Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

Résumé

Imagerie tissu rétinien peut fournir des informations de cellule unique qui ne peut pas être recueillies de méthodes biochimiques traditionnelles. Ce protocole décrit la préparation de rétiniens tranches de poisson zèbre pour l’imagerie confocale. Fluorescentes codé génétiquement des capteurs ou indicateur colorants permettent la visualisation de nombreux processus biologiques en types distincts de cellules rétiniennes.

Résumé

La rétine est un tissu complex qui initie et intègre les prémices de la vision. La dysfonction des cellules de la rétine est une caractéristique de nombreuses maladies aveuglantes et thérapies futures dépendent de compréhensions fondamentale sur la rétine comment différente cellules de fonctionnent normalement. Obtenir ces informations avec des méthodes biochimiques s’est avérée difficile parce que les contributions des types de cellules particulières sont diminuées dans le milieu des cellules rétiniennes. Imagerie rétinienne direct peut fournir une vue de nombreux processus biologiques niveau subcellulaire, grâce à un nombre croissant de biocapteurs fluorescents génétiquement encodés. Cependant, cette technique a été jusqu'à présent limitée à des têtards et des larves de poisson zèbre, les couches rétiniennes ultrapériphériques des rétines isolés ou imagerie de résolution plus faible des rétines animaux vivants. Nous présentons ici une méthode pour générer des vivants ex vivo rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie live par microscopie confocale. Cette préparation donne des tranches transversales avec toutes les couches rétiniennes et la plupart des types de cellules visibles permettant d’effectuer des expériences d’imagerie confocale utilisant une perfusion. Poisson zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ou biocapteurs dans les types de cellules rétiniennes spécifiques ou organites sont utilisés pour extraire les informations de la cellule unique d’une rétine intacte. En outre, tranches rétiniens peuvent être chargés avec indicateur fluorescent colorants, ajoutant à la polyvalence de la méthode. Ce protocole a été développé pour l’imagerie Ca^{2 +} au sein de poisson-zèbre cônes photorécepteurs, mais avec des marqueurs de bon, il pourrait être adapté pour mesurer Ca^{2 +} ou métabolites dans Müller cellules, cellules bipolaires et horizontales, cellules microgliales, cellules amacrines ou la rétine cellules ganglionnaires. L’épithélium pigmentaire rétinien est retiré des tranches si cette méthode ne consiste pas pour l’étude de ce type de cellule. Avec la pratique, il est possible de générer des tranches de série d’un animal pour des expériences multiples. Cette technique adaptable fournit un outil puissant pour répondre à nombreuses questions sur la biologie des cellules rétiniennes, Ca^{2 +}et l’homéostasie énergétique.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) a devenu employé couramment dans la recherche scientifique médicale et base¹, en raison de sa petite taille, de développement rapide et de systèmes d’organes vertébrés. La transparence naturelle des larves de poisson zèbre combinée à des méthodes établies pour la transgénèse ont permis une visualisation détaillée des processus cellulaires dans un animal vivant. Un certain nombre de biocapteurs fluorescents génétiquement codées ont été la cible de cellules spécifiques zebrafish pour détecter Ca^{2 + 2}, peroxyde d’hydrogène³, apoptotic activation

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’Université de Washington animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.

1. préparer les animaux et les matériels

Remarque : L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est une feuille sombre du tissu entourant l’extérieur de la rétine dont la pigmentation peut obscurcir caractéristiques rétiniennes et endommager les tissus lorsque ex vivod’imagerie confocale. Dans l’obscurité, la RPE de poisson-zèbre est rentrée de la rétine ; obscurité adapter poisson pour faciliter le retrait futur du RPP de la rétine avant de trancher et de l’imagerie.

1. Tra....

Résultats

Un positionnement stable et l’orientation transversale de tranches sont essentiels à l’imagerie réussie avec injection ou perfusion d’agents pharmacologiques. Examiner soigneusement et repositionner les tranches avant l’imagerie confocale selon les besoins pour s’assurer que toutes les couches rétiniennes sont visibles (Figure 2 a, tranche ii). Si une tranche est tournée légèrement vers l’avant (Figure 2 a, tranche iii), faisceau.......

Discussion

Ex vivo imagerie rétinienne tranches de poisson zèbre fraîche s’est avéré pour être un outil polyvalent pour l’étude des photorécepteurs biologie^20,21,22et est unique parce qu’il permet l’analyse des cellules individuelles dans un âge mûr, entièrement rétine différenciée. Avec la pratique, il est possible de réaliser des expériences multiples avec des tissus provenant d’un seul poisson, même en utilisant des tranches de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
poisson-zèbre	Université de Washington South Lake Union Aquatics Facility		stocks maintenus en interne sous forme de lignées transgéniques stables
vaseline	Fisher Scientific	19-090-843	pour seringue
vaseline Seringue à embout coulissant de 3 ml	Fisher Scientific	14-823-436	pour seringue à vaseline
20g Aiguille à embout coulissant de 3,8 cm	Fisher Scientific	14-826-5B	pour seringue de vaseline
unie 7 cm X 2,5 cm lame de microscope	Fisher Scientific	12-550-A3	pour dissection d’œilleton, chambre de tranchage
Vernis à ongles transparent Seche Vite	Amazon	B00150LT40	pour chambre de tranchage
18 mm X 18 mm #1 lamelles en verre	Fisher Scientific	12-542A	pour échelles d’imagerie
cire dentaire non aromatisée	Amazon	B01K8WNL5A	pour échelles d’imagerie lames
de rasoir à double tranchant	Stoelting	51427	pour trancher les tissus
Trancheuse de tissus avec micromètre numérique	Stoelting	51415	pour trancher les tissus
papier filtre - cellulose mixte maillée blanche, 13 mm de diamètre, 0,45 & micro ; Papier	HAWG01300 EMD Millipore		le montage des rétines
Boîte de Pétri 10 cm Boîte de Pétri	Fisher Scientific	FB0875712	pour l’euthanasie, la dissection, l’imagerie des poissons Ensemble d’échelle
15 cm Applicateur en bois à bout uni	Fisher Scientific	23-400-112	pour fil Outil à boucle oculaire
30g (0,25 mm de diamètre) Fil de tungstène	Fisher Scientific	AA10408G6	pour outil à boucle oculaire en fil
D-glucose Sigma	Aldrich	G8270	composant de la solution mère de
supplément L-lactate de sodium	Sigma Aldrich L7022		composant de la solution mère de
supplément pyruvate de sodium	Sigma Aldrich	P2256	composant de la solution mère de supplément
L-glutamine	Sigma Aldrich	G3126	composant de la solution mère de supplément
; L-glutathion réduit	Sigma Aldrich	G4251	Composant de la solution mère de supplément
Acide L-ascorbique	Sigma Aldrich	A5960	Composant de la solution mère de
supplément NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Composant de la solution de Ringer
KCl	Sigma Aldrich	P9333	Composant de la solution
de RingerCaCl2 · ; 2H2O	Sigma Aldrich	C3881	composant de la solution de Ringer
NaH2PO4	Sigma Aldrich	Composant S8282	de la solution de Ringer
MgCl2 · ; 6H2O	Sigma Aldrich	M0250	composant de la solution de Ringer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Composant de la solution
de Ringer Base Tris	Fisher Scientific	BP152	Composant de Na+-free Solution de Ringer
6 N HCl	Fisher Scientific	02-003-063	Composant de Na+-free Solution de Ringer
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	composant de Na+-free Ringer’s solution
50 mL tube à centrifuger conique	Denville Scientific	C1062-P	récipient pour solution Ringer
Ciseaux Vannas - 8 cm, lames coudées de 5 mm	World Precision Instruments	501790	micro-ciseaux pour la dissection de l’œilleton
Pince à épiler suisse - #5, 11 cm, droite, pointes de 0,06 x 0,07 mm	World Precision Instruments	504510	pince fine pour la dissection de l’œilleton et la manipulation des tranches
de rasoir à un seul tranchant	Fisher Scientific	12-640	pour la dissection et le rognage de l’œilleton papier filtre
EMD Pince à filtre Millipore	Fisher Scientific	XX6200006P	pince plate pour la manipulation du papier filtre humide
C12 558/568 BODIPY	Fisher Scientific	D3835	colore les noyaux des cellules vivantes ; Incuber 5 & Micro ; g/mL pendant 15 min à température ambiante :
iodure de propidium (PI)	Fisher Scientific	P3566	colore les noyaux de cellules mortes ; incuber 5 & micro ; g/mL pendant 20 min à température ambiante
Hoechst 33342	Fisher Scientific	62249	colore les noyaux de cellules vivantes ; incuber 5 & micro ; g/mL pendant 20 min à température ambiante
Tétraméthylrhodamine, ester méthylique (TMRM)	Le Fisher Scientific	T668	colore les mitochondries fonctionnelles chargées négativement ; incuber 1 nM pendant 30 min à température ambiante
perfusion tissulaire	Cell MicroControls	BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]	chambre d’imagerie pour injection ou perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)	Fisher Scientific	N13195	glucose administré par voie orale au poisson-zèbre 30 min avant l’euthanasie
Microscope confocal à balayage laser Olympus	Olympus	FV1000	pour visualiser la fluorescence des coupes à une résolution unicellulaire
Cyanure de carbonyle 3-chlorophénylhydrazone (CCCP)	Sigma Aldrich	C2759	réactif expérimental qui ablate la respiration mitochondriale ; traiter les tranches à une concentration finale de 1 & micro ; Positionneur
d’aspirateur miniature	Cell MicroControls	FL-1
collecteur de perfusion, collecteur de perfusion, collecteur de barboteur de gaz, soupape de débit, porte-seringue 60cc	Warner Instruments	divers	pour la perfusion

de à filtre pour lames Chambre de analogue fluorescent du Microscope confocal M pour