Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

Résumé

Nous décrivons une nouvelle méthode pour la livraison de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de souris la vessie in vivo par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Il offre un moyen rapide et pratique pour générer des modèles autochtones murins de maladies de la vessie.

Résumé

Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) sont extrêmement précieux en révélant de nouveaux aperçus biologiques sur les mécanismes de déclenchement et la progression des maladies humaines comme le cancer. L’ablation des tissus spécifiques ou d’un cellule types in vivoou souris transgéniques et conditionnel ont été fréquemment utilisés pour la surexpression du gène. Cependant, la génération de modèles de souris de lignée germinale peut être lente et coûteuse. Des avancées récentes gène édition de technologies et la faisabilité de délivrer des plasmides d’ADN par infection virale ont permis la génération rapide des modèles de cancer de souris autochtone non germinale pour plusieurs organes. La vessie est un organe qui a été difficile pour les vecteurs viraux accéder, en raison de la présence d’une couche de glycosaminoglycanes couvrant l’urothélium. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour une prestation efficiente des plasmides d’ADN dans la souris vessie urothélium in vivo. L’instillation intravésicale de plasmides d’ADN pCAG-GFP et électroporation de vessie chirurgicalement exposée, nous montrons que le plasmide d’ADN peut être livré plus précisément dans les cellules urothéliales de vessie pour expression transitoire. Notre méthode fournit un moyen rapide et pratique pour la surexpression et inactivation de gènes dans la vessie de souris et peut être appliqué à la construction de négociants de cancer de la vessie et d’autres maladies urologiques.

Introduction

Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) jouent un rôle essentiel dans l’expansion de nos connaissances sur le développement animal, fonctions gène in vivoet mécanismes de la progression de la maladie^1,2. Gregory de la lignée germinale sont traditionnellement développés de deux façons. La première est la création de souris transgéniques par injection pronucléaire de plasmides d’ADN suivie par la transplantation des zygotes dans les femelles pseudo-gravides. L’autre est la génération de souris knock-out/knock-in par recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires et le développ....

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées selon les directives et les règlements de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Santa Cruz.

1. le plasmide et préparation des outils

1. Pour chaque vessie à transfecter, préparer au moins 20 µL de plasmides d’ADN (1 µg/µL).
2. Ajouter 1 µL de bleu Trypan dans les 20 µL de solution de plasmide dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Pipette pour bien mélanger.
3. Autoclave tout surgical instruments et stériliser l’espace de travail avec l’éthanol à 70 %. Vaporiser les instruments chirurgicaux et des gants d’éthanol à 70 ....

Résultats

Pour démontrer le succès de la livraison de gène dans la vessie urothélium, nous avons utilisé le plasmide de¹⁵ pCAG-GFP électroporation. 20 µL de plasmides et de solution de bleu de Trypan est injecté à travers l’urètre et 5 impulsions électriques ont été administrées. Après 48 h, nous disséqué la vessie de souris et observé des patchs de fluorescence GFP sous le microscope de fluorescence de dissection, alors qu’un négatif contrôler la vessie qui n’a pas subi d’é.......

Discussion

Électroporation améliore la perméabilité de la membrane cellulaire et est une technologie puissante pour le gène Electrotransfert¹⁶. Livraison de gène dans la vie des rongeurs par électroporation a été fréquemment utilisé en neurobiologie champs^{17,18,19,20,21}. Ses applications potentielles dans de nombreux autres organes n’ont pas été e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD 1mL TB Seringue	Fisher	148232E
Buprénorphine	Sigma	B9275-50MG
Dumont Pince à épiler	Roboz Institut chirurgical	RS-5005	Traiter avec 70 % d’éthanol avant utilisation chirurgicale
ECM830 SQ Wave Electroporator	Harvard	Apparatus 450052
Exel International Disposable Safelet I.V. Cathéters	Fisher Scientific	14-841-21	24G, longueur 2,11 cm, diamètre extérieur 0,045 cm
Micro dissection extra fine Ciseaux	chirurgicaux Roboz Instr	RS-5135	Traiter avec 70 % d’éthanol avant utilisation chirurgicale
Isoflurane	Vet one	501017
K& H Tapis de repos chauffant pour petits animaux, 9 x 12 pouces	Amazon	n/a	Couvrir le tapis chauffant avec des serviettes en papier
Pommade ophtalmique	Fisher	NC0849514
PBS, pH7.4	Life Technologies	10010049
Embouts de pipette 200 µ ; L	USA Scientific	1111-0206
Pointes de pipette, ajustement universel ; 0,1 à 10 & micro ; L		Fisher 02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmide CAG-GFP	Addgene	16664
Platinum tweezertrode 5 mm	Harvard Apparatus	450489	5 mm de diamètre
Ciseaux	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Traiter avec 70 % d’éthanol avant utilisation chirurgicale
Cordon de corde	Amazon	n/a	Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm 1mm couture en cuir plat fil ciré cordon
Ruban adhésif, Scotch	Fisher	19047257
Therio-gel Lubrifiant vétérinaire	PBS santé animale	353-736
Trypan Blue Stain	Life Technologies	15250061
V-1 Dessus de table système d’anesthésie	VetEquip	901806
Vicryl violet suture 18" FS-2 coupe 5-0	Fisher	NC0578475
Walgreens Povidone Iodine 10 %	Walgreens	953982
Clip de plaie	Fisher	018045
Applicateur de clip de plaie	Fisher	01804