Un Test objectif et reproductible d’apprentissage olfactif et de la Discrimination chez les souris

Résumé

Ici, nous formons la souris sur une tâche d’apprentissage associatif pour tester la discrimination à l’odeur. Ce protocole permet également d’études sur l’apprentissage induit par des changements structurels dans le cerveau.

Résumé

Olfaction est la modalité sensorielle prédominante chez la souris et l’influence de nombreux comportements importants, y compris la recherche de nourriture, détection de prédateurs, l’accouplement et parentalité. Important, les souris peuvent être formés à associer les nouvelles odeurs des réponses comportementales spécifiques pour donner un aperçu de la fonction de circuit olfactif. Ce protocole décrit en détail la procédure pour les souris de la formation sur une tâche d’apprentissage opérante Go/non-Go. Dans cette approche, les souris sont formés sur des centaines d’essais automatisés par jour pendant 2 à 4 semaines et peuvent ensuite être testés sur les nouveaux Go/non-Go odeur paires pour évaluer la discrimination olfactive, ou être utilisé pour les études sur la façon dont apprentissage odeur modifie la structure ou la fonction de l’olfactif circuit. En outre, le bulbe olfactif de la souris (OB) comporte l’intégration en cours des neurones adultes. Fait intéressant, apprentissage olfactif augmente la survie et des connexions synaptiques de ces neurones adultes. Par conséquent, ce protocole est cumulable avec d’autres techniques biochimiques, électrophysiologiques et d’imagerie, d’étudier les facteurs d’apprentissage et de l’activité dépendante qui médient la survie neuronale et la plasticité.

Introduction

La souris OB, où les informations d’odeur entre tout d’abord dans le système nerveux central (CNS), fournit un excellent modèle pour étudier les changements structurels dépendant de l’expérience. Circuity OB intègre continuellement neurones adulte d’une manière dépendante de l’activité. Précurseurs de l’adulte-né neurone divisent hors de progéniteurs qui bordent la zone sous-ventriculaire adjacente à la ventricules latéraux¹. Lors de la migration dans l’OB, ces précurseurs neurones survivent, différencient et intègrent en tant que cellules étoilées inhibitrices ou subissent l’apoptosis². Sélection pour le sort de la cellule est influencée par l’activité olfactive, incluant l’apprentissage olfactif^3,4,5,6. Après intégration, changements synaptiques induite par l’apprentissage se produisent dans les cellules étoilées pendant une période critique deux semaines^7,8. Ainsi, les dosages pour apprentissage olfactif sont utiles pour étudier comment expérience dépendant plasticité influences réorganisation structurelle et fonctionnelle d’un circuit de cerveau mature.

Ce protocole offre une approche formation olfactive à l’aide d’un paradigme de conditionnement opérant. Dans cette tâche, souris d’eau privés sont formés pour associer une odeur (l’odeur de « Go ») avec une récompense de l’eau et une autre odeur (l’odeur « Interdite ») à une punition de délai d’attente du procès. Progrès de souris grâce à une série graduée de phases de formation au cours des 2 à 4 semaines. Lorsque la formation est terminée, souris répondent à l’odeur de Go ou no-Go avec les comportements discrets, ce qui correspondants (recherche d’une récompense de l’eau sur les essais de Go et ne cherche ne pas la récompense de l’eau sur les essais interdites) (Figure 1A). Après que dressage est terminé, souris peuvent être encore contestées avec paires d’odeur chimiquement semblable pour tester la discrimination ou devenir passés à études apprentissage Comment olfactif d’instruction modifie la structure ou la fonction de l’ob. Tâches de discrimination odeur ont été décrits précédemment, plus compter sur des mesures subjectives telles que nombre de renifle entre deux substances odorantes^9,10. En outre, la nécessité pour la notation humaine de ces tâches est aussi beaucoup de temps. La tâche d’apprentissage olfactif Go/non-Go décrite dans le présent protocole propose une mesure objective et directe de discrimination à l’odeur et l’apprentissage olfactif.

Protocole

Toutes les souris ont été utilisés en vertu d’un protocole approuvé par le Comité de l’emploi et de Baylor College of Medicine Institutional Animal Care conformément aux normes de NIH. Souris utilisées dans le présent protocole ont été toutes les souris adultes (> 6 semaines d’âge) sur C57BL6/j de fond et inclus des souris mâles et femelles. Après les tâches de formation/mise en scène, souris sont retournés à leur cage maison.

1. construction et règles générales d’utilisation opérant apprentissage Box (Figure 1B, C)

1. Assembler une chambre de souris avec le plancher de la chambre. Garder la zone de formation dans un faible trafic, zone faiblement éclairée pour éviter les distractions.
2. Percer chaque port de l’eau avec un petit trou sur le dessus pour permettre une aiguille de calibre 18 à puiser l’eau à l’intérieur du port.
3. Remplir le flacon en verre avec odorisant dissous dans de l’huile minérale (remplacé par semaine) et serrer le bouchon.
4. Se connecter à aiguille de calibre 18 à tube en silicone. Percer le bouchon du flacon verre avec aiguille de calibre 18 et branchez l’autre extrémité du tube en silicone à l’apport des ports odeur.
5. Placer chaque tube de silicone dans une vanne de l’odeur.
6. Connectez la ligne du vide vers les ports de l’odeur.
7. Attacher les deux seringues de 10 mL à un dispositif de plaquage métallique et brancher le tuyau de la seringue. Connectez l’autre extrémité du tuyau à une aiguille 18 G. Insérer l’aiguille dans le trou percé du port poke nez sur la chambre de la souris. Branchez l’autre extrémité du tuyau au robinet d’eau.
8. Remplir les deux seringues de 10 mL avec de l’eau potable rongeur.
9. Connecter un compteur de débit d’air à l’entrée d’air et maintenir les flux d’air à 3 à 5 L/min.
10. Connecter les 2 vannes d’eau, 2 soupapes de l’odeur, 2 ports en eaux, port odeur et puissance pour le système d’interface USB. Raccorder les soupapes tous les ports « Sortie », tous les ports d’odeur et de l’eau sur « Entrée » ports. Brancher tout l’équipement pour les sorties de la boîte d’interface USB d’alimentation et enfin, branchez le boîtier d’interface USB au pouvoir.
11. Régler l’aspiration sous vide pour éviter la contamination croisée d’odeurs entre les essais.
12. Utilisez tube odeur spécifique pour connecter odorisant flacons à la chambre.

2. souris préparation : 1 à 3 jours

1. Diviser les souris en 3 groupes : contrôle (aucune formation olfactive nécessaire), Pseudo-(souris entraînées qui reçoivent la récompense ou la punition au hasard) et formé des groupes. Exposer des souris Pseudo-aléatoire entraînées à la livraison de boîte et l’odeur de formation, mais ne fournissent pas de formation olfactive parce que le résultat de récompense contre punition est aléatoirement associée à l’odeur livré.
   NOTE : Le groupe Pseudo-aléatoire formé passera par le paradigme de formation selon les étapes de la « Pseudotraining ». Souris entraînées vont terminer toutes les étapes de la formation. Pseudotraining est facultatif si le but de l’expérience est d’analyser pour des différences de comportement dans la discrimination de l’odeur ou d’apprentissage. Le protocole fourni qu'ici ajoute ce groupe si l’expérimentateur veut détecter les différences neuronales avant et après l’entraînement. Le groupe pseudotrained contrôlerait alors pour l’exposition passive odeur et non-olfactive formation connexe.
2. Commencer la restriction de l’eau chez les souris à 40 mL/kg/jour. Éviter la perte de poids corporel supérieur à 20 % du poids de base des animaux afin d’éviter la détresse (Figure 2A).
3. Peser les souris tous les jours pour s’assurer qu’ils sont supérieurs à 80 % du poids de référence. Si une souris est inférieure à ce seuil, retirez la souris de l’étude et donner librement accès à l’eau.
4. Tous les facteurs environnementaux maintenir constante dans tout le protocole, y compris la température, le bruit et les odeurs parasites (y compris les corps personnel et parfums parfum/cologne/désodorisant).
   Remarque : Comme avec tous les tests de comportement animal, petits changements environnementaux peuvent grandement influencer résultats.

3. instructions pour toutes les étapes

1. Code logiciel d’entraînement pour chacune des étapes ci-dessous. Exécuter le logiciel sur le logiciel comportemental.
   NOTE : Codage pour toutes les étapes sont contenus dans des fichiers codage supplémentaires. Données pour 20 pistes sont regroupées comme un seul spectacle de bloc et de la souris est affiché dans l’ensemble de blocs. En outre, chaque étape peut être répétée sur une souris pour un nombre de jours jusqu'à ce que les critères de réalisation.
2. Ne gardez pas de souris dans la zone de comportement pour les plus de 60 min/jour.
3. Déchets de souris propre de la cage avant chaque souris sont transférée dans la cage. Vaporiser et essuyer la chambre avec l’éthanol à 70 % pour minimiser les distractions odeur de souris.

4. formation étape 1 : Associant eau récompense avec un centre nez Poke, 1 à 3 jours

1. Dans cette étape, associer une récompense de l’eau sur l’exploration du port eau souris.
2. Instructions de programmation formation Stage 1
   1. Le programme de cette étape de n’utiliser que l’orifice de refoulement de l’eau. Laissez la souris une récompense de l’eau pour chaque coup de nez.
      NOTE : Le programme va afficher la durée de l’essai et le nombre total d’eau récompense la souris reçue.
3. Définir la pseudotraining étape 1 programmation identique formation Stage 1.
4. Configuration de la boîte et configuration souris
   1. Configurer la boîte de comportement avec un port en eau dans le centre et avec tous les ports de côté inaccessibles. Placez une souris dans la chambre. Fermer la chambre de souris et débuter le programme de l’étape 1.
5. Considérer cette étape comme complète lorsque la souris atteint 100 essais au sein de 60 min. Retirez la souris de la chambre après 60 min ou 100 essais ont été achevés (Figure 2B).
   Remarque : En raison de différences individuelles, certaines souris naturellement m’abstiendrai d’explorer la zone.
6. Si l’encouragement est nécessaire, fournir manuellement de l’eau dans le port de l’eau. Répétez cette étape jusqu'à 3 jours.
   Remarque : Des souris qui sont déjà formés peuvent être répétés plus de maintenir la parité et de les garder sur la restriction hydrique. Il est également possible de promouvoir un groupe entier à l’étape 2 lorsque la moyenne du groupe atteint 100 essais/60 min. Cela permettra à toutes les souris à poursuivre la formation sur le même jour.

5. formation étape 2 : Comment associer une récompense d’eau côté Port Centre Port nez Poke, 1 à 5 jours

1. Dans cette étape, laissez les souris poke leur nez dans le centre de port et puis immédiatement une récompense en eau sur les orifices latéraux.
2. Configuration de la boîte et configuration souris
   1. Configurer cela et chaque étape ultérieure avec 2 ports d’eau sur les côtés et le port d’odeur dans le milieu. Placez une souris dans la chambre. Fermer la chambre de souris et de commencer la phase 2 du programme.
3. Instructions de programmation formation Stage 2
   1. Fournir la souris avec une récompense immédiate de l’eau des deux côtés après un coup de nez dans le centre d’orifice de refoulement des odeurs. Définir des paramètres de sortie pour cette étape comme la durée de l’essai, le nombre de procès initié et le nombre de récompenses d’eau reçues à moins de 5 s d’un coup de nez.
4. Définir la pseudotraining étape 2 programmation identique formation Stage 2.
5. Considérer cette étape comme complète lorsqu’un minimum de 40 essais sont réalisés en 60 min, avec au moins 25 % de l’eau récompenses reçues à moins de 5 s de la poke de nez Centre port. Retirez la souris une fois cette étape terminée (Figure 2C).
   Remarque : Le programme de formation calcule le pourcentage d’eau récompenses reçues dans un délai raisonnable afin de déterminer la fin de cette phase. Bien que les souris varient à quelle vitesse ils complètent cette étape, plupart des souris atteindra critères d’achèvement dans les 5 jours. Toutefois, si une souris n’a pas terminé cette étape dans les 5 jours, ne pas avancer la souris à l’étape suivante. Cette souris sera supprimée de la cohorte.

6. formation Etape 3 : Associer une récompense de l’eau avec une odeur spécifique et dans une fenêtre de temps spécifique, 1 à 3 jours

1. Dans cette étape, laissez les souris reçoivent une odeur aller (s) sur un coup de nez dans le centre port. Par la suite, donner une récompense de l’eau sur un coup de nez dans les orifices latéraux de l’eau à moins de 5 s.
2. Instructions de programmation formation Stage 3
   1. Livrer l’odeur s + dans le centre de port de l’odeur.
   2. Remettre la récompense de l’eau si la souris pokes les orifices latéraux à moins de 5 s d’une livraison d’odeur.
      NOTE : Le programme commence par ne nécessitant qu’un sac de nez de 100 ms dans le port de centre pour obtenir une récompense de l’eau. Une fois que la souris pokes au centre port pour temps dans 80 % des essais, la durée du temps d’un coup de nez requis pour une récompense de l’eau augmentera de 50 ms jusqu'à 400 ms.
   3. Définissez les paramètres de sortie identique à l’étape 2.
3. Définir les instructions de programmation étape 3 pseudotraining le même comme formation Stage 3. Toutefois, ne branchez pas l’odeur de s + au contrôleur odeur livraison pour s’assurer que l’odeur de s + n’est pas associé avec une récompense de l’eau.
4. Configuration de la boîte et configuration souris
   1. Définir la configuration même au stade 2.
   2. Connectez l’odeur s + sur le contrôleur de livraison d’odeur. Placez une souris dans la chambre. Fermer la chambre de souris et débuter le programme de phase 3. Retirez la souris une fois cette étape terminée.
5. Considérer cette étape comme complet lorsqu’il y a plus de 60 récompenses moins de 60 min (Figure 2D).

7. étape 4 a : associer no-Go (S-) odeur et la répression de délai d’attente, 1 – 2 jours

1. À ce stade, présenter les souris une odeur interdite (S-). Fournir une punition de délai d’expiration pour les souris qui vont mal jusqu’aux ports de l’eau après sentir l’odeur de non-droit.
2. Instructions de programmation formation étape 4 a
   1. Fournir seulement la substance odorante s + à ce stade de début, identique à l’étape 3. Après 40 essais complète de souris, commencer la livraison aléatoire des odeurs d’inclure s + et S-odeurs. Programmer une punition 2-s expirer si la souris tente d’obtenir une récompense de l’eau après avoir présenté l’odeur interdite.
      Remarque : Pour vous aider à distinguer les Go vs no-Go, les feux de côté d’IR peuvent être manipulés tels qu’ils sont sur pendant Go odorisants et off pendant odorisants interdites. Les lumières agissent comme une pile secondaire à l’aide de souris en formation initiale. Une fois que les souris sont formés avec les lumières, les participants doivent formation aller dessous sans s’allume pour confirmer qu’ils ont appris la tâche avec les odeurs.
   2. Définissez les paramètres de sortie comme la durée et du procès, nombre de procès initié, nombre d’essais achevés, % de réponses correctes, nombre total de récompenses reçues.
3. Définir les instructions de programmation de 4 a stade pseudotraining le même comme formation étape 4 s sauf s + et S-les odeurs sont présentées au hasard dès le départ. Donner l’eau punitions récompense ou timeout au hasard, peu importe l’exécution des tâches.
4. Configuration de la boîte et configuration souris
   1. Définir la configuration de la boîte le même comme la précédente étape 3.
   2. Connectez les s + et S-odeur sur le contrôleur de livraison d’odeur. Placez une souris dans la chambre. Fermer la chambre de souris et de commencer le programme de Stage 4 a. Après les procès de 40 complète de souris, le programme de livrer au hasard les odeurs des interrupteurs. Retirez la souris une fois cette étape terminée.
5. Considérer cette étape comme complet lorsqu’il y a 40 essais avec > 60 % de réponses correctes.

8. étape 4 b : associer no-Go (S-) odeur et la répression de Time Out, 5 à 11 jours

1. Instructions de programmation formation étape 4 b
   1. Que ce stade soit identique à l’étape 4 a, cependant la peine de temps d’arrêt pour avoir tenté une récompense de l’eau après une S-odeur est 4 s.
2. La valeur de la récompense de l’eau de pseudotraining stade 4 b instruction identique à l’étape 4 a, de programmation, cependant et peine de temps d’arrêt sont livrés au hasard par le procès.
3. Configuration de la boîte et configuration souris
   1. Définir la configuration de la boîte le même comme la précédente étape 4 a.
   2. Connectez les s + et S-odeur sur le contrôleur de livraison d’odeur. Placez une souris dans la chambre. Fermer la chambre de souris et commencer le programme de stade 4 b. Considérer cette étape complète lorsqu’il y a > 100 essais moins de 60 min avec précision > 85 % (Figure 2A)
4. Surveiller le pourcentage maximum et minimum correct pour chaque session suivre les progrès de chaque souris dans cette étape. Environ 85-90 % des souris atteint le critère de l’achèvement de cette étape. Exclure les souris qui n’atteignent pas la fin de cette phase pour la phase test Go/non-Go.
5. (Facultatif) À la fin de cette étape, appliquez une formation de renversement, où les odorisants Go/non-Go sont commutés sur la plate-forme de flacon d’odeur. Veiller à ce que les souris ne sont pas associer avec un autre stimulus, tels que le bruit des vannes associées les orifices latéraux.

9. Go/non-Go dosage spéciale : 1 jour, 20 Min par souris par jour

1. Considérez ceci comme la phase finale pour déterminer la précision d’identifier les associations de l’odeur et apprendre à discriminer des paires d’odeur.
   NOTE : Nouveaux composés malodorants sont utilisés pour les S + / S-pour tester les animaux combien de temps prendre pour apprendre de nouvelles associations. Structurellement semblable odorisant paires sont utilisées pour augmenter la difficulté de la tâche. Les exemples incluent le Butanol-1 vs 1-Pentanol, isoamyle acétate vs isoamyle Butyrate, et + Carvone vs - Carvone.
2. Instructions de programmation
   1. Laissez le logiciel de formation à détecter la longueur du sac de nez. Programmer un sac de nez de 300 ms dans le port d’odeur Centre d’exécuter la tâche.
   2. Définissez les paramètres de sortie identique à l’étape 4 b, sauf de ne pas utiliser n’importe quelle lumière guidée repères.
3. Configuration de la boîte et configuration souris
   1. Définir la configuration de la boîte le même comme la précédente étape 4 b.
   2. Connectez les s + et S-odeur sur le contrôleur de livraison d’odeur. Placez une souris dans la chambre. Fermer la chambre de souris et de commencer le programme scène Go/non-Go. Exposer les souris qui ont appris la tâche d’apprentissage olfactif de nouvelles paires d’odeurs chimiquement semblables.
      NOTE : Souris de type sauvage avec discrimination adéquate odeur atteint > 85 % de précision avec Roman odorisants après environ 10-20 blocs ou 200-400 essais (Figure 3A).

Résultats

Une fois que les souris ont appris la tâche d’apprentissage olfactif, ils peuvent maintenant associer paires de nouvelles odeurs avec la récompense et la punition. Ces souris entraînées normalement commencent avec environ 50 % exactitude sur la tâche de Go/non-Go. Le pourcentage exact peut être tracé en bloc du procès comme une courbe d’apprentissage pour les paires de nouvelles odeurs (Figure 3A). Au sein de 10 essais de bloc, qui prennent l...

Discussion

Le système olfactif rongeur fournit un modèle unique pour étudier la plasticité charge sensorielle. Nous présentons ici un paradigme d’apprentissage olfactif pour former des souris pour associer des paires odorant avec une récompense ou une punition. Grâce à cette tâche d’apprentissage, modifications du circuit en aval peuvent être étudiées dans des expériences subséquentes (électrophysiologie, in vivo l’imagerie neuronale, etc.). Une fois terminé, souris vont apprendre à effectuer une tâche indicé simp...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flacon en verre	Qorpak	GLC-01016
Tube en silicone	Thermo Scientific	86000030
18 aiguilles de calibre	1 BD	305196
1-Butanol	Sigma Aldrich	437603
Propionic Acid	Sigma Aldrich	402907
Chambre de souris	Med Associates	ENV-307W
Sol de la chambre	Med Associates	ENV-307W-GFW
Port d’eau	Med Associates	ENV-313W	Besoin de deux
stimulus d’odeur	Med Associates	ENV-275	Contient 2 vannes pour bloquer l’évacuation des odeurs  ;
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
Interface USB	Med Associates	DIG-703A-USB
Ordinateur de bureau avec Windows 2000, XP, Vista ou 7
Débitmètre	VWR	97004-952
Logiciel comportemental	Med Associates	SOF-735	Ce logiciel, qui exécute chaque étape de la formation, a maintenant été remplacé par Med-PC V
Logiciel de transfert de données	Med Associates	SOF-731	Ce logiciel formate les données en Excel
Logiciel de formation	Med Associates	DIG-703A-USB	Ce logiciel est utilisé pour programmer chaque étape de formation
Vanne d’eau	Neptune Research	225P012-11	Cette vanne est utilisée pour contrôler la distribution d’eau. Besoin de deux
soupapes anti-odeurs	Neptune Research	360P012-42	Cette soupape est utilisée pour contrôler la livraison des odeurs. Besoin de deux