Method Article

Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte

DOI:

10.3791/57511

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May 7th, 2018

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1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

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Les ions potassium contribuent au potentiel de repos membranaire des cellules et la concentration extracellulaire de K+ est un régulateur crucial de l’excitabilité cellulaire. Nous décrivons comment faire, calibrer et utiliser monopolaire K+-microélectrodes. L’utilisation de telles électrodes permet la mesure de la dynamique de concentration K+ évoquée électriquement dans des tranches d’hippocampe adultes.

Abstract

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Ions potassium considérablement contribuent au potentiel de repos membranaire des cellules et, par conséquent, la concentration extracellulaire de K+ est un régulateur crucial de l’excitabilité cellulaire. Modifié les concentrations extracellulaires K+ affect l’excitabilité de cellulaires et potentiels membranaires au repos en déplaçant les équilibres entre États fermés, ouverts et inactivés pour les canaux ioniques voltage-dépendants qui sous-tendent le potentiel d’action initiation et conduction. Par conséquent, il est utile de mesurer directement extracellulaires K+ dynamique en santé et malades États. Nous décrivons ici, comment faire, calibrer et utiliser monopolaire K+-microélectrodes. Nous avons eux déployé dans des tranches de cerveau hippocampe adulte mesure évoquée électriquement dynamique de concentration K+ . L’utilisation judicieuse de ces électrodes est une partie importante de la trousse d’outils nécessaire à l’évaluation des mécanismes cellulaires et biophysiques qui contrôlent les concentrations extracellulaires de K+ dans le système nerveux.

Introduction

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Concentrations d’ions de potassium sont étroitement réglementées dans le cerveau, et leurs fluctuations exercent une influence puissante sur le potentiel membranaire de repos de toutes les cellules. À la lumière de ces contributions critiques, un objectif important de la biologie est de déterminer les mécanismes cellulaires et biophysiques qui servent à bien réguler la concentration de K+ dans l’espace extracellulaire dans les différents organes du corps1 , 2. une exigence importante dans ces études est la possibilité de mesurer avec précision les concentrations de K+ . Bien que de nombre....

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Protocol

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Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément à l’Institut de santé Guide National pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité de recherche des animaux du chancelier à l’Université de Californie à Los Angeles. Toutes les souris étaient logés avec la nourriture et l’eau disponible, ad libitum , dans un environnement de lumière-obscurité de 12 h. Tous les animaux étaient en bonne santé sans modification comportementale évidente et n’étaient pas impliqués dans des études antérieures ont été sacrifiés au cours du cycle de lumière. Données pour les expériences ont été prélevées chez la souris adulte....

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Results

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Pour la mesure sélective d’extracellulaire K+, nous avons préparé des microélectrodes recouverts d’une couche hydrophobe par silanisation des pipettes de verre borosilicaté propre (Figure 1 a). Ce revêtement permet l’ionophore K+ contenant la valinomycine pour se reposer à l’extrémité de l’électrode et permettent seulement K+ flux à travers une ouverture étroite à la pointe de l’électrode (Figure 1 b

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Discussion

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La méthode que nous décrivons ici nous a permis d’évaluer la dynamique K+ en réponse à une stimulation électrique des collatérales de Schaffer dans des tranches d’hippocampe aiguës de souris adultes. Notre méthode de préparation des microélectrodes ion K+ est semblable au plus tôt des procédures décrites12,13,14,15. Toutefois, cette méthode présente des avantages sur les c.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Le laboratoire Khakh était soutenu par le NIH MH104069. Le laboratoire Mody était soutenu par le NIH NS030549. J.C.O. Merci le NIH T32 Neural Microcircuits formation Grant(NS058280).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VibratomeDSKMicroslicer Zero 1
Souris : C57BL/6NTac souris consanguinesTaconicStock#B6
MicroscopeOlympusBX51
Extracteur d’électrodesSutterP-97
Ag/AgCl granulés moulusWPIEP2
pCLAMP10.3Dispositifs moléculairesn/a
Pointe microfil 28G personnaliséeWorld precision instrumentsCMF28G
TungstenRod A-M Systems716000
Électrodes de stimulation bipolairesFHCMX21XEW(T01)
Isolateur de stimulusWorld precision instrumentsA365
Grass S88 StimulatorGrass Instruments CompanyS88
Pipettes en verre borosilicatéWorld precision instruments1B150-4
Carte A à DDigidata 1322AAxon Instruments
Amplificateur de signalMulticlamp 700A ou 700BAxon Instruments
HeadstageCV-7B Cat 1Axon Instruments
Patch computerDelln/a
Sodium ChlorideSigmaS5886
Chlorure de potassiumSigmaP3911
HEPESSigmaH3375
Bicarbonate de sodiumSigmaS5761
Phosphate de sodium monobasiqueSigmaS0751
D-glucoseSigmaG7528
Chlorure de calciumSigma21108
Chlorurede magnésium SigmaM8266
valinomycineSigmaV0627-10mg
1,2-diméthyl-3-nitrobenzèneSigma40870-25ml
Tétrakis de potassium (4-chlorophényl)borateSigma60591-100mg
5 % diméthyldichlorosilane dans l’heptaneSigma85126-5ml
TTXCaïman Chemical Company14964
Acide chlorhydriqueSigmaH1758-500mL
SaccharoseSigmaS9378-5kg
Pipette MicromanipulateurSutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200
ObjectifOlympusPlanAPO 10xW

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
  2. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).
  3. Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Le....

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