Dans ce protocole, baculovirus est produit par transfection transitoire de baculovirus plasmide dans les cellules Sf9 et amplifié dans une culture en suspension sans sérum. Le surnageant est purifié par chromatographie d’affinité de l’héparine et davantage concentré par ultracentrifugation. Ce protocole est utile pour la production et la purification des baculovirus pour l’application de la thérapie génique.
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Article de méthode
Production et Purification de Baculovirus pour l’Application de la thérapie génique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Baculovirus a traditionnellement été utilisé pour la production de protéines recombinantes et vaccin. Cependant, plus récemment, les baculovirus émerge comme un vecteur prometteur pour l’application de la thérapie génique. Ici, les baculovirus est produit par transfection transitoire du plasmide baculovirus ADN (bacmid) dans une culture adhérente des cellules Sf9. Baculovirus est étendu par la suite dans les cellules Sf9 dans une culture sans sérum suspension jusqu'à ce que le volume désiré est obtenu. Elle est ensuite purifiée à partir du surnageant à l’aide de la chromatographie d’affinité de l’héparine de culture. Virus surnageant n’est chargé sur la colonne de l’héparine, qui lie les particules de baculovirus dans le surnageant en raison de l’affinité de l’héparine pour baculovirus enveloppent glycoprotéine. La colonne est lavée avec un tampon pour éliminer les contaminants et les baculovirus est éluée de la colonne avec un tampon de haut-sel. L’éluat est dilué à une concentration saline isotonique et particules de baculovirus sont plus concentrés à l’aide d’ultracentrifugation. En utilisant cette méthode, les baculovirus peut être jusqu'à 500 fois concentré avec une reprise de 25 % de particules infectieuses. Bien que le protocole décrit ici illustre la production et la purification de la baculovirus de cultures jusqu'à 1 L, la méthode peut être mise à l’échelle en place dans une culture en suspension système fermé pour produire un vecteur de cliniques de qualité pour l’application de la thérapie génique.
Introduction
Baculovirus est principalement utilisé pour la production de protéines recombinantes et vaccins chez les lépidoptères Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellules d’insectes à l’aide de la recombinaison de virus de la polyédrose nucléaire pourcentage Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. plus récemment, il s’impose comme un vecteur prometteur pour la thérapie de gène demande5. Il est connu pour avoir un tropisme hôte et tissu large, infecte les cellules quiescentes et de prolifération, est non pathogène et ne s’intègre pas dans l’hôte du chromosome4,5,6. En outre, baculovirus peuvent être produites en suspension sans sérum qui est évolutif et permet de système fermé de traitement pour la production future clinique1.
La pureté des baculovirus particules est importante pour la réalisation de transduction efficace tout en minimisant la cytotoxicité7,8,9. Baculovirus peuvent être concentrés par ultracentrifugation ou filtration à flux tangentiel (FFT) avec un impact limité sur son infectiosité. Toutefois, ces procédures concentrent non seulement des particules virales, mais aussi les débris cellulaires et les protéines de Sf9 culture, qui peut être toxique en vitro (observation personnelle) et peuvent induire une inflammation ou une réponse immunitaire lorsqu’il est utilisé en vivo. Pour éviter cela, surtout quand utilisant très concentré des stocks de virus, baculovirus infectieuse doit être purifié et séparés des particules de contaminant.
Plusieurs méthodes ont été signalés pour la purification et la concentration de baculovirus vecteurs10,11,12. Parmi les approches disponibles, chromatographie d’affinité de l’héparine permet un niveau élevé seule étape de purification avec la faible concentration de contaminant protéines12. La méthode repose sur l’identification de l’héparane sulfate comme le récepteur de baculovirus13,14. Après le chargement de surnageant de cellules Sf9 sur la colonne et la liaison de baculovirus, la colonne peut être lavée avec un tampon physiologique (isotonique) pour enlever les particules polluantes non liés ou faiblement liés. La liaison à l’héparine étant réversible, les baculovirus particules peuvent être éluées avec un tampon salin haut, qui est dilué immédiatement à la concentration de sel (isotonique) physiologique pour empêcher l’inactivation par choc osmotique,12. En outre, la production de baculovirus, mais aussi capture sur et élution de la colonne de chromatographie, peut être effectuée à l’aide d’un processus de système fermé qui est compatible avec les pratiques actuelles de fabrication (cGMP).
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la fabrication, purification et concentration de baculovirus infectieuses par centrifugation et chromatographie d’affinité. Brièvement, nous produisons des baculovirus par transfection de cellules Sf9 avec un ADN plasmidique de baculovirus dans culture adhérente et d’élargir davantage le baculovirus infectieux en suspension sans sérum. Nous purifions baculovirus utilisant la chromatographie d’affinité de l’héparine et utiliser ultracentrifugation comme l’étape finale se pour concentrer fortement le vecteur pour l’application de la thérapie génique.
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Protocole
Voir la Figure 1 pour une illustration Résumé du protocole.
1. purification d’ADN plasmidique Baculovirus
- Cultiver la culture bactérienne contenant baculoviral plasmide ADN (bacmid)14 dans 200 mL de bouillon LB avec des antibiotiques ; kanamycine (50 µg/mL), tétracycline (10 µg/mL) et gentamicine (7 µg/mL), de 16 h à 37 ° C sur un réglage de l’agitateur orbital à 300 tr/min.
- Purifier l’ADN de bacmid de la culture bactérienne à l’aide de lyse alcaline standard protocole15et dissoudre le bacmid dans un tampon TE.
2. production de Baculovirus
- Cellules Sf9 de culture dans un incubateur agitateur orbital à 135 tr/min et 28 ° C dans un polycarbonate erlenmeyer contenant le milieu de culture sans sérum insectes1,2,3.
Remarque : Si les cellules Sf9 sont décongelés du stock congelé, laissez au moins deux semaines pour les cellules à récupérer et à entrer dans la phase exponentielle de croissance. - Compter les cellules Sf9 récoltées en phase exponentielle de croissance avec un hémocytomètre après coloration au bleu Trypan. 1 x 106 cellules Sf9 viables par puits dans une plaque de culture de tissus traités 6 puits dans 2 mL de milieu de graines. Permettre à la cellule d’attacher pendant 1 h à 28 ° C dans un incubateur.
- Remplacer le milieu de culture avec 1 mL de milieu de culture sans sérum sans additifs de Grace insecte.
- Transfecter le bacmid ADN dans les cellules Sf9 utilisant le réactif de transfection cellulaire insectes.
- Mix 8 µL de réactif de transfection cellulaire insectes avec 100 µL de milieu d’insecte de Grace.
- Diluer 2 µg de bacmid ADN dans 100 µL de milieu insecte sans additifs et mélanger doucement au vortex.
- Combiner l’ADN dilué avec le réactif de transfection cellulaire insectes dilué et mélanger doucement. Incuber pendant 15 à 30 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de l’ADN-lipides goutte à goutte sur les cellules. Incuber à 28 ° C dans un incubateur pendant environ 5 h.
- Retirez le mélange de la transfection des cellules et laver les cellules avec 2 mL de PBS.
- Ajouter 2 mL de milieu de culture insecte et continuer à la culture à 28 ° C dans un incubateur sans changer les médias.
Remarque : Si le bacmid contient une protéine fluorescente, son expression peut être détectée dans après transfection de cellules 48 h. Baculovirus est produite par des cellules transfectées Sf9 et sécrétée dans le milieu de culture qui par la suite infecte les cellules celllulaire. La population de la cellule entière devient infectée par baculovirus en 5 jours et montre des signes d’infection virale, également appelé effet cytopathique. Il s’agit de diamètre cellulaire accrue, vacuoles ou granules dans le cytoplasme, les arrêt de la croissance cellulaire et les cellules mortes ou lysés sont présents dans les cultures cellulaires. Toutefois, si l’efficacité de transfection ou d’infection n’est pas optimale, la culture ne peut-être pas présenter un effet cytopathique évident. L’effet cytopathique peut être visualisée avec un microscope inversé de phase au grossissement X 200-400. Cellule de baculovirus infectés peut être détectée par coloration avec d’anticorps anti-gp6411. - Récolter baculovirus surnageant 5 jours après la transfection et l’étiquette que le stock de virus1 P.
- Stocker le baculovirus surnageant, qui est sensible à la lumière, dans l’obscurité avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS. Stocker à 4 ° C pour le court terme (jusqu'à 90 jours) ou à-80 ° C pour le long terme.
- Graines de 6 × 106 Sf9 cellules dans la plaque d’imprégnées de culture de tissu de 10 cm dans 10 mL de milieu de culture insecte. Ajouter 1 mL du surnageant initiale baculovirus (P1) aux cellules.
- Récolter les baculovirus surnageante (P2) au 5ème jour après l’infection.
- Graine de 50 mL de cellules Sf9 (3 x 106 cellules/mL) en suspension dans un milieu de culture insecte dans un polycarbonate de 250 mL fiole Erlenmeyer et placer le ballon dans un incubateur agitateur orbital. Ajouter 2 mL de stock2 P aux cellules et agiter à 135 tr/min tout en maintenant une température constante de 28 ° C.
Remarque : Trois ou quatre jours après l’infection, toute la population de cellules Sf9 montrera un effet cytopathique, qui est une indication de la production de haut-titre baculovirus. - Séquentiellement amplifier les surnageants de baculovirus jusqu'à ce que le volume désiré est obtenu (P3, P4,...) en augmentant de 10 à 50 fois volume de culture cellulaire dans chaque infection ultérieure.
Remarque : P3 est le 3rd round d’infection dans lequel 500 mL à 1 L de Sf9 culture cellulaire peut être infectée par 10 à 20 mL de P2 baculovirus surnageant ; P4 est le 4ème tour de l’infection dans les 5 à 10 L de Sf9 culture cellulaire peut être infectée par 100 à 200 mL du surnageant de baculovirus3 P et ainsi de suite. En règle générale, les cellules Sf9 sont injectées à 3 × 106 cellules/mL dans les milieux de culture sans sérum insecte. - Centrifuger le baculovirus surnageant à 1 000 x g pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires et de traiter le baculovirus surnageant avec une nucléase 50 unités/mL (250 unités/µL de stock) pendant 2 h à 37 ° C à digérer l’ADN et l’ARN génomique. Filtrer les surnageants par une unité de filtration de 0,45 μm.
3. préparation du système de chromatographie en phase
- Préparation du système de chromatographie en rinçant séquentiellement les lignes d’échantillon et tampon chaque avec l’eau stérile, 1 N d’hydroxyde de sodium, eau et laver le buffer (tampon de phosphate de sodium 20 mM contenant chlorure de sodium 150 mM, pH 7,0) à un débit de flux linéaire de 50 mL/min.
- Préparer une colonne de µm d’héparine 50 (10 × 10 cm, 7,9 mL de volume (CV) de la colonne) en exécutant séquentiellement colonne nettoyage tampon (5 CV stérile 20 mM sodium phosphate tampon contenant 2 M chlorure de sodium, pH 7,0) et tampon de lavage 5 CV à un débit linéaire de 7 mL/min.
4. la purification des Baculovirus vecteur
- Mettre en place le système de chromatographie comme suit :
- Utilisez l’exemple chargement porte d’entrée pour charger le baculovirus surnageant.
- Utiliser l’orifice d’admission de tampon A1 pour charger le tampon de lavage. Préparer une bouteille munie d’au moins 500 mL de tampon de lavage et placer la ligne de tampon de lavage dans la bouteille.
- Utiliser l’orifice d’admission de tampon A2 pour le chargement de la mémoire tampon d’élution (phosphate de sodium 20 mM avec 1,5 M de chlorure de sodium, pH 8,0). Préparer un flacon contenant au moins 500 mL de tampon d’élution et placer la ligne du tampon d’élution dans la bouteille.
- Insérer plusieurs tubes coniques 50 mL dans le collecteur de fraction pour recueillir le surnageant de baculovirus pass-through colonne, le tampon de lavage et le baculovirus éluée.
- Equilibrer la colonne de l’héparine avec cinq volumes de colonne de 7,9 mL (CVs) de tampon de lavage (40 mL) à un débit linéaire de 7,0 mL/min.
- Charge de 250 mL de baculovirus surnageant sur la colonne de l’héparine à l’aide de la pompe de prélèvement (orifice échantillon) du système de chromatographie à un débit linéaire de 2,0 mL/min.
- Courir 10 CV (80 mL) de tampon de lavage à travers la colonne de l’héparine à un débit linéaire de 2,0 mL/min jusqu'à ce que la courbe d’absorption ultraviolette (UV) (280 nm) est revenue au niveau de référence et devient stable.
- Éluer les particules de baculovirus de la colonne de l’héparine de 7,9 mL avec 5 CV (40 mL) de tampon d’élution à un débit linéaire de 4,0 mL/min. montre un pic pointu d’élution de protéine sur le chromatogramme lorsque les particules de baculovirus se dissocient de la colonne de l’héparine.
- Après élution, diluer immédiatement le surnageant de baculovirus éluées 10 fois à l’aide d’un tampon phosphate de sodium 20 mM dans l’eau pour empêcher l’inactivation de baculovirus particules de choc osmotique lors de la centrifugation ultérieure.
- Magasin de 100 µL de chacune des fractions, y compris la colonne intermédiaire recueillies pendant le chargement de l’éluat du surnageant de baculovirus et le tampon de lavage. Infecter ces fractions de baculovirus à HT1080 pour évaluer le processus de purification (voir chapitre 6).
- Nettoyer la colonne par colonne nettoyage tampon et tampon de lavage. Enfin, rincer la colonne avec 5 CV stérile 20 % d’éthanol dans l’eau à un débit linéaire de 7,0 mL/min et conserver à 4 ° C.
- Nettoyer le système de chromatographie en phase avec l’eau, hydroxyde de sodium 1 N, encore une fois avec de l’eau et 20 % d’éthanol dans l’eau à un débit linéaire de 50,0 mL/min et de stocker le système à 20 % d’éthanol.
5. la concentration de Baculovirus
- Avant de stériliser tubes à centrifuger à l’aide d’un autoclave. Ajouter un volume égal de baculovirus surnageante à chaque tubes ultracentrifugeuse sous une hotte de culture de tissus. Mesurer le poids du tube par un équilibre et ajuster le poids du contenu des tubes ultracentrifugeuse avec du PBS stérile.
- Placez chacun des tubes ultracentrifugeuse pour s’opposer au seau du rotor SW 32 Ti.
- Exécutez l’ultra-centrifugeuse à 80 000 × g pendant 90 min à 4 ° C.
- Ouvrir les tubes ultracentrifugeuse sous une hotte de culture de tissus et aseptiquement aspirer le liquide sans enlever la pastille de baculovirus.
- Resuspendre le culot de chaque tube en pipettant également vigoureusement de haut en bas avec 200 µL de PBS contenant 0,5 % (w/vol) BSA.
- Transférer le baculovirus concentré à cryovials (50 à 100 µL par flacon) et stocker à-80 ° C.
6. titrage des Baculovirus
- Le jour avant l’infection, compter les cellules HT1080 utilisant un hémocytomètre après coloration des cellules avec Trypan blue. Graines de 1 x 105 HT1080 cellules / puits dans la plaque de 6 puits dans 2 mL de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF). Semences, plusieurs puits supplémentaires pour pouvoir déterminer le nombre exact des cellules présentes au moment de l’infection. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
Remarque : HT1080 cellules sont utilisées pour le titrage qu’ils expriment un niveau plus élevé de l’héparane sulfate par rapport aux autres lignes cellule16. Puisque les cellules HT1080 sont adhérentes, le titrage est plus simple et beaucoup moins de temps par rapport à l’aide de la titration Sf9-basée traditionnelle. - Le jour de l’infection, déterminer le nombre de cellules par puits en comptant les cellules par puits. Infectent les cellules en ajoutant le baculovirus original dilué qui avait été annulé avant la purification de la colonne et avec des échantillons de la colonne intermédiaire, lavage et élution fractions. Pour chaque échantillon, déterminer la dilution et le volume empiriquement basé sur des particules infectieuses baculovirus et infecter chaque puits en triple exemplaire.
- Deux jours après l’infection, analyser les cellules pour l’expression du gène d’intérêt. Les cellules peuvent être analysées à l’aide d’un cytomètre en flux si elles expriment une protéine fluorescente (p. ex. GFP)17.
- Calculer les titres (unité infectieuse par mL) basées sur le nombre de cellules présentes au moment de l’infection, le facteur de dilution et les pourcentages de la protéine fluorescente dans les cellules à l’aide de la formule : (nombre de cellules au cours de pourcentage × infection de la protéine fluorescente facteur de dilution de × de cellules positives) / volume de baculovirus en mL.
Remarque : Par exemple, si le nombre total de cellules / puits au moment de l’infection est de 1,2 × 105, le pourcentage de protéine fluorescente est de 5 %, le facteur de dilution est 100, et le volume des baculovirus diluée ajoutée est 10 µL, le titre est 6 × 107 unités infectieuses (UI) par millilitre.
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Résultats
Le protocole présenté est dans un schéma (Figure 1). Les étapes incluent la transfection transitoire des cellules Sf9 avec bacmid l’ADN pour produire des baculovirus dans culture adhérente dans une assiette, l’amplification ultérieure en culture en suspension sans sérum, traitement nucléase et clarification par centrifugation et filtration, et la purification en utilisant la chromatographie d’affinité de l’héparine suivi de concentration avec l’ultracentrifug...
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Discussion
Le protocole présenté ici décrit la production de baculovirus Sf9 cellules en suspension et de la purification des baculovirus utilisant une chromatographie d’affinité de l’héparine. Les paramètres utilisés dans le présent protocole maximiser le rendement et réduire au minimum l’inactivation de baculovirus infectieuses. Le protocole fourni ici montre qu'une reprise nettement améliorée de baculovirus particules par rapport aux recouvrements obtenus par d’autres9.
En rais...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail est soutenu en partie par le Fonds de démarrage de Cincinnati Children Research Foundation (CPFR) M.N. et innovantes Core Grant (GIC) pris en charge par le Centre National pour l’avancement des Sciences translationnelle de la National Institutes of Health, sous Prix numéro UL1 TR001425. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Système de chromatographie |
| POROS Heparine 50 µ ; m Colonne | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Colonne d’héparine |
| Ultracentrifugeuse | Beckman-Coulter | Article non catalogue | Concentre le virus sur un |
| tube d’ultracentrifugation Polyallomère | Beckman-Coulter | 326823 | Concentre le virus sur l’incubateur |
| à agitateur orbital MaxQ 8000 à grande vitesse ; | ThermoFisher Scientific | Article non catalogue | Shaker pour culture en suspension |
| Erlenmeyer 250 mL ThermoFisher | Scientific | 238071 | Flacon pour culture en suspension |
| 1 L Erlenmeyer | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flacon pour culture en suspension |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Article hors catalogue | Surveillance et comptage des cellules ; |
| Centrifugeuse de table | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Pour la clarification du surnageant de Baculovirus |
| 50 ml Tube conique | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | Pour le prélèvement du surnageant de Baculovirus |
| Plaque à 6 puits | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Plaque traitée pour culture tissulaire |
| Plaque de 10 cm | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Plaque traitée pour culture tissulaire |
| Stericup-HV, 0,45 et micro ; m, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Unité de filtration |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycine | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Système d’expression de baculovirus |
| DH10B-T1R ; Cellule compétente | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Cellule compétente pour tampon bacmid |
| TE | Interne | Article hors catalogue | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0. |
| Kit plasmide Maxiprep | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | Pour la purification du bacmid |
| Cellules Sf9 ThermoFisher | Scientific | 11496-015 | Cellules d’insectes |
| Grace' s Milieu de culture cellulaire d’insectes | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Milieu de transfection |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Lavage des cellules, dilution des échantillons |
| HyClone SFX-Milieu cellulaire d’insecte | GE Healthcare | SH30278.02 | Milieu de croissance de cellules d’insectes sans sérum |
| Benzonase Nucléase | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme pour dégrader l’ADN et l’ARN |
| Plasmide du baculovirus (bacmid) ADN | Interne | Article hors catalogue | Bacmid pour la production de baculovirus |
| Cellfectin II ; | ThermoFisher Scientific | 10362 | Réactif de transfection pour cellules d’insectes |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilise le baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | Pour le stockage de la lignée cellulaire du baculovirus |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Lignée cellulaire de fibroblaste |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Croissance Milieu pour lignées cellulaires |
| Tampon de lavage | Tampon | non catalogue | 20 mmol/l contenant 150 mmol/l de chlorure de sodium |
| Tampon d’élution | Interne Article hors catalogue | Tampon phosphate de 20 mmol/l contenant 1,5 mol/l de chlorure de sodium | |
| Tampon de nettoyage de colonne | Interne | Article hors catalogue | 20 mmol/l tampon phosphate contenant 2,0 mol/l de chlorure |
| de sodiumEau stérile | Interne | Article hors catalogue | Pour le nettoyage d’Akta Avant |
| Hydroxyde de sodium | Sigma-Aldrich | 1.09137 | Pour le nettoyage d’Akta Avant |
| Éthanol | Sigma-Aldrich | E7073 | Pour le nettoyage d’Akta Avant |
Références
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Réimpressions et autorisations
