Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour produire en série-silençage génique des cellules NK en utilisant un système de différenciation exempte d’engraissement pour étude mécanistique in vitro et in vivo.

Résumé

Natural killer (NK) cellules appartiennent au système immunitaire inné et sont une défense immunitaire de première ligne contre le cancer ; Cependant, ils sont supprimés dans le microenvironnement tumoral et le mécanisme sous-jacent est encore largement inconnu. L’absence d’une source fiable et constante des cellules NK limite les progrès de la recherche de l’immunité cellulaire NK. Nous rapportons ici un système in vitro qui peut fournir la qualité et la quantité de moelle osseuse murine NK cellules sous condition exempte d’engraissement. Plus important encore, nous démontrons que le silençage génique médiée par les siARN avec succès inhibe la maturation des cellules NK E4bp4-dépendante en utilisant ce système. Ainsi, cette cellule NK roman in vitro différenciant système est une solution de biomatériaux pour la recherche sur l’immunité.

Introduction

La progression du cancer est largement tributaire de la tumeur microenvironnement^1,2, y compris immunocytes hôte, par exemple, les cellules NK. Plusieurs études ont démontré que les cellules NK intratumorale sont négativement corrélées avec la tumeur progression^3,4. En outre, des études cliniques ont montré qu’adoptif thérapie de cellules NK est une stratégie possible pour cancer^5,6,7,8,9. Immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK a été récemment proposé comme une option thérapeutique pour les tumeurs solides, mais il existe des défis en raison de la sécrétion de cytokines immunosuppresseur et la diminution de l’activation des ligands dans le micro-environnement des tumeurs solides ^10,11. Facteur de croissance transformant β (TGF-β) a été proposé de jouer un rôle suppresseur dans la carcinogenèse, mais paradoxalement les cellules cancéreuses produisent également TGF-β1 pour prendre en charge la tumeur développement^{12,13,14 , 15}. signalisation TGF-β peut supprimer l’activité cytolytique des cellules NK via bas réglementant la réactivité de l’interféron et CD16 médiée par l’interféron-gamma (IFN-γ) production in vitro^{16,17, 18}.

Bien que la perturbation de la signalisation de TGF-β dans le microenvironnement tumoral peut être un moyen possible pour éliminer les cancers, bloquant complètement la signalisation TGF-β causera des maladies auto-immunes en raison de sa fonction anti-inflammatoire, comme en témoigne le développement de effets secondaires indésirables, y compris l’inflammation systémique, anomalies cardiovasculaires et l’auto-immunité dans des souris modèles¹⁹. Ainsi, comprendre le mécanisme de travail de l’immunosuppression TGF-β-mediated mènera à l’identification d’une cible thérapeutique accessible pour traiter le cancer.

Afin d’élucider les événements moléculaires nécessaires pour le développement des cellules NK, Williams et al. établi un système in vitro pour différencier murin de la moelle osseuse des cellules souches hématopoïétiques dans NK cellules²⁰. Ce système facilite grandement l’étude mécanistique de développement des cellules NK, y compris l’identification de nouveaux géniteurs de NK cellules²¹. Toutefois, les ancêtres de la moelle osseuse doivent être mis en culture dans le système avec l’appui de cellules stromales OP9 comme une alimentation couche^20,21, et cette population de cellules hétérogènes en grande partie limite l’application supplémentaire du gène perturbant outils (p. ex., siARN-mediated gene silencing) spécifiquement appliquées aux cellules NK différenciateur.

Nous décrivons ici un système sans conducteur qui a été développé par autres modifier le système in vitro de Williams et al.²⁰. Dans notre système, les cellules stromales chargeur de OP9 ne sont pas tenus, et plutôt OP9 moyenne conditionnelle est utilisée sans affecter la différenciation des cellules NK in vitroet ceci récemment nous amènent à découvrir que le TGF-β est capable de promouvoir la progression du cancer via supprimant le développement des cellules NK E4bp4-dépendant dans le microenvironnement de tumeur²². Ce nouveau système fournit avec succès une méthode sans fond pour élucider les mécanismes moléculaires du développement des cellules NK dans des conditions particulières (p. ex., haute TGF-β1, siARN-mediated gene silencing, etc..) in vitro.

Protocole

Le protocole pour l’obtention et la différenciation des dérivés de la moelle osseuse NK cells (BM-NK) est basé sur les méthodes publiées antérieurement^20,21,22. Toutes les procédures sur des souris ont été approuvés par l’Animal Ethics expérimental Comité (AEEC) à l’Université chinoise de Hong Kong.

1. préparation du milieu conditionnelle OP9

1. La culture de la lignée de cellules du stroma murine OP9 en alpha-MEM contenant 20 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine, à 37 ° C en atmosphère humidifiée d’air/CO₂ (95 % : 5 %).
   1. Compter les cellules avec un hémocytomètre, puis graine 2 x 10⁶ des cellules OP9 à chaque flacon de culture de² 75 cm avec 15 mL de milieu. Culture pendant 48 h.
   2. Lorsque la culture atteint 80 % confluence, laver la fiole 10 ml de PBS et ajouter 20 mL de plain milieu d’alpha-MEM (sans antibiotiques et FBS) par flacon.
2. Recueillir le milieu de condition OP9 du flacon de culture après 24 h, nettoyer les débris cellulaires avec filtre de polyéthersulfone (PES) 0,25 µm et conserver à 4 ° C (utilisation dans les 2 semaines).

2. isolement des cellules de la moelle osseuse de souris

1. Euthanasier une souris C57BL/6J de 12 semaines avec un surdosage de pentobarbital (100 mg/kg, une injection intrapéritonéale). Mort pour confirmer l’absence de respiration, puis récolter les os du fémur avec un couteau chirurgical au niveau des jonctions entre les os et supprimer les autres muscles avec la lame en grattant doucement.
2. Placer les os dans un tube à centrifuger 50 mL contenant réfrigéré stérile alpha-MEM et puis effectuez les opérations suivantes dans une armoire de sécurité biologique.
3. Jetez le milieu alpha-MEM et rincez les os avec l’éthanol à 70 % pendant 30 s.
4. Laver les os avec des PBS stérile glacée deux fois pour nettoyer l’éthanol restant.
5. Transférer les os dans un mortier contenant 5 mL de PBS glacée et fragmentation doucement les os avec un pilon (pulvériser pas eux).
6. Agiter doucement les os en agitant le pilon pour libérer les cellules de la moelle osseuse dans le PBS. Recueillir les cellules de la moelle osseuse contenant PBS dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL.
7. Répétez l’étape 2.6 pour quatre fois jusqu'à ce que les fragments d’os deviennent blanc Uni en couleur.
8. Centrifuger le tube à 465 x g pendant 5 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.
9. Resuspendre le culot avec 18 mL d’eau distillée stérile et laissez reposer pendant 30 s pour éliminer les globules rouges.
10. Ajouter 2 mL de glacé 10 X PBS pour arrêter la réaction, puis filtrer le mélange à travers un tamis de cellule de 70 µm pour éliminer les hématies lysées.
11. Centrifuger le tube à 465 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec 20 mL de PBS glacée.
12. Laver les cellules en répétant l’étape 2.11 une seconde fois.
13. Transférer le culot cellulaire dans un 100 mm boîte de Petri stérile 10 ml de milieu conditionnels OP9 de l’étape 1.2 additionné de 20 % FBS et un mélange de 0,5 ng/mL murins IL-7, 30 ng/mL souris SCF et flt3L murin de 100 U/mL.
14. Incuber le plat à 37 ° C, avec 5 % CO₂ pendant 2 h. transfert des cellules seules dans un nouveau conteneur de culture à une densité de 5 x 10⁵ cellules viables/mL (comptage des cellules par hémocytomètre avec exclusion de bleu trypan) avec la même formule moyenne comme à l’étape 2.13 et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
15. Jour 4, changer la condition de la culture au milieu de conditionnel OP9 additionné de 20 % FBS et 2 000 U/mL d’il-2 murine.
16. Actualiser le milieu de culture tous les 3 jours ; cellules NK matures peuvent être obtenus par jour 7 et qualifiés qu’à l’article 4.

3. siRNA-mediated Gene Silencing de différenciation des cellules NK

1. Mélangez le contrôle siARN ou non-sens (NC) avec un agent de transfection selon le manuel du produit.
2. Effectuez l’étape 3.1 à n’importe quel moment depuis le jour 0.
3. Ajouter les 50 nM de siARN ou mélange de NC aux cellules de l’étape 2.14.
4. Répétez l’étape 3.1 sur chaque rafraîchissement moyen (par exemple, jour 0, 4 et 7) jusqu'à ce que le point de terminaison expérimental.

4. analyse de la différenciation des cellules NK cytométrie

1. À un moment approprié, recueillir la suspension de la différenciation des cellules et laver avec du PBS glacée.
2. Fixer les cellules avec tampon de fixation cellule selon le manuel du produit.
3. Laver les cellules fixes avec PBS glacée et ensuite remettre en suspension de 1 x 10⁶ cellules dans 100 µL de Flow Cytometry coloration tampon contenant Cy3 conjugué anti-souris NKp46 et PE-conjugués des anticorps anti-souris CD244 dans un rapport de dilution de 1/100.
4. Coloration de l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.
5. Remettre en suspension les échantillons colorés avec 300 µL de PBS, puis acquérir des données de FACS et d’analyser avec Cytobank plate-forme²⁰ (http://cytobank.org/).

Résultats

Résultats représentatifs sont obtenus suivant le protocole décrit. Cellules en suspension totale de la moelle osseuse ont été cultivés en vertu du système de différenciation exempte d’engraissement pendant 11 jours ; jour 7 par rapport au nombre de cellules totales au jour 0 (Figure 1A) a observé une augmentation significative des taux de prolifération. Les cellules NK matures avec ratio nucléaire à cytoplasmique élevé et morphologie des gran...

Discussion

Dans le présent travail, nous avons décrit une nouvelle méthode de production de dérivés de la moelle osseuse murine NK de cellules in vitro. Le chargeur de la cellule dans le système original^21,22 est remplacé avec succès par la moyenne conditionnelle de cellules OP9, qui a largement augmenté la stabilité du système de différenciation. En outre, le système peut produire la quantité élevée et pureté du NK mature cellules pour in vitro comme ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire OP9	ATCC	ATCC® ; CRL-2749&trade ;
MEM &alpha ;, sans nucléosides	Gibco	22561021
Sérum de bovin fœtal	Gibco	10500064
PBS, pH 7,4	Gibco	10010049
Souris recombinante IL-7	PEPROTECH	217-17
Souris recombinante SCF	PEPROTECH	250-03
Souris recombinante Flt3-ligand	PEPROTECH	250-31L
Souris recombinante IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection	Invitrogen	1377815
Tampon de fixation IC  ;	eBioscience	00-8222-49
Tampon de coloration par cytométrie en flux  ;	eBioscience	00-4222-26
Anti-souris conjugué PE CD244	eBioscience	12-2441-83
Anti-souris conjugué Cy3 NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Contrôle non-sens (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA contre souris E4BP4 ARNm	Ribobio	N/A	5&prime ;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& premier;