Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte

J. Christopher Octeau; Guido Faas; Istvan Mody; Baljit S. Khakh

doi:10.3791/57511

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Article de méthode

Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte

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DOI :

10.3791/57511

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7 mai 2018

J. Christopher Octeau¹ , Guido Faas² , Istvan Mody¹^,² , Baljit S. Khakh¹^,³

¹Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ²Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, ³Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Les ions potassium contribuent au potentiel de repos membranaire des cellules et la concentration extracellulaire de K⁺ est un régulateur crucial de l’excitabilité cellulaire. Nous décrivons comment faire, calibrer et utiliser monopolaire K⁺-microélectrodes. L’utilisation de telles électrodes permet la mesure de la dynamique de concentration K⁺ évoquée électriquement dans des tranches d’hippocampe adultes.

Résumé

Ions potassium considérablement contribuent au potentiel de repos membranaire des cellules et, par conséquent, la concentration extracellulaire de K⁺ est un régulateur crucial de l’excitabilité cellulaire. Modifié les concentrations extracellulaires K⁺ affect l’excitabilité de cellulaires et potentiels membranaires au repos en déplaçant les équilibres entre États fermés, ouverts et inactivés pour les canaux ioniques voltage-dépendants qui sous-tendent le potentiel d’action initiation et conduction. Par conséquent, il est utile de mesurer directement extracellulaires K⁺ dynamique en santé et malades États. Nous décrivons ici, comment faire, calibrer et utiliser monopolaire K⁺-microélectrodes. Nous avons eux déployé dans des tranches de cerveau hippocampe adulte mesure évoquée électriquement dynamique de concentration K⁺ . L’utilisation judicieuse de ces électrodes est une partie importante de la trousse d’outils nécessaire à l’évaluation des mécanismes cellulaires et biophysiques qui contrôlent les concentrations extracellulaires de K⁺ dans le système nerveux.

Introduction

Concentrations d’ions de potassium sont étroitement réglementées dans le cerveau, et leurs fluctuations exercent une influence puissante sur le potentiel membranaire de repos de toutes les cellules. À la lumière de ces contributions critiques, un objectif important de la biologie est de déterminer les mécanismes cellulaires et biophysiques qui servent à bien réguler la concentration de K⁺ dans l’espace extracellulaire dans les différents organes du corps¹ ^, ². une exigence importante dans ces études est la possibilité de mesurer avec précision les concentrations de K⁺ . Bien que de nombreux composants qui contribuent à l’homéostasie de potassium dans le cerveau dans les États sains et malades ont été identifiés³^,⁴^,⁵, encore des progrès a été ralentie en raison de la nature spécialisée du préparation de microélectrodes ion pour la mesure de potassium. Capteurs de la microélectrode représentent l’étalon-or pour la mesure K⁺ concentrations in vitro, en tranches de tissus et in vivo.

Nouvelles approches pour K⁺ de surveillance sont en cours d’élaboration à l’aide de capteurs optiques, cependant elles ne détectent pas une concentration de gamme biologiquement pertinente de K⁺ ou n'ont pas été pleinement vérifiées dans les systèmes biologiques, bien que les premiers résultats semble prometteuse⁶^,⁷^,⁸. Par rapport aux capteurs optiques, microélectrodes sont fondamentalement limitées à une mesure de source ponctuelle des ions, bien que les rangées d’électrodes susceptibles d’améliorer la résolution spatiale⁹. Cet article se concentre sur les capteurs de la microélectrode Canon unique pour le suivi dynamique de K⁺ .

Dans cet ouvrage, les auteurs rapportent des procédures détaillées pas à pas faire K⁺ microélectrodes, utilisant un ionophore valinomycine-basé de potassium qui permet très sélectif (10⁴ fois K⁺ à sélectivité Na⁺ ) K⁺ mouvement sur membranes¹⁰. Un polypeptide d’origine naturelle, valinomycine agit comme un pore de perméabilité K⁺ et facilite l’écoulement de K⁺ vers le bas de son gradient électrochimique. On décrit aussi comment calibrer les électrodes, comment stocker et les utiliser et enfin comment déployer afin de mesurer la dynamique de concentration K⁺ en tranches aiguë hippocampe cerveau de souris adultes. L’utilisation de telles électrodes ainsi que des souris génétiquement modifiées qui n’ont pas les canaux ioniques spécifiques proposés de réglementer extracellulaires K⁺ dynamique devrait révéler les mécanismes cellulaires utilisés par le système nerveux pour contrôler la concentration ambiante de K ⁺ dans le milieu extracellulaire.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément à l’Institut de santé Guide National pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité de recherche des animaux du chancelier à l’Université de Californie à Los Angeles. Toutes les souris étaient logés avec la nourriture et l’eau disponible, ad libitum , dans un environnement de lumière-obscurité de 12 h. Tous les animaux étaient en bonne santé sans modification comportementale évidente et n’étaient pas impliqués dans des études antérieures ont été sacrifiés au cours du cycle de lumière. Données pour les expériences ont été prélevées chez la souris adulte (6-8 semaines pour toutes les expériences).

1. préparation des microélectrodes K⁺

Silanisation verre borosilicate
1. Enlever suffisamment capillaires en verre d’emballage et placer dans un tube conique de 50 mL. Remplir un tube conique à haut avec électrodes lavage HCl 1 M avec agitation modérée dans HCl pendant la nuit ou pendant au moins 6 heures.
2. Rincez brièvement capillaires avec l’éthanol à 70 % et puis sécher complètement à 100-120 ° C pendant 6 à 8 heures. Stocker les capillaires lavés dans des récipients avec déshydratant de sulfate de calcium anhydre jusqu'à 4 semaines avant d’utiliser.
3. Avant la silanisation, tirez capillaires à une pointe fine à l’aide d’un extracteur de microélectrodes. Des microélectrodes que nous utilisons sont environ de 2 à 5 microns de diamètre. Toujours manipuler les capillaires lavés avec des gants, comme les huiles de la peau peuvent interférer avec la silanisation.
4. Placez des microélectrodes dans un récipient en verre pour que les électrodes sont élevés par le bas pour éviter tout bris de pointe. Difficulté des microélectrodes dans le conteneur à l’aide de ruban autoclavable ou similaire de ruban adhésif.
5. Retirer environ 0,5 mL de solution de silanisation 5 % dichlorodiméthylsilane (DDS) de son conteneur à l’aide de la méthode de remplacement d’azote (voir Figure 2). Remplir un ballon d’azote gazeux et fixer le tube ou une seringue et une aiguille à l’info-bulle. Insérer l’aiguille dans le conteneur DDS tout en tirant vers le haut de DDS dans une seringue séparée via une aiguille plus longue.
6. Appliquer la solution de silanisation goutte à goutte sur le bout des pipettes et couvrir immédiatement. Placer le récipient tenant le microélectrodes avec solution de silanisation dans un four préchauffé de laboratoire (170-180 ° C) pendant 10 à 12 heures, soit à 200-220 ° C pendant 30 minutes
7. Après l’incubation, éteindre le four et ensuite retirer la plaque du four. Soyez prudent lorsque vous retirez la plaque de l’incubateur, car il fait très chaud. Placer la plaque sur un banc à température ambiante pendant 10-15 minutes permettre à la verrerie de refroidir.
8. Retirer les microélectrodes de la plaque (en utilisant une lame de rasoir ou une lame de bistouri pour couper le ruban) et placez-les dans un contenant hermétique rempli déshydratant. Silanisée microélectrodes exempts d’humidité peuvent être utilisés jusqu'à 1 semaine après silanisation.
D’amorçage les électrodes
1. Préparer une solution de K⁺ionophore cocktail : valinomycine de 5 % p/v, 93 % v/v 1, 2-diméthyl-3-nitrobenzène, potassium 2 % w/v tetrakis(4-chlorophenyl) borate¹¹. Cette solution est une couleur jaune pâle. Garder dans un contenant hermétique, opaque à la température ambiante. Si entreposé cette solution peut durer plusieurs mois.
2. Préparer une solution de 10 mM HEPES tamponnée 300 mM NaCl à un pH de 7,4. Fixer l’électrode dans une pince et remblayer avec du NaCl dans la mémoire tampon en utilisant un embout de microfil 28G relié à une seringue. Observer que la solution saline a atteint l’extrémité de la microélectrode. Confirmer que la microélectrode est exempte de grosses bulles pouvant gêner la circulation du courant.
3. Briser la pointe de l’électrode à environ 10 à 20 µm de largeur, en utilisant le côté émoussé d’un bistouri ou une lame de rasoir.
4. À l’aide d’une micropipette, appliquer une petite goutte (~0.1 µl) de l’ionophore K⁺ près de l’extrémité de la microélectrode. Si l’électrode a été correctement silanisée la goutte est absorbée dans la pointe cassée. Remplissage de l’électrode à 1-2 mm avec l’ionophore K⁺ et supprimer excès à l’aide de papier de soie.

2. étalonnage des microélectrodes K⁺

Préparation des solutions d’étalonnage
1. Préparer des solutions de différentes concentrations de KCl dans le liquide céphalorachidien artificiel osmolarité égal (FSCA) en remplaçant le NaCl avec du KCl. Nous avons utilisé 0,1, 1, 4,5, 10 et 100 mM K⁺ ACSF, pour l’étalonnage des électrodes. Les recettes de ces solutions d’étalonnage sont énumérés au tableau 1.

Produit chimique	MW	mM final	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4,5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
Produit chimique	(g / mol)	mM final	0,1 mM [K +]	1 mM [K +]	4,5 mM [K +]	10 mM [K +]	100 mM [K +]
NaCl	58.44	varie	1,51 g	1,50 g	1,44 g	1.4 g	0,345 g
KCl	Stock de 1 M	varie	20 µl	200 µl	900 µl	2 ml	20 ml
CaCl₂	Stock de 1 M	2	400 µl
MgCl₂	Stock de 1 M	1	200 µl
NaH₂PO₄	119.98	1.2	0,29 g
NaHCO₃	84.01	26	0,437 g
D-Glucose	180.16	10	g 0,360
Eau	q.s 200 ml

Le tableau 1. Solutions d’étalonnage de potassium

Étalonnage de la microélectrode
1. Toutes les solutions avec 95 % O₂5 % CO₂ des bulles pendant au moins 20 minutes avant de commencer l’expérience. Commencer perfusant le bain avec 4,5 mM [K⁺] FSCA à raison de 3 mL / minute. Placer l’électrode sélective K⁺ dans porte-électrode, attaché à la tête d’électrode sur le manipulateur. Ce préamplificateur est connecté à un amplificateur approprié. Insérez l’extrémité de l’électrode dans le perfusat de bain.
2. S’assurer que l’électrode Ag/AgCl de la terre est baignée dans la même solution et que le flux est constant. Appliquer des solutions d’étalonnage de façon progressive et enregistrer les changements potentiels en mV à travers l’extrémité de l’électrode. Attendez que le potentiel à la pointe de l’électrode atteindre une valeur stable avant de passer à la solution suivante
3. Mesurer le changement de tension stabilisées en réponse à la demande des solutions d’étalonnage à la pointe de l’électrode. Confirmer que la pente de la réponse de l’électrode est au moins 52 et ne dépasse pas 58 mV / journal change en [K⁺].

3. préparation des tranches de cerveau hippocampe aiguë

Préparation des solutions de tranche
1. Préparer le saccharose 500 mL coupe solution composée de : saccharose de 194 mM, 30 mM NaCl, KCl, 10 mM de D-glucose, 1 mM MgCl₂à 4,5 mM, 1,2 mM NaH₂PO₄et 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, imprégnée de 95 % O₂ et de 5 % de CO₂.
2. Préparer 1 à 2 litres de solution d’enregistrement (FSCA) composés de : 124 mM NaCl, KCl 4,5 mM, 1 mM MgCl₂, 10 mM de D-glucose, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄et 26 mM NaHCO₃; pH 7,3 à 7,4 (après la formation de bulles), 290-300 mOsm, imprégnée de 95 % O₂ et de 5 % de CO₂. Remplir un bécher contenant une cerveau tranche porte chambre avec la solution d’enregistrement et le maintenir à 32-34 ° C. Remplir la chambre vibratome avec la bouillie de glace-eau.
Préparation de tranche aiguë
1. Profondément anesthésier une souris en le plaçant dans une cloche de verre préchargée avec 2-3 mL isoflurane. Recherchez les réflexe de pincée d’orteil et si non conforme, rapidement décapiter à l’aide d’une paire de ciseaux pointus ou guillotine comme l’exige le protocole de votre animal.
2. Faire une incision de 2 à 3 cm à l’aide de ciseaux de la portion caudale du crâne pour couper le cuir chevelu le long de la ligne médiane. Tandis que manuellement rétractant le cuir chevelu, faire deux incisions horizontales 1 cm depuis le trou occipital le long des côtés du crâne. Puis, à l’aide de cisailles fines, coupez une incision la longueur du crâne, le long de la ligne médiane de l’arrière du crâne vers le nez.
3. À l’aide de pinces fines insérées près de la ligne médiane, rétracter le crâne incisé en deux tranches. Extraire le cerveau de la souris sur le crâne et utiliser une lame pour enlever le cervelet et les bulbes olfactifs, qui sont respectivement situés dans les parties du cerveau à la caudales et rostrales. Ceux-ci peuvent être identifiés par les grandes fissures, qui les séparent du cortex.
4. Montez le bloc de cerveau sur le plateau de vibratome avec de la colle super. Remplissez le plateau vibratome avec solution de découpe glaciale.
5. Couper des sections de tissu sur le plan coronal à 300 µm d’épaisseur. Généralement 6 tranches hippocampal coronales peuvent être collectées.
6. Après que chaque section est coupée, transférer immédiatement les tranches à la tranche tenant bécher réchauffé à 32-34° C. Conserver les sections à cette température pendant 20 min avant de retirer le bécher contenant les sections et de placer ce à température ambiante pendant au moins 20-30 minutes avant l’enregistrement.

4. mesure de la dynamique évoquées électriquement K⁺

Mise en place de la préparation de tranches
1. Placez délicatement la tranche de cerveau dans le bain à l’aide d’une pipette Pasteur et maintenez-le enfoncé doucement en place avec une harpe platine avec des cordes en nylon.
2. S’assurer que l’extrémité de l’électrode de stimulation bipolaire est parallèles entre eux et est de niveau avec la surface de la tranche. Lentement, au cours des 6-7 secondes, insérez les électrodes CA3 stratum radiatum environ 40-50 µm profonde afin de stimuler les collatérales de Schaffer. Dans les sections coronales, CA3 peut être identifié environ comme la portion du latéral approprié à la couche de cellules de granules à l’hippocampe genu, hippocampe avec stratum radiatum tombant médial et ventrale à la couche de cellules pyramidales.
3. Insérez avec précaution le K⁺-électrode sélective en CA1 stratum radiatum environ 50 µm profonde, en abaissant lentement l’électrode sur environ 3-4 secondes. Laisser la possibilité de se stabiliser dans l’électrode avant d’appliquer les stimulations à la tranche : cela prend habituellement 5 à 10 minutes. Si la tranche présente spontanée changements extracellulaire K⁺ puis jeter et répétez ce processus pour une nouvelle tranche.
Mesurer la libération évoquée de K⁺
1. Appliquer les trains de la stimulation électrique (8 impulsions) en appuyant manuellement sur la gâchette sur le stimulateur lors de l’enregistrement numérique des réponses. Appliquer une stimulation à 10 Hz et 1 largeur d’impulsion de ms, commençant à amplitude de stimulation 10 µA.
2. Appliquer les amplitudes de stimulation accrue par un facteur de 2 jusqu'à détection d’une amplitude maximale de réponse K⁺ . Si vous ne voyez pas de réponse, modifie la position de l’électrode K⁺ plus près du site de stimulation à 100 µm par incréments
3. Déterminer l’amplitude de stimulation qui produit la moitié de la réponse maximale. Dans notre expérience, c’est entre 40-160 µA, dépendant de la qualité de la préparation, l’âge de l’animal et la distance entre les électrodes de stimulation et électrode sélective K⁺ .
4. Dans la même tranche, en utilisant une amplitude de stimulation à un peu plus bas que l’amplitude qui produit la moitié de la réponse maximale (par exemple si 80 µA produit une réponse maximale, utilisez 40 µA) s’appliquent à des trains de stimuli de plus en plus nombre d’impulsions. Au départ, nous avons utilisé des trains d’impulsions de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 et 128.
5. Pour confirmer que K⁺ signaux sont médiés par des tirs de potentiel d’action de la baignoire de collatérales de Schaffer stimulée électriquement, appliquer 0,5 µM TTX dans FSCA pendant 10 minutes et répéter le protocole de stimulation. Aucune réponses évoquées ne doivent être observées.
6. Après avoir terminé l’expérience de la tranche, confirmer l’électrode a maintenu sa réceptivité par re-calibrer l’électrode dans les solutions d’étalonnage et d’assurer la réponse n’a pas dévié de plus de 10 % par rapport à l’étalonnage initial

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Résultats

Pour la mesure sélective d’extracellulaire K⁺, nous avons préparé des microélectrodes recouverts d’une couche hydrophobe par silanisation des pipettes de verre borosilicaté propre (Figure 1 a). Ce revêtement permet l’ionophore K⁺ contenant la valinomycine pour se reposer à l’extrémité de l’électrode et permettent seulement K⁺ flux à travers une ouverture étroite à la pointe de l’électrode (Figure 1 b

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Discussion

La méthode que nous décrivons ici nous a permis d’évaluer la dynamique K⁺ en réponse à une stimulation électrique des collatérales de Schaffer dans des tranches d’hippocampe aiguës de souris adultes. Notre méthode de préparation des microélectrodes ion K⁺est semblable au plus tôt des procédures décrites¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Toutefois, cette méthode présente des avantages sur les c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le laboratoire Khakh était soutenu par le NIH MH104069. Le laboratoire Mody était soutenu par le NIH NS030549. J.C.O. Merci le NIH T32 Neural Microcircuits formation Grant(NS058280).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Souris : C57BL/6NTac souris consanguines	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Extracteur d’électrodes	Sutter	P-97
Ag/AgCl granulés moulus	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Dispositifs moléculaires	n/a
Pointe microfil 28G personnalisée	World precision instruments	CMF28G
Tungsten	Rod A-M Systems	716000
Électrodes de stimulation bipolaires	FHC	MX21XEW(T01)
Isolateur de stimulus	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Pipettes en verre borosilicaté	World precision instruments	1B150-4
Carte A à D	Digidata 1322A	Axon Instruments
Amplificateur de signal	Multiclamp 700A ou 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Chlorure de potassium	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Bicarbonate de sodium	Sigma	S5761
Phosphate de sodium monobasique	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Chlorure de calcium	Sigma	21108
Chlorure	de magnésium Sigma	M8266
valinomycine	Sigma	V0627-10mg
1,2-diméthyl-3-nitrobenzène	Sigma	40870-25ml
Tétrakis de potassium (4-chlorophényl)borate	Sigma	60591-100mg
5 % diméthyldichlorosilane dans l’heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Caïman Chemical Company	14964
Acide chlorhydrique	Sigma	H1758-500mL
Saccharose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulateur	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objectif	Olympus	PlanAPO 10xW

Références

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