Article de méthode

PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

DOI :

10.3791/57950

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3 juillet 2018

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1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

Dans cet article

Résumé

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Les microARN circulants ont montré prometteur comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires et d’infarctus du myocarde aigus. Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole pour l’extraction de miRNA, transcription inverse et ACP numérique pour la quantification absolue des miARN dans le sérum des patients atteints de maladies cardiovasculaires.

Résumé

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Circulants sérum microARN (miARN) ont montré prometteur comme biomarqueurs pour les maladies cardiovasculaires et infarctus aigu du myocarde (IAM), étant libérée des cellules cardiovasculaires dans la circulation. MiARN circulants est très stables et peut être quantifiées. L’expression quantitative des miARN spécifiques peut être liée à la pathologie et certains miARN Voir la haute tissu et la spécificité de la maladie. Trouver de nouveaux biomarqueurs des maladies cardiovasculaires est d’importance pour la recherche médicale. Tout récemment, réaction en chaîne de polymérase numérique (dPCR) a été inventée. dPCR, combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse, permet une quantification absolue directe spécifique. dPCR présente des qualités techniques supérieures, y compris une faible variabilité, une linéarité élevée et une sensibilité élevée par rapport à la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). DPCR est donc une méthode plus précise et reproductible pour quantifier directement les miARN, particulièrement pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons comment effectuer efficacement numérique PCR afin d’évaluer le nombre de copies absolue dans le sérum.

Introduction

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MiARN circulants ont été identifiés comme marqueurs prometteurs pour un certain nombre de maladies, y compris les maladies cardiovasculaires,1. Les miARN est petites, de molécules d’ARN simple brin non codant (environ 22 nucléotides de long) sont impliqués dans la post-transcriptionnelle via la modification de la traduction de l’ARN messager et l’expression de gène influençant2, et sont libérés dans la circulation dans les États physiologiques et pathologiques. L’expression quantitative des miARN spécifique peut être liée à la pathologie, et certains miARN montre tissu haut et spécificité de la maladie

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Protocole

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1. extraction de miRNA du Plasma/sérum

Remarque : Afin de quantifier adéquatement les miARN, l’isolement de microARN correcte du plasma/sérum est une étape cruciale. Un essentiel de garder à l’esprit, surtout parce qu’il existe des protocoles différents, est d’adhérer au même flux de travail lors du traitement des échantillons. Dans ce protocole, miRNA est extrait de 50 µL de sérum. Ne pas utiliser plus de 200 µL comme cette limite le processus d’extraction correcte.

  1. Préparer le sérum ou décongeler les échantillons congelés.
  2. Ajouter 250 µL (5 volumes) de réactif de lyse commerciale à 50 µL de sérum. Soutenir la lyse au v....

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Résultats

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PCR numérique combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse permet aux chercheurs de quantifier directement les quantités absolues des miARN spécifique en copies/µL. Comme l’échantillon en dPCR est partitionnée en environ 20 000 réactions individuelles de PCR, dPCR ne nécessite pas de technique réplique10. Le système dPCR utilise une analyse statistique mathématique de Poisson des signaux fluorescents (différant entre les réactions positives et négatives) qui per.......

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Discussion

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PCR numérique est une méthode relativement nouvelle butée de PCR qui permet la quantification absolue directe d’acides nucléiques dans un échantillon. La méthode possède des avantages particuliers, notamment une diminution de la variabilité, une reproductibilité quotidienne accrue et une sensibilité supérieure11,12. En outre, en raison de la répartition de l’échantillon dans environ 20 000 réactions simples et des analyses de point de terminaison, dPCR est plus r.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs n’ont aucuns accusés de réception.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forte
miRNkit Sérum/Plasma facile (50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland217184Kit pour l’extraction de microARN. Le kit contient un tampon RWT commercial (appelé numéro un dans le manuscrit)  ; et RPE (appelé numéro deux dans le manuscrit).
miRNeasy Sérum/Plasma Spike-in-Control ; miARN Syn-cel-miR-39 ; 10pmolQiagen-Échantillon & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610Spike-in pour la normalisation , Séquence : 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Transcription Kit (1000 Reactions)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4366597Kit pour la transcription inverse des microARN
TaqMan MicroRNA Assays MApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Dosages utilisés en transcription inverse
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 000200
Plaque PCR, 96 puits, segmenté, semi-jupeThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAAB0900 Plaque96 puits pour transcription inverse
Microseal ' B’ seal SealsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-UnisMSB1001Feuille pour assurer un stockage approprié
C1000 Touch ThermalCycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1851196Cycler utilisé pour la transcription inverse
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5pIntegrated DNA TechnologiesCustomSéquence : 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix pour sondes (sans dUTP)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863024Supermix utilisé dans la génération de gouttelettes
TaqMan MicroRNA AssaysApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Assays used in digital PCR (sonde d’hydrolyse fluorescente)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 001352, amorces commerciales
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 000200, amorces commerciales
DG8 Cartouches et jointsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-UnisLa cartouche 1864007prend jusqu’à 8 échantillons pour la génération de gouttelettes
La cartouche DG8 SupportBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863051Contient des cartouches dans la génération de gouttelettes
Huile de génération de gouttelettes pour sondesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863005Huile utilisée dans la génération de gouttelettes
ddPCR Plaques à 96 puitsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis12001925Plaque à 96 puits pour ddPCR
Plaque Thermoscellable, feuille, perçableBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1814040Feuille perçable, compatible avec le lecteur de gouttelettes
ddPCR Huile de lecteur de gouttelettesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863004Huile utilisée dans la lecture de gouttelettes
Générateur de gouttelettes QX100 ou QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863002Générateur de gouttelettes, génère les gouttelettes à partir de l’émulsion d’échantillon/huile
PX1 PCR Scelleuse de plaquesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1814000Scelle la plaque avant la PCR
C1000 Thermocycleur tactileBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1851196Cycleur utilisé pour le lecteur de gouttelettes ddPCR
QX100 ou QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863003Lecture des gouttelettes PCR positives et PCR négatives à l’aide d’un détecteur optique
Contrôle tampon ddPCR pour sondesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863052Contrôle des blancs  ; et pour remplir les puits restants de cassettes à 8 puits
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864011Programme de lecture de gouttelettes
Prism Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USAProgramme d’analyse statistique
à

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al.

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Mots-clés

Quantification des micro ARNformation de gouttelettestranscription inversechantillons de s rumsondes d hydrolyse fluorescentesquantification absolue

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