Article de méthode

In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes

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DOI :

10.3791/57881

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28 juin 2018

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1Institute of Biochemistry, Graz University of Technology

Dans cet article

Résumé

Bactéries bioluminescentes réglementent la production légère au moyen de divers mécanismes, tels que quorum sensing. Cette nouvelle méthode permet l’enquête in situ de la bioluminescence et la corrélation de l’émission de lumière densité cellulaire. Un artificiel bioluminescentes Escherichia coli système permet la caractérisation des opérons lux , Lux protéines et leur interaction.

Résumé

Il y a un nombre considérable d’espèces bactériennes capables d’émettre de la lumière. Tous partagent le même groupe de gènes, à savoir l’opéron lux . Malgré cette similitude, ces bactéries présentent des variations extrêmes dans les caractéristiques comme comportement de croissance, l’intensité d’émission de lumière ou d’un règlement de la bioluminescence. La méthode présentée ici est un dosage nouvellement développé qui combine l’enregistrement de la croissance cellulaire et l’intensité de luminescence bioluminescent au fil du temps en utilisant un lecteur de plaque. La croissance qui en résulte et les caractéristiques de l’émission de lumière peuvent être liés à des caractéristiques importantes de la souche bactérienne respectif, comme le quorum sensing règlement. La culture d’un éventail de bactéries bioluminescentes nécessite un support spécifique (par exemple, moyen de l’eau de mer artificielle) et défini des températures. Le facile à manipuler, non-bioluminescentes norme-recherche bactérie Escherichia coli (e. coli), en revanche, peut être cultivé économiquement en grande quantité dans l’échelle de laboratoire. Exploitant des e. coli en introduisant un plasmide contenant l' ensemble lux operon peut simplifier les conditions expérimentales et en outre ouvre de nombreuses possibilités pour de futures applications. L’expression des gènes lux utilisant une souche d’expression e. coli a été atteint par la construction d’un plasmide d’expression via Gibson le clonage et l’insertion de quatre fragments contenant sept gènes lux et trois gènes de côtes de l’opéron lux-côtes dans un vecteur de pET28a. E. coli selon l’expression des gènes lux peut être induite et contrôlée par l’addition d’Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) entraînant bioluminescentes e. coli cellules. Les avantages de ce système sont pour éviter de quorum sensing règlement les restrictions et les compositions moyennes complexes ainsi que des conditions de croissance non standard, telles que définir les températures. Ce système permet l’analyse des gènes lux et leur conjugaison, par l’exclusion du gène de l’opéron lux , respectif ou même addition de nouveaux gènes, échanger des gènes luxAB d’une souche bactérienne par un autre, ou l’analyse des complexes protéiques, telles que luxCDE.

Introduction

L’émission de lumière par des organismes vivants (bioluminescence) est un processus fascinant, trouvé dans les bactéries, champignons, insectes, nématodes, poissons et calmars1. Luminescence bioluminescente émerge d’une réaction chimiluminescente dans lesquels les énergie chimique est (partiellement) transformé en énergie lumineuse (« lumière froide »). Chez les bactéries bioluminescentes, la luciférase d’enzyme hétérodimérique catalyse la monooxygénation de longues chaînes, les aldéhydes aliphatiques, tels que tetradecanal, acides correspondants accompagné d’émission de lumière avec un maximum à 490 nm2, 3.

Diagramme de réaction biochimique ; synthèse de la lumière via la luciférase LuxAB ; n = 4, 6, 8, 10 ; FMNH2+O2.
Figure 1 : Schéma de la réaction générale de la luciférase bactérienne. La luciférase bactérienne (LuxAB) catalyse la monooxygénation de longue chaîne aldéhydes (CH3(CH2)nCHO) en utilisant réduit la flavine mononucléotide (FMNH2) et l’oxygène moléculaire (O2), ce qui donne les produits longues chaînes d’acides (CH3(CH2)nCOOH), flavine mononucléotide (FMN), eau (H2O) et l’émission de lumière centrée à 490 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

L’énergie libérée au cours de cette oxydation provoque un état excité FMN-4 a-hydroxyde, qui sert de la luciférine4diodes. Les protéines impliquées dans la bioluminescence bactérienne, à savoir LuxCDABEG, sont codées par l’opéron lux et sont très conservés au cours de différentes souches bactériennes2,5. Les gènes luxA et luxB codent pour la luciférase hétérodimérique ; produits de gène de luxC, de luxDet de luxE sont des éléments d’une réductase d’acides gras complexe ; et luxG encode pour une flavine réductase6. Un certain nombre de bioluminescent Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) portent le gène de supplémentaires via . Il a été signalé que FL est une homodimère protéine qui lie la flavine inhabituelle dérivé 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,,12. Autres gènes ont été identifiés qui sont responsables de la synthèse de riboflavine (p. ex., ribEBH) et en outre gènes régulateurs ont été signalés, qui jouent un rôle dans le règlement de télédétection quorum de la bioluminescence, surtout pour les Vibrio fischeri et Vibrio harveyi6,13. Malgré l’ordre des gènes hautement conservée, bactéries bioluminescentes présentent des variations élevées en caractéristiques comme comportement de croissance, l’intensité d’émission de lumière, ou d’un règlement de bioluminescence2,5,14 .

Plusieurs modification des souches ou des plasmides contenant des pièces ou entier lux opérons sont connus, usant de bioluminescence comme systèmes de journaliste. Diverses applications telles que déterminer l’activité du promoteur, suivi des contaminations bactériennes dans l’environnement ou des échantillons d’aliments, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), l’imagerie in vivo des infections chez les organismes eucaryotes, Pyrosequencing et ainsi de suite ont été établis15,16,17. Fait intéressant, les trois les plus fréquemment utilisés bioluminescente journaliste systèmes proviennent de la luciole nord-américain (Photinus pyralis), les agents pathogènes entériques de nématodes (Photorhabdus luminescens) et la pensée de mer (Renilla reniformis). Aucun de ces systèmes a une origine bactérienne, mais l’utilisation de gènes de lux et opérons d’origine bactérienne gagne plus d’intérêt pour la recherche appliquée,16. L’application moins abondante des protéines de la bioluminescence des sources bactériennes est principalement due à plus faible stabilité et longévité de bactéries provenant des protéines luminescentes qui peuvent être liées à leurs habitats marins. Les bactéries bioluminescentes des habitats marins ne sont pas cultivables dans des conditions de laboratoire standard. Ces bactéries ont besoin de milieux de culture spécifiques et les conditions, comme la mer artificielle croissance/incubation moyenne et basse température de l’eau (p. ex., 28 ° C).

Pour simplifier la comparaison des caractéristiques d’opéron lux ou unique lux gènes d’une gamme de différentes souches bactériennes bioluminescents, une méthode pour standardiser l’analyse et l’expression d’opéron lux est une condition sine qua non. Ainsi, l’idée d’intégrer l’opéron ensemble lux-côtes dans la norme-recherche bactérie Escherichia coli (e.coli) a émergé. À cette fin, l’Assemblée Gibson s’est avérée un outil utile pour intégrer plusieurs fragments linéaires, qui se chevauchent dans le vecteur d’une expression sans besoin de sites de restriction spécifique. Cette méthode convient également lorsque l’ADN insertions sont trop grandes (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9KO opéron taille) à être amplifié par PCR. Un opéron lux peut être séparé en plusieurs fragments qui se chevauchent, puis être assemblé dans le plasmide d’une expression et enfin vérifier la séquence produit Assemblée peut être directement transformé en un approprié e. coli système à rendement élevé protein expression18,19,20. Outre la facile à manipuler l’expression génique de e. coli selon lux , une méthode simple, combinant l’enregistrement de la croissance cellulaire et luminescence bioluminescente restait à établir. La méthode décrite ici permet la in situ mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes.

L’analyse de gènes lux et lux operon règlement de diverses bactéries bioluminescentes avec, d’une part, une bioluminescence artificiel e. coli système contenant l’opéron ensemble lux-côtes de P. mandapamensis 27561 et, d’autre part, un essai de lecteur de plaque nouvellement développé combinant l’enregistrement in situ de la densité cellulaire et émission de lumière, permet d’obtenir plus d’informations sur les différents systèmes bactériens lux . Cette caractérisation fondamentale et comparaison de luciférases et enzymes apparentées peuvent conduire à des solutions de rechange aux systèmes déjà établis journaliste avec activité et une meilleure stabilité.

Protocole

1. conception, préparation et l’Expression de la lux Operon chez Escherichia coli

Remarque : Consultez la Table des matières pour plus d’informations sur les kits commerciaux utilisés dans cette section.

  1. Pour le transfert de l’opéron lux dans e. coli , choisir un vecteur standard pour animaux de compagnie avec des sites de restriction appropriée et le gène de résistance aux antibiotiques d’intérêt (p. ex., pET28a ; Ncol, XhoI, kanamycine).
  2. Concevoir les fragments et le chevauchement des amorces pour l’assemblage de Gibson basé sur la séquence d’ADN de Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank : DQ988878.2).
  3. Mettre en place une réaction standard de PCR avec des amorces et l’ADN génomique isolé de Photobacterium mandapamensis 27561 comme modèle (voir Matériel supplémentaire pour les amorces et les conditions).
    NOTE : Isolement de l’ADN génomique de la souche bactérienne respectif améliore l’efficacité PCR.
  4. Purifier le produit PCR par l’intermédiaire de purification colonne.
  5. Effectuer une digestion de restriction du vecteur pET28a isolé avec Ncol et XhoI à 37 ° C pendant 45 min.
  6. Purifier le vecteur linéarisé et les fragments PCR via agarose gel électrophorèse et purification ultérieure-colonne.
  7. Déterminer la concentration d’ADN de chaque fragment et le vecteur linéarisé et calculer les quantités optimales pour l’Assemblée selon le protocole20,21.
    NOTE : L’efficacité du montage dépend de la taille du fragment et nombre et doit être ajustée en fonction protocole20,21 du fabricant.
  8. Après avoir combiné tous les fragments et la mémoire tampon dans un tube PCR, incuber le mélange de l’Assemblée dans une machine PCR à 50 ° C pendant 1 h.
  9. Transformer le produit vectoriel assemblé conformément aux protocoles standard de transformation transformation, plasmide bactérien Escherichia coli en un approprié e. coli système pour la réplication plasmidique à haut rendement (p. ex. e. coli TOP10 (ou XL-1).
  10. Prélever des colonies de la plaque de la transformation et la strie sur les nouvelles plaques pour l’isolation de l’ADN.
  11. Isoler l’ADN de plasmide conformément aux protocoles standards.
  12. Pour vérifier le montage correct du plasmide y compris tous les fragments, exécutez d’abord une PCR sur colonie conformément aux protocoles standards à l’aide d’amorces spécifiques pour chaque fragment assemblé.
  13. En outre, à la PCR sur colonie et électrophorèse sur gel d’agarose ultérieures, préparer tous les vecteurs de montage isolé pour le séquençage de l’ADN vérifier le montage correct et les séquences d’ADN corrects.
  14. Transformer le plasmide vérifié conformément aux protocoles standard de transformation transformation, plasmide bactérien Escherichia coli en un approprié e. coli système pour la production de protéines à haut rendement (e.g.,E. coli BL21).
    NOTE : Continuer directement avec protocole d’expression ci-dessous. Pour une conservation plus longue, la préparation d’un stock de glycérol est recommandée.

2. expression de souches mis à jour le e. coli

  1. Préparer une culture au jour le jour (ONC) pour l’expression par l’inoculation d’un volume approprié de milieu LB (p. ex., 100 mL) avec le stock de glycérol préalablement préparée des cellules e. coli BL21 transformé avec le plasmide assemblé ou directement depuis un plaque de transformation. Ajouter 100 µL de kanamycine (50 mg/mL ; gène de résistance aux antibiotiques de pET28a) et incuber l’ONC à 37 ° C et 120 tr/min dans un shaker incubateur du jour au lendemain.
  2. Ensemencer la culture principale manifestation (par exemple, 800 mL de milieu LB) avec 8 mL de l’ONC et ajouter 800 µL de kanamycine (50 mg/mL).
  3. Incuber la principale culture à 37 ° C et 120 tr/min dans un shaker incubateur jusqu'à ce que la densité des cellules atteigne une OD600 de 0,6 - 0,8 (soit environ 2,5 h).
  4. Réduire la température d’incubation à 28 ° C.
  5. Induisent l’expression de la protéine en ajoutant IPTG à une concentration finale de 0,1 mM.
    Remarque : Les tests empiriques ont montré que la réduction de la température à 28 ° C a donné la plus haute intensité lumineuse.
  6. Observer les cellules jusqu'à ce qu’ils commencent à briller (environ 1 h).
    Remarque : Selon le but de l’expression, les cellules sont cultivées jusqu’au lendemain et sont ensuite récoltés, ou les cellules peuvent être gardés secouant tant qu’ils sont brillants (maximum 48 h). Les cellules et la purification de toutes les protéines de la récolte peut se faire conformément aux procédures standards.

3. expression de souches de bactéries bioluminescentes

NOTE : Souches de bactéries bioluminescentes exigent milieu d’eau de mer artificielle/moyen croissance spécifique pour la croissance et la production de lumière.

  1. Préparer le milieu eau de mer artificielle, composé de deux composantes moyennes préparés séparément.
    Remarque : La préparation du milieu de l’eau de mer artificielle est une adaptation de l’original protocole22. Les montants suivants sont pour le milieu liquide de 1 L ou de milieu gélosé 1 L.
    1. Pour les moyen de l’eau de mer artificielle, pèsent dans les sels suivants : 28,13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g de CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3et 3,50 g MgSO4 · 7H2O.
    2. Ajouter 1 L d’eau distillée et dissoudre tous les composants.
    3. Pour milieu LB, peser les ingrédients suivants : 10 g d’extrait de levure, peptone 10 g et pour les boîtes de gélose, une gélose supplémentaire 20 g.
    4. Ajouter 250 mL d’eau du robinet et dissoudre les composants.
    5. Autoclave les deux préparés médias séparément à 121 ° C pendant 20 min.
    6. Pour plaques d’agar, mélanger 250 mL de milieu LB avec 750 mL de milieu de l’eau de mer artificielle directement après la stérilisation et de préparer les plaques.
    7. Pour un milieu liquide, mélanger 250 mL de milieu LB 750 ml de milieu de l’eau de mer artificielle soit directement après la stérilisation soit refroidi.
      Remarque : Le milieu de l’eau de mer artificielle peut devenir trouble par précipitation de sel.
  2. Ensemencer les souches bactériennes bioluminescents sur plaques de milieu gélosé eau mer artificiel et incuber une nuit à 24-30 ° C.
    NOTE : Stockage de Long temps de souches bactériennes est normalement obtenu grâce à des stocks de glycérol de la culture bactérienne de congélation. Les souches doivent toujours être striées sur milieu gélosé tout d’abord à assurer des conditions de départ uniformes pour toutes les souches, avant son utilisation pour les cultures en milieu liquide, en raison d’une phase de latence en croissance après décongélation.
  3. Préparer une ONC en inoculant milieu d’eau de mer artificielle de 100 mL avec une seule colonie de la plaque. Incuber l’ONC à 24-30 ° C et 120 tr/min dans un shaker incubateur jusqu’au lendemain.
  4. Inoculer 800 mL du milieu de l’eau de mer artificielle avec 8 mL d’ONC.
  5. Incuber les cellules bactériennes à 24-30 ° C et 120 tr/min dans un shaker incubateur.
    NOTE : Le profil de l’intensité lumineuse des bactéries bioluminescentes varie fortement avec la température. Selon les mécanismes de régulation de la production de lumière de la souche bactérienne respectif, luminescence peut démarrer après environ 1-6 h.
  6. Observez la culture de cellules bactériennes jusqu'à ce qu’ils commencent à briller (environ 1-6 h).
    Remarque : Selon le but de l’expression, les cellules sont cultivées jusqu’au lendemain et sont ensuite récoltés, ou les cellules peuvent être gardés secouant tant qu’ils sont brillants. Les cellules et la purification de toutes les protéines de la récolte peut se faire conformément aux procédures standards.

4. analyse d’activité in Vivo pour les souches de bactéries bioluminescentes et mis à jour le e. coli souches

NOTE : Entreposage de longue date des souches est normalement acieved par congélation des stocks de glycérol de la culture bactérienne. Les souches doivent toujours être striées sur milieu gélosé tout d’abord à assurer des conditions de départ uniformes pour toutes les souches, avant son utilisation pour les cultures en milieu liquide, en raison d’une phase de latence en croissance après décongélation.

  1. Ensemencer la souche bactérienne bioluminescente désirée ou mis à jour le e. coli souche sur une gélose et incuber à 28 ° C jusqu’au lendemain.
    Remarque : La température d’incubation peut varier d’une souche à et doit être évaluée de manière empirique. Pour être en mesure de comparer des souches de bactéries bioluminescentes et mis à jour le souches d’e. coli , des conditions de croissance doivent être identiques.
  2. Ensemencer 3 mL de milieu avec la souche respectif avec une seule colonie d’une boîte de gélose et incuber les cellules à 28 ° C et 180 tr/min dans un shaker incubateur pendant environ 1-2 h.
  3. Mesurer la densité des cellules d’un 01:10 dilution de la culture liquide à 650 nm. Calculer le ratio et le volume de la culture de 1 mL avec une OD650 de 0,05.
    Remarque : Le dosage de lecteur de plaque ultérieure permettra de déterminer la densité des cellules à 650 nm pour éviter toute interférence de la luminescence des souches.
  4. Pipeter le volume calculé de la culture et de medium à une plaque de paroi noire 24 puits avec fond de verre. Pour la mis à jour l’e. coli souche, ajouter 1 µL de kanamycine (résistance aux antibiotique du vecteur pET28a) et 1 µL d’IPTG (induction de l’expression des gènes) pour les échantillons. Posez un couvercle sur la plaque pour éviter l’évaporation pendant les mesures.
    Remarque : Pour assurer que le vecteur de pET28a contenant l’opéron ensemble lux ne pas se perdre par la culture d’e. coli , kanamycine doit être ajouté à chaque échantillon d’e. coli dans les puits de la plaque et pour s’assurer que la production de lumière de l' e. coli les cellules peuvent être mesurés, l’expression du gène doit être induite par l’IPTG. Pour éviter toute interférence de diaphonie et de mesure, paroi noire des plaques puits avec fond de verre, couvercle transparent a montré les meilleurs résultats. Néanmoins, crosstalk peut être observée et des positions bien doivent être choisis avec soin.
  5. Démarrer la mesure à l’aide d’un lecteur.
    Remarque : Le protocole lecteur de plaque est basé sur un script développé spécialement pour ce test (voir Documents supplémentaires) qui combine deux mesures, absorbance et bioluminescence. Points de données sont recueillies toutes les 10 min avec agitation permanente entre les mesures et une température constante de 28 ° C.

Résultats

L’ordre des gènes de l’opéron lux - luxCDABFEG - est très conservée au cours de diverses souches2,5,14. Pour la conception du plasmide, l’information de la séquence provient de la souche de bactéries bioluminescente Photobacterium mandapamensis 27561 et son ordre de gène a été gardé la même et, également, des séquences non codantes entre gènes simples étaient considérés comme. Un aperçu schématique de la stratégie de clonage de Gibson appliquée est représenté à la Figure 2. Quatre fragments au total, luxCDAB, FL, luxEG et ribEBH, avec 20 à 40 paires de bases qui se chevauchent de séquences ont été générés. Après avoir suivi toutes les étapes de la Gibson Assemblée20, séquençage de l’ADN a confirmé le montage correct du plasmide, y compris tous les fragments. La carte vectorielle de l’assemblage final produit pET28a contenant l’opéron lux-côtes est représentée à la Figure 3. Un avantage important de ce vecteur mis à jour le pET28a est l’utilisation de normalisés selon les conditions de croissance d’e. coli et contrôlée induction avec IPTG.

Pour mesurer la luminescence de bactéries bioluminescentes et la densité des cellules respectives, a développé une méthode de lecteur de base de plaque. La méthode pour le lecteur de plaque a été générée en combinant des scripts de mesure unique pour la luminance lumineuse d’intensité et de la cellule. Ce nouveau script activé la mesure de l’OD650 et intensité de la lumière toutes les 10 min pour un utilisateur définit le laps de temps, qui doit être réglée à l’heure de génération des bactéries utilisées pour l’analyse respectif (par exemple, 10 h). La mesure de la densité optique a été réalisée à 650 nm pour éviter toute interférence avec l’émission de lumière. Comme une preuve de concept et d’assurer la santé et le comportement correct de la croissance des cellules e. coli , les mesures de référence ont été effectuées. Figure 4 la comparaison des cellules BL21 Escherichia coli , e. coli BL21 cellules contenant un vecteur vide pET28a et e. coli BL21 cellules contenant le vecteur pET28a avec l’opéron lux-côtes insert sont présentés. Pour la souche de ce dernier, aucune IPTG a été ajouté afin d’analyser l’émission de lumière due à la perméabilité du promoteur T7. Toutes les trois mesures de référence montrent une courbe de croissance sigmoïde avec trois phases de croissance (phase exponentielle et stationnaire de latente,). Seules les e. coli BL21 cellules contenant le vecteur pET28a avec le début d’insertion opéron lux-côtes à émettre de la lumière, mais à la différence des mesures où l’expression est induite par l’addition d’IPTG et la lumière est émise après 30 min, les cellules non induites par seulement commencer à briller après environ 5 h et montrer une émission de lumière beaucoup plus faible (env. 4 x) par rapport au système induit.

Figure 5 donne une comparaison des courbes de croissance et l’intensité lumineuse de l’opéron lux exprimée dans e. coli et la souche bactérienne bioluminescente mandapamensis P. 27561, soit dans le milieu LB, soit au moyen de l’eau de mer artificielle, utilisant le roman créé méthode in situ . Pour comparer ces bactéries, les mesures ont été effectuées à une température d’incubation de 28 ° C. Cette température diminue le taux de croissance de la mis à jour l’e. coli de souche dans le milieu LB ainsi que de moyen de l’eau de mer artificielle, mais pour des températures inférieures de souches de bactéries bioluminescentes est cruciales. Cette dépendance de la température n’est visible dans la Figure 5A, comme le P. mandapamensis 27561 montre une densité beaucoup plus élevée qu’e. coli. En outre, alors que pour les souches d’e. coli , milieu LB permet la génération des densités plus élevées de cellule, pour des souches de bactéries bioluminescentes naturels, moyen de l’eau de mer artificielle est privilégié et essentiel pour la bioluminescence. La densité des cellules enregistrées sont corrélés avec les intensités lumineuses respectives, comme illustré à la Figure 5B. Remarquable, la bioluminescence e. coli cellules portée semblable lumière maxima d’émission dans les deux milieu d’eau de mer artificielle mais aussi moyen LB, bien que les intensités plus élevées ont été enregistrées à des moments différents. Contrairement à cette observation, mandapamensis P. 27561 est viable avec des taux de croissance très réduit dans le milieu LB, mais les cellules bactériennes ne pas émettre de la lumière à tous (Figure 5B). Au moyen de l’eau de mer artificielle, mandapamensis P. 27561 présente un maximum d’émission de lumière à environ 1 x 104 impulsions par seconde, ce qui est un facteur de près de 200 inférieur à e. coli. Figure 5 C représente les unités relatives de lumière où la bioluminescence est normalisée par la Division d’opposition. Ces résultats confirment que, non seulement est l’insertion d’un plasmide contenant l’opéron lux dans e. coli réussi et fonctionnel, mais également que cette modification e. coli souche constitue une alternative valable avec émission de lumière encore plus élevée les rendements et sans la limitation de la bioluminescence bactérienne des bactéries de marina, comme une eau de mer complexe des températures moyennes et inférieures.

En outre, une mesure à long terme de l’expression des gènes lux-côtes du e. coli basée sur 24 heures a été effectuée pour analyser la longévité de l’émission de lumière (Figure 6). Luminescence a duré 19,5 h, beaucoup plus longue que les souches bactériennes (p. ex., P. mandapamensis 27561) où une diminution graduelle a été observée aboutissant à très faible émission de lumière après 10 h.

Pour illustrer les limites de l’analyse développée, la Figure 7 présente les résultats des mesures des trois souches de bactéries bioluminescentes, nommément Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 et Vibrio harveyi 14126. Pour la première souche (S1), la méthode fonctionne très bien et montre une intensité maximale de bioluminescence de près de 2 x 106. Pour l’autre les deux souches (TH1 et 14126), l’intensité lumineuse maximale ne peut pas être déterminée parce que l’intensité de la lumière générée par les deux dépassé la limite de détection des paramètres de l’instrument utilisé. La valeur de gain définie pour la méthode développée (script) pour ces deux souches est réglée trop haute. Néanmoins, le début de l’activité de la bioluminescence peut être comparé à l’autre. Mandapamensis P. TH1 et P. mandapamensis S1 commencent à briller après environ 1 h et une valeur de650 OD de 0,1 - 0,2, respectivement. En revanche, V. harveyi 14126 commence à émettre de la lumière après environ 5,5 h à une valeur de650 OD de 1.0. L’apparition observée de la luminescence est accompagnée d’une augmentation exponentielle des OD mais aussi bioluminescence. On sait que la bioluminescence de V. harveyi 14126 sous-tend quorum sensing règlement et donc spécifique à une cellule densité ce qui permet l’activation de l’opéron lux , qui peut être clairement vu dans la Figure 713. Ce résultat montre que, avec ce roman in situ , essai de lecteur de plaque il est possible de comparer facilement les bactéries bioluminescentes et aussi grossièrement définir un mécanisme de régulation de ces souches en déterminant si un quorum sensing règlement peut être observée ou non.

La figure 8 montre un exemple d’une culture de l’expression d’e. coli BL21 cellules contenant le plasmide pET28a assemblés contenant l’opéron lux après induction avec IPTG. Après environ 1 heure après l’induction, les cellules d’e. coli commencent, brillant avec une couleur bleu-vert. Figure 8 A montre l’expression e. coli culture photographié dans la lumière et Figure 8B donne la même culture dans l’obscurité. Figure 8 C représente une boîte de gélose du milieu eau de mer artificielle avec P. mandapamensis S1 brille dans l’obscurité dans la même caractéristique de couleur bleu-vert de bioluminescence bactérienne.

Schéma de flux de travail de Gibson Assembly : conception de l’amorce, concentration de l’ADN, transformation du plasmide, séquençage.
Figure 2 : Représentation schématique de la Gibson appliquée stratégie de clonage. Étape (I) : des amorces de chevauchement (flèches de couleur ; env. 20-40 paires de bases se chevauchent) sont conçus. Amorces superposées renfermant des séquences recuits consistant en la région 5' et 3' d’un fragment et la région 3' et 5' du segment adjacent. Étape (II) : Les fragments conçus pour l’assemblage sont générés par des réactions de PCR standards. Étape (III) : Le vecteur de la cible est linéarisé par digestion de restriction (par exemple, Ncol, XhoI). Étape (IV) : Les concentrations d’ADN de tous les fragments et le vecteur linéarisé doivent être déterminés à ajuster la concentration appropriée pour l’assemblage de Gibson (selon protocole du fabricant). Étape (V) : Tous les fragments et le vecteur linéarisé avec des concentrations d’ADN optimisées sont combinés avec Gibson Assemblée master mix (T5 exonucléase, ADN polymérase et DNA ligase) et sont incubés à 50 ° C pendant 1 h. étape (VI) : le produit de l’Assemblée se transforme conformément aux protocoles standards dans un approprié e. coli souche pour la réplication plasmidique à haut rendement (p. ex. e. coli TOP10 ou XL-1). Étape (VII) : Pour vérifier le montage correct du plasmide, séquençage de l’ADN du plasmide assemblé doit être exécuté. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

carte plasmidique de l’opéron lux, vecteur pET28a, expression génique, promoteur lac, diagramme d’ADN circulaire
Figure 3 : Vector map de pET28a contenant l’opéron lux-rib . L’opéron lux-côtes de mandapamensis P. 27561 est inséré dans le site multiple de clonage de pET28a dans l’ordre original des gènes (luxCDABFEG-ribEBH). Les sites de restriction utilisées pour le clonage sont Ncol et XhoI. Fragments utilisés pour l’assemblage de Gibson de l’opéron sont luxCDAB à orange, FL en vert, luxEG en bleu et ribEBH à la lavande ; gènes dans un fragment apparaissent comme une boîte séparée. Les séquences non codantes entre chaque gène de l’opéron sont inclus dans la stratégie de clonage appliquée. La taille finale de plasmide de pET28a contenant l’opéron ensemble lux-côtes est 14 625 paires de bases. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Courbe de croissance et graphique de bioluminescence BL21 ; DO et bioluminescence dans le temps ; l’expression génétique.
Figure 4 : Comparaison des courbes de croissance et des intensités lumineuses des souches de référence. La Division d’opposition à 650 nm et l’intensité de la bioluminescence en impulsions par seconde ont été mesurées toutes les 10 min sur une période de 10 h à 28 ° C. Toutes les mesures sont des valeurs moyennes de trois réplicats biologiques avec quatre répétitions techniques chaque. Barres d’erreur représentent des écarts-types. E. coli BL21 cellules (carrés gris), vecteur d’e. coli BL21 cellules contenant un pET28a vide (des cercles gris), et e. coli BL21 cellules contenant le vecteur pET28a avec l’insert d’opéron lux-côtes (diamant noir) ont été analysées à garantir le comportement correct de la croissance de nos cellules d’Escherichia coli . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Graphiques de croissance bactérienne et de bioluminescence ; E. coli vs P. mandapamensis dans les milieux LB et d’eau de mer.
Figure 5 : Comparaison des courbes de croissance et l’intensité lumineuse de l’opéron lux exprimée chez e. coli (carrés) et P. mandapamensis 27561 (cercles) en milieu LB (symboles ouverts) ou en milieu eau de mer artificielle (symboles remplis). Toutes les mesures sont des valeurs moyennes de trois réplicats biologiques avec quatre répétitions techniques chaque. Barres d’erreur représentent des écarts-types. Toutes les expériences ont été effectuées à une température d’incubation de 28 ° C. (A) mesures de densité (OD) d’optique à 650 nm ont été effectuées toutes les 10 min pour 10 h. expression d’e. coli lux operon (panneau de gauche) est comparé à mandapamensis P. 27561 (panneau de droite) dans le milieu de l’eau de mer moyenne et artificiel LB. La densité des cellules est déterminée à 650 nm pour éviter toute interférence de la bioluminescence. (B) mesure de l’intensité lumineuse (bioluminescence [comtes/s]) a été réalisée toutes les 10 min pour 10 h. expression d’e. coli lux operon (panneau de gauche) est comparé à mandapamensis P. 27561 (panneau de droite) dans des livres mer moyenne et artificielle milieu de l’eau. (C) lumière Relative intensités (RLU/OD) de l’opéron lux exprimée chez e. coli (panneau de gauche) et P. mandapamensis 27561 (panneau de droite) sont déterminées en normalisant la bioluminescence de la densité cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dynamique de croissance, bioluminescence, graphique RLU/OD ; Résultats expérimentaux au fil du temps en quelques minutes.
Figure 6 : Comparaison des courbes de croissance et des intensités lumineuses d’e. coli selon l’expression des gènes lux pendant 24 h. La Division d’opposition à 650 nm et l’intensité de la bioluminescence en impulsions par seconde ont été mesurées toutes les 10 min sur une période de 24 h à 28 ° C. Toutes les mesures sont des valeurs moyennes de trois réplicats biologiques avec quatre répétitions techniques chaque. Barres d’erreur représentent des écarts-types. En outre, les intensités lumineuses relatives (RLU/OD) où la bioluminescence est normalisé par la densité des cellules sont représentées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Courbe de croissance bactérienne et de luminescence ; densité optique, bioluminescence, RLU/OD en fonction de l’analyse du temps.
Figure 7 : Comparaison des bactéries bioluminescentes et évaluer le potentiel quorum sensing règlement. Émission de lumière et de la densité cellulaire sont mesurées toutes les 10 min pendant 10 h et représentent des valeurs moyennes des trois réplicats biologiques avec quatre répétitions techniques chaque. Barres d’erreur représentent des écarts-types. Mesures de Photobacterium mandapamensis TH1 (carrés noirs), Vibrio harveyi 14126 (des cercles gris) et Photobacterium mandapamensis S1 (diamants gris) ont été comparés entre eux ; (A) représente la densité optique (do) à 650 nm, (B) la lumière intensité (bioluminescence [comtes/s]) et (C) intensité lumineuse relative (RLU/OD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Résultats de l’éclat de la fermentation ; Culture bioluminescente en flacon, structure chimique d’émission verte.
Figure 8 : Bioluminescence en milieu liquide et sur milieu gélosé. (A) flacon de 5 L avec milieu LB 2 L inoculés avec e. coli BL21 cellules exprimant le plasmide d’opéron lux pET28a photographié dans la lumière. (B) la même culture que dans (A) photographiée dans l’obscurité. Photos A et B ont été prises à environ 2 h après l’induction de l’expression. (C) mer artificielle l’eau milieu gélosé plaque striée culture de P. mandapamensis S1 photographié dans l’obscurité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La construction d’un plasmide d’expression contenant quatre fragments composant l’opéron ensemble lux-côtes de mandapamensis P. 27561 a été effectuée par le biais de Gibson clonage. Cette expression de gène de e. coli basé lux permet aux cellules d’Escherichia coli à émettre de la lumière. Évitant le quorum sensing règlement et conditions de croissance non standard est des avantages importants de ce système.

Les avantages d’utiliser la stratégie de clonage de Gibson sont la facilité de montage de plusieurs fragments d’ADN linéaires, une grande flexibilité et aucun besoin de restriction spécifique sites18,19,20. Cette méthode permet de changer facilement un opéron lux , à l’exclusion des gènes simples ou groupes de gènes ou introduction de nouveaux gènes ou échanger des gènes d’une souche à l’autre. Une condition préalable à l’application de cette méthode est la disponibilité de séquence du gène de l’opéron respectifs lux . Uniquement pour un petit nombre de bactéries bioluminescentes est la séquence complète d’ADN de l’opéron respectifs lux connus et/ou disponible. Beaucoup de ces séquences sont fragmentées parce qu’elles ont été générées à l’aide de séquençage de fusil de chasse. Dans le cas de l' enquête mandapamensis P. 27561 la séquence complète d’ADN de l’opéron lux est connu et disponible à partir de la base de données de la génétique NCBI (GenBank : DQ988878.2).

Une étape critique dans le protocole de l’Assemblée de Gibson est le calcul de la concentration d’ADN de l’unique fragments. Dans le protocole de montage du fabricant il est recommandé d’utiliser 0,2 - 0,5 pmols et un volume total de 20 µL pour 4-6 fragments20,21. Dans notre cas, où les luxCDABFEG-ribEBH est composé de 4 fragments, les concentrations et volumes totaux étaient pmol 0.1 et 45 µL, respectivement, selon le rendement des produits de PCR. D’une part, la concentration doit être réduite et d’autre part, le volume a dû être augmentée. Néanmoins, l’Assemblée a très bien fonctionné, et le séquençage de l’ADN a confirmé l’insertion correcte lors de la première tentative. Cette constatation confirme Assemblée Gibson comme une méthode robuste et appropriée pour nos enquêtes, ce qui peut être facilement mis à jour le18,19,20.

L’essai de lecteur de plaque nouvellement créé est un facile à utiliser la méthode. Il permet une simple analyse primaire de nouveau ou (dé-) connu des souches de bactéries bioluminescentes et donne déjà un premier indice sur le mécanisme de régulation de la production de lumière (par exemple, le décalage en luminescence à faible densité). En outre, les conditions de croissance en combinaison avec la production légère facilement peuvent être évaluées qu’en changeant simplement le milieu de croissance ou de la température.

Il a effectué les mesures avec le lecteur de plaque à 28 ° C. La raison de ce décor insolite est la sensibilité à la température de souches de bactéries bioluminescentes, où des températures supérieures à 30 ° C avoir moins ou même pas croissance et/ou l’émission de lumière. Notez que le lecteur est capable de maintenir une température définie au fil du temps avec la limitation d’un manque de système de refroidissement actif. Par conséquent, la température ambiante doit être inférieure à la température de la mesure.

Comme une preuve de concept, la comparaison de la construction d’e. coli avec la souche bioluminescente P. mandapamensis (Figure 5) sur un côté et les mesures de référence (Figure 4) quant à eux ont été réalisés et confirmer la fiabilité de ce système nouvellement créé. En outre, la mesure à long terme assure la longévité de l’émission de lumière (Figure 6). Mais il faut considérer que les valeurs do ne sont pas fiables au-dessus d’une certaine densité optique, selon les caractéristiques de l’appareil de mesure utilisé (environ 15 h dans le cas présent) où une dilution appropriée serait nécessaire pour une mesure dans le gamme linéaire du détecteur. Ces écarts élevés en valeurs do faire ces mesures de longue date n’est pas fiable. Donc, des mesures plus courtes telles que 10 h sont recommandés en utilisant le montage expérimental signalées ici.

Limites de l’essai lecteur de plaque établie peuvent être vu à la Figure 7. La difficulté est de trouver un cadre approprié de la mesure. La valeur « gain » permet de régler la sensibilité du tube photo multiplicateur (PMT). Le gain est l’amplification du signal dans le PMT, ce qui signifie qu’un facteur de gain plus élevé va augmenter le signal. Si le gain est réglé trop bas, le rapport signal sur bruit devient plus grand et les intensités lumineuses des bactéries bioluminescentes brillants « faibles » ne peut pas être mesurée tout (signal plus proche de zéro, données non présentées). Le défi dans un test de bioluminescent est de régler le gain pour les résultats de mesure pour toutes les souches bactériennes restent à la portée de l’instrument. En outre, la gamme de mesure pour la luminescence dépend de l’intervalle de mesure (par exemple, maximum de 2 000 000 pour 1 s).

Le gain est réglé à 2800, qui a été empiriquement testé et choisi pour le lecteur de plaque spécifique utilisé pour la mise en place de cette méthode. Le réglage de gain utilisé permet l’enregistrement de maximum de la lumière émise par la bioluminescence système e. coli , mandapamensis P. 27561 et P. mandapamensis S1 sans un dépassement de capacité, mais pour les souches TH1 P. mandapamensis et V. harveyi 14126 le gain était trop élevé. Par conséquent, ces souches ce dernier dépassent la limite de détection et l’intensité lumineuse maximale réelle ne peut être mesurée. Cette limitation technique pourrait empêcher la comparaison des bactéries bioluminescentes, qui montrent de fortes variations dans l’émission de lumière maximale, bien que les conditions de croissance et la densité des cellules peut être comparable.

Positionnement des souches bactériennes analysées dans les plaques bien utilisés doit être évaluée empiriquement. Des plaques noires bien à fond de verre ont été utilisés, la diaphonie entre les échantillons a été observée. L’intensité lumineuse de certaines souches est si élevée, que tous les puits voisins feront preuve de fausses positifs émissions de lumière (par exemple, vide). Par conséquent, il est important de mesurer deux souches différentes, soit séparément, soit avec une certaine séparation spatiale les uns aux autres.

Il y a déjà beaucoup modifié des souches d’e. coli connues qui contiennent des éléments de l’opéron lux et sont principalement axés sur l’application15,16,17. Les méthodes décrites ici, viser la recherche fondamentale, par exemple la possibilité d’analyser chaque gène lux séparément. Bien que la recherche de la bioluminescence a une longue histoire, il existe encore de nombreuses questions en suspens. Par excluant ou introduire des gènes de l’opéron lux , échanger des gènes luxAB avec des gènes d’une autre souche ou analyser les protéines complexes, incorporés dans le facile à manipuler le système d’e. coli et plus loin l’application de la plaque test du lecteur, il serait possible d’obtenir plus d’informations sur le processus de réglementation et les fonctions des gènes lux .

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) pour son soutien dans l’établissement le script autonome écrit pour le lecteur. Ce travail a été soutenu par l’autrichien « Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung » (CÉF) de PM (P24189) et le programme doctoral « DK moléculaire enzymologie » (W901) à h.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de clonage d’assemblage d’ADN haute fidélité NEBuilderNew England Biolabs Inc.E2621Spour 10 rxn
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymérase  ;Thermo ScientificF530S
Q5 ADN polymérase haute fidélitéNew England Biolabs Inc.M0491S
GeneJet Kit de purification de l’ADN génomiqueThermo ScientificK0721pour enzymes
de restriction et tampon 50 rxn (NcoI, XhoI)New England Biolabs Inc.R3193S/R0146S
Wizard SV Kit de nettoyage gel et PCR  ;PromegaA9282pour 250 rxn
Monarch Kit d’extraction de gel d’ADN  ;New England Biolabs Inc.#T1020Spour 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit  ;Thermo ScientificK0503pour 250 rxn
GoTaq G2 DNA polymérasePromegaM7841
24 puits noir sensoplate avec fond en verreGreiner Bio One662892
FLUOStar Omega lecteur de plaques  ;BMG Labtech
OPTIMA/Mars Logiciel d’analyseBMG LabtechVersion 2.20
Microsoft Excel 2010Microsoft
Multitron Standard Incubator ShakerInfors AG

Références

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Mots-clés

Op ron luxexpression chez E coliconstruction de plasmideinduction l IPTGeau de mer artificiellemesure de la densit cellulaireanalyse de l mission lumineuseessai au lecteur de plaquesd tection du quorum

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