6128Diodes électroluminescentes pour l’excitation du colorant fluorescent sensible au Ca2+
Filtre d’émission FLIPR Tetra 515 - 575 nmDispositifs moléculaires0200-6203filtre d’émission compatible avec le colorant fluorescent
FLIPR Tetra 96 HeadMolecular Devices0310-4536Tête de pipette à 96 puits, intégrée dans le logiciel
ScreenWorksMolecular Devicesutilisé pour l’analyse et la visualisation des données sur l’analyseur
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrène, avec couvercle, stérileCorning3340Plaques d’essai pré-revêtues à 96 puits qui peuvent représenter une alternative pour le revêtement manuel de la plaque d’essai.
médicament antirétroviral AnorMed Solution Plaque en de de viabilité cellulaire FLIPR Tetra Vi-CELL Beckman Coulter

Références

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Essai GPCRMobilisation du calciumEssai bas sur la fluorescenceCriblage d antagonistes CXCR4D couverte de m dicaments ciblant les GPCREssai de fluorescence cin tiqueLib ration de calcium intracellulaireD tection de modulateurs allost riquesIdentification d agonistes et d antagonistesStimulation par CXCL12

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