Un test Flow Cytometry d’identifier des composés qui perturbent la fixation du Ligand de chimiokines CXC fluorescent marqué 12 au récepteur de chimiokines CXC 4

Résumé

Une coulée d’essai de liaison cellulaire axée sur la cytométrie en flux est décrite qui est principalement utilisée comme outil de dépistage pour identifier les composés qui inhibent la fixation d’un ligand de chimiokines CXC fluorescent étiquetée 12 (CXCL12) pour les récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4).

Résumé

Cible pharmacologique des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est d’une grande importance pour la santé humaine, comme dysfonctionnelle GPCR-mediated signaling contribue à la progression de nombreuses maladies. La paire de ligand/récepteur ligand de chimiokines CXC 12 (CXCL12) / récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4) a soulevé des intérêts cliniques significatifs, par exemple comme une cible potentielle pour le traitement du cancer et des maladies inflammatoires. Petites molécules ainsi que des anticorps thérapeutiques qui précisément ciblent CXCR4 et inhibent la fonction de récepteur sont donc considérés comme précieux outils pharmacologiques. Ici, un écoulement cytometry cellulaire test d’amplification qui permet l’identification de composés (par exemple, de petites molécules) qui abroge CXCL12 liaison à CXCR4, est décrite. Essentiellement, l’analyse se fonde sur la compétition pour récepteur liaison entre un montant fixe de CXCL12 fluorescent étiquetés, l’agoniste de chimiokine naturelle pour CXCR4 et composés sans étiquette. Par conséquent, l’utilisation indésirable de sondes marquées radioactivement est évitée dans cet essai. En outre, les cellules vivantes sont utilisés comme source de récepteur (CXCR4) au lieu de préparations de la membrane cellulaire. Cela permet une adaptation facile du dosage d’un format de plat, ce qui augmente le débit. Ce test s’est avéré être un test de découverte précieux médicament générique pour identifier les composés de ciblage CXCR4. Le protocole peut probablement être adapté aux autres RCPG, au moins si ligands fluorescent étiquetés sont disponibles ou peuvent être générés. Une connaissance préalable concernant les voies de signalisation intracellulaires qui sont induites lors de l’activation de ces RCPG, n’est pas nécessaire.

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines de surface de cellules pouvant être activés par des ligands extracellulaires (p. ex., peptides, hormones protéiques, amines), donc réglementer beaucoup physiologique et le développement de procédés¹. Quand un agoniste occupe sa poche de liaison de GPCR, le changement conformationnel induit dans la protéine réceptrice favorise la liaison d’intracellulaire récepteurs associés aux protéines G hétérotrimériques, consistant en G_α- PIB et sous-unités_βγ G. L’échange subséquent du GTP pour le PIB sur les résultats de sous-unité_α G dans la dissocia....

Protocole

1. maintien de la Culture cellulaire

Remarque : Toutes les étapes décrites aux points 1 et 2 sont effectués dans des conditions stériles dans une enceinte à flux laminaire.

1. La croissance de cellules en T75 flacons de culture à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.
   Remarque : Dans cet essai, Jurkat cellules (c'est-à-dire des lymphocytes T leucémiques humaines qui expriment endogène CXCR4¹⁷) sont utilisés. Expression de CXCR4 à la surface de la cellule doit être évaluée tout au long de mise en culture cellulaire par cytométrie en flux. Une description de la procédure de cyt....

Résultats

Le déroulement général de l’essai de liaison est présenté dans la Figure 1 a. Une illustration du type de données de cytométrie en flux obtenus pour des types d’échantillons différents dans une expérience standard (c'est-à-dire le contrôle négatif, contrôle positif et échantillon expérimental) est représentée dans la Figure 1 bet un schéma possible pour effectuer le dosage dans un format de plaque à 96 puits est donné en.......

Discussion

Par rapport à d’autres types d’essais de liaison (c.-à-d., liaison de saturation et des expériences de cinétique de fixation), analyses de liaison de compétition sont plus adaptés pour fins de présélection. En effet, ils permettent l’évaluation de grandes quantités de composés sans étiquette, par exemple de petites molécules, en marquant leur capacité d’interférer avec la fixation d’un montant fixe d’un ligand du récepteur marqué. Composés qui se lient à d’autres sites récepteurs que le ligand étiqueté pourraien.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	Sans objet	Appareil de cytométrie en flux
BD FACSDIVA Logiciel
BD FACSArray	Becton Dickinson	Sans objet	Appareil de cytométrie en flux
BD FACSArray System
Graphpad Prism	Graphpad		progiciel utilisé pour l’analyse de régression non linéaire dans les figures 2 et 3
FlowJo	FlowJo est désormais une filiale à part entière de BD.
Vi-CELL	Beckman Coulter	Sans objet	Analyseur de viabilité cellulaire
Sigma 3-18 KS	Sigma	Non applicable	Centrifugeuse
AMD3100	Sigma	A5602-5mg	antagoniste spécifique de CXCR4
Maraviroc	de Pfizer		, antagoniste du CCR5, disponible pour la recherche chez Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647)	ALMAC	CAF-11-B-01	marqué par fluorescence CXCL12, CXCL12AF647
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnésium, sans rouge de phénol	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Phosphate salin tamponné de Dulbecco (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Cellules Jurkat	ATCC
Réservoir de réactifs PP	Sigma	BR703411
Filtre à débit rapide : 0,2 & micro ; m aPES	Thermo Scientific	566-0020
Plaque de microtitration Sterilin, 96 puits, fond en U, transparent	Thermo Scientific	611U96
Tubes Falcon, 50ml	Greiner Bio-One	227 261
Flacon de culture tissulaire (T75)	Corning	353024