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Article de méthode

PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

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DOI :

10.3791/57950

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3 juillet 2018

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1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

Dans cet article

Résumé

Les microARN circulants ont montré prometteur comme biomarqueurs des maladies cardiovasculaires et d’infarctus du myocarde aigus. Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole pour l’extraction de miRNA, transcription inverse et ACP numérique pour la quantification absolue des miARN dans le sérum des patients atteints de maladies cardiovasculaires.

Résumé

Circulants sérum microARN (miARN) ont montré prometteur comme biomarqueurs pour les maladies cardiovasculaires et infarctus aigu du myocarde (IAM), étant libérée des cellules cardiovasculaires dans la circulation. MiARN circulants est très stables et peut être quantifiées. L’expression quantitative des miARN spécifiques peut être liée à la pathologie et certains miARN Voir la haute tissu et la spécificité de la maladie. Trouver de nouveaux biomarqueurs des maladies cardiovasculaires est d’importance pour la recherche médicale. Tout récemment, réaction en chaîne de polymérase numérique (dPCR) a été inventée. dPCR, combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse, permet une quantification absolue directe spécifique. dPCR présente des qualités techniques supérieures, y compris une faible variabilité, une linéarité élevée et une sensibilité élevée par rapport à la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). DPCR est donc une méthode plus précise et reproductible pour quantifier directement les miARN, particulièrement pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons comment effectuer efficacement numérique PCR afin d’évaluer le nombre de copies absolue dans le sérum.

Introduction

MiARN circulants ont été identifiés comme marqueurs prometteurs pour un certain nombre de maladies, y compris les maladies cardiovasculaires,1. Les miARN est petites, de molécules d’ARN simple brin non codant (environ 22 nucléotides de long) sont impliqués dans la post-transcriptionnelle via la modification de la traduction de l’ARN messager et l’expression de gène influençant2, et sont libérés dans la circulation dans les États physiologiques et pathologiques. L’expression quantitative des miARN spécifique peut être liée à la pathologie, et certains miARN montre tissu haut et spécificité de la maladie1. Dans les maladies cardiovasculaires, miARN est devenus candidats attrayants comme nouveaux biomarqueurs parce qu’ils sont remarquablement stables dans le sérum et peuvent facilement être quantifiées à l’aide de la PCR méthodologie3. La valeur potentielle des miARN comme biomarqueurs pour infarctus du myocarde a été évaluée dans des études de petites envergure, mais une validation dans des cohortes manque2. Par exemple, miR-499 se trouve fortement exprimée dans le muscle myocardique, et il s’est avéré être une augmentation significative chez un AMI4,5,6. En outre, il réglemente programmé la mort cellulaire (apoptose) et la différenciation des cardiomyocytes et participe ainsi à plusieurs mécanismes suivant un AMI7. Mis à part quelques petites études rapports une supériorité et une valeur incrémentielle des miARN pour le diagnostic de l’AMI, la supériorité ou l’égalité à haute sensibilité troponines cardiaques n'a pas encore été prouvée dans des études à grande échelle2,5 ,6,8. Plusieurs études prospectives dans des cohortes sont, par conséquent, nécessaires pour évaluer la valeur diagnostique potentielle des miARN. En outre, méthodes de quantification de miRNA doivent être optimisées et9des protocoles normalisés utilisant comparables. Essais normalisés peuvent réduire des résultats incohérents et peuvent aider les miARN pour devenir des biomarqueurs potentiels pour l’application clinique de routine, comme biomarqueurs doivent être quantifiés de manière reproductible pour assurer leur application clinique.

Récemment, dPCR a été présenté comme une analyse de point final. Il répartit l’échantillon dans environ 20 000 réactions individuelles10. Le système dPCR utilise ensuite une Poisson statistique analyse mathématique des signaux fluorescents (réactions positives et négatives), ce qui permet une quantification absolue sans une courbe standard10. Pour combiner dPCR avec sondes fluorescentes hydrolyse, la quantification absolue directe hautement spécifique des miARN est rendue possible. Réaction en chaîne de polymérase numérique a démontré que présentent des qualités techniques supérieures (y compris une variabilité réduite, une reproductibilité quotidienne accrue, un haut degré de linéarité et une sensibilité élevée) pour quantifier les niveaux de miRNA dans le circulation par rapport à quantitative en temps réel PCR10,11. Ces qualités techniques supérieures pourraient aider à atténuer les limites en vigueur sur l’utilisation des miARN circulant comme biomarqueurs et pourraient mener à l’établissement des miARN comme biomarqueurs dans grands multi-centres les essais cliniques cardiovasculaires et comme une méthode de diagnostic en en général. Dans une étude précédente, nous avons récemment appliqué dPCR pour la quantification absolue des miARN chez les patients avec une AMI en circulation et ont pu démontrer le potentiel de diagnostique supérieure par rapport à la quantification des miARN de qPCR12.

Dans cette publication, nous voulons démontrer que l’utilisation dPCR est une méthode précise et reproductible pour quantifier directement miARN cardiovasculaire en circulation. La quantification absolue de miRNA niveaux dans le sérum par PCR digital, montre potentielle pour l’utilisation lors d’essais cliniques cardiovasculaires de grandes multi-center. Dans cette publication, nous décrivons en détail comment effectuer efficacement PCR numérique et comment détecter le nombre de copies de miRNA absolue dans le sérum.

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Protocole

1. extraction de miRNA du Plasma/sérum

Remarque : Afin de quantifier adéquatement les miARN, l’isolement de microARN correcte du plasma/sérum est une étape cruciale. Un essentiel de garder à l’esprit, surtout parce qu’il existe des protocoles différents, est d’adhérer au même flux de travail lors du traitement des échantillons. Dans ce protocole, miRNA est extrait de 50 µL de sérum. Ne pas utiliser plus de 200 µL comme cette limite le processus d’extraction correcte.

  1. Préparer le sérum ou décongeler les échantillons congelés.
  2. Ajouter 250 µL (5 volumes) de réactif de lyse commerciale à 50 µL de sérum. Soutenir la lyse au vortex. Placer le tube avec le lysat sur le banc à température ambiante pendant 5 min.
  3. Doper le lysat 3,5 µl de contrôle spike (1.6 x 107 copies/µL) et les mélanger au vortex.
  4. Ajouter 50 µL de chloroforme (c'est-à-dire, une quantité égale à l’échantillon de sérum départ) pour la séparation de phase. Agiter vigoureusement le tube pour 15 s. Place le tube sur le banc à température ambiante pendant 2-3 min.
  5. Pour la séparation de phase, centrifuger le tube à 12 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes.
    Remarque : Les échantillons sont maintenant séparés en phase aqueuse supérieure contenant l’ARN, une interphase blanc et une phase organique inférieure, rose.
  6. Transférer la phase aqueuse supérieure (100 µL) contenant l’ARN dans un nouveau tube. Ne transférez pas n’importe quel matériel interphase blanc comme cela falsifie le nombre correct de RNA.
  7. Ajouter 150 µL (c'est-à-dire1,5 fois le volume de l’échantillon transféré) d’éthanol à 100 %. Les matériaux de la composition de leur pipetage de haut en bas. Ne pas centrifuger à eux et rapidement passer à l’étape suivante.
  8. Distribuer 250 µL de l’échantillon sur une colonne commerciale dans un tube de prélèvement de 2 mL. Fermer le couvercle. Centrifuger la colonne > 8 000 x g à température ambiante pendant 15 s. jeter le cheminement.
  9. Ajouter 700 µL de numéro de tampon de lavage commercial 1 dans la colonne. Fermer le couvercle et centrifuger la colonne > 8 000 x g à température ambiante pendant 15 s. jeter le tampon de lavage des trains directs.
  10. Ajouter 500 µL de numéro de tampon de lavage commercial 2 à la colonne. Fermer le couvercle et centrifuger la colonne > 8, 000 x g à température ambiante pendant 15 s. jeter le tampon de lavage des trains directs.
  11. Pipeter 500 µL d’éthanol à 80 % pour la colonne. Fermez le couvercle, centrifuger la colonne > 8, 000 x g à température ambiante pendant 2 min. jetez le tube de prélèvement avec le cheminement.
  12. Transférer la colonne vers un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Centrifuger la colonne à pleine vitesse avec un couvercle ouvert pour sécher la membrane. Jeter le tube de prélèvement avec le cheminement.
  13. Transférer la colonne de spin dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 mL. Éluer l’ARN en appliquer 30 µL d’eau exempte de RNase directement au centre de la membrane. Fermer le couvercle. Centrifuger la colonne à pleine vitesse pendant 1 min.
  14. Magasin l’ARN à-70 ° C.
    Remarque : Le stockage de l’ARN purifié dans l’eau sans RNase entre-70 ° C à-20 ° C ne garantit aucune dégradation de l’ARN pendant 1 an. Suite de protocole du fabricant, la quantité minimale d’eau exempte de RNase pour diluer l’ARN est de 10 µL. à l’aide de moins de 10 µL peut pas suffisamment hydrater la membrane et réduire le rendement total de RNA.

2. Transcription inverse

Remarque : L’ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé en utilisant le protocole suivant de la transcription inverse (RT) 15 µL (volume de réaction totale).

  1. Décongeler le kit RT sur la glace. Garder les enzymes dans le congélateur le plus longtemps possible d’empêcher leur dégradants et leur spin down avant utilisation. Décongeler les amorces RT sur la glace et leur spin down avant utilisation.
  2. Préparer le mélange maître tel que décrit dans le tableau 1.
  3. Mélanger 10 µL du mélange maître et 5 µL de l’ARN extrait par puits dans une plaque 96 puits.
  4. Centrifuger la plaque bien à 2 000 x g à 4 ° C pendant 2 min.
  5. Utiliser le protocole de cycle thermique décrit dans le tableau 2 pour la transcriptase inverse.
    Remarque : Comme décrit ci-dessous, cDNA peut-être directement être traité dans la machine de PCR numérique (voir Table des matières) ; Alternativement, il peut être conservé à-20 ° C.

3. droplet Generation et PCR numérique

Remarque : Digital PCR a été réalisée en utilisant le protocole suivant de 40 µL.

  1. Décongeler le mélange commercial dPCR, l’ADNc préparé et les amorces PCR sur la glace. Centrifuger à eux peu avant son utilisation.
  2. Préparer le mélange maître comme décrit dans tableau 3.
  3. Ajouter 1,33 μL/puits du produit RT et il centrifuger brièvement.
  4. Pipeter 20 μl de l’échantillon dans chaque puits de la cassette de 8 puits (rangée du milieu).
    Remarque : Si la cassette de 8 puits n’est pas complètement remplie, remplir les puits restants avec contrôles sans modèle (NTCs) omettent d’ADNc (c'est-à-direle produit de RT fabriqué avec de l’eau au lieu de RNA extraction) ou dPCR tampon commercial. Le CNT est un contrôle de la contamination. Eau ne doit pas être utilisée dans les puits restants, car qui nuira à la qualité de la formation de gouttelettes.
  5. Pipetter 70 μL de l’huile goutte de génération des sondes dans les puits de pétrole (rangée du bas) de la cassette de 8 puits.
  6. Placer un joint d’étanchéité sur le dessus de la cassette de 8 puits et placez la cassette dans le générateur de gouttelettes. Fermer le générateur de gouttelettes. Attendez que les 3 voyants sont vert fixe.
    Remarque : Gouttelettes sont maintenant générés.
  7. Soigneusement et lentement transfert 40 μl de l’échantillon formé de gouttelettes (rangée du haut) dans les puits séparés d’une plaque de 96 puits en pipettant également.
  8. À l’issue de la formation de gouttelettes sur les échantillons, sceller la plaque PCR avec une feuille de dPCR perçable à 180 ° C pendant 4 s.
  9. Placer la PCR-plaque aluminium scellées dans le cycleur et il cycle tel que décrit dans le tableau 4, à une vitesse de montée de 2.5 ° C/s.

4. gouttelette lecture et analyse

  1. Transférez la plaque le thermocycleur jusqu'à la base du support de la plaque. Serrer la plaque PCR en plaçant le haut du support de plaque sur la plaque de la PCR.
  2. Démarrez le logiciel commercial dPCR.
  3. Entrez le nom de l’échantillon, le nom de l’expérience et la cible dans la configuration. Sélectionnez la quantification absolue.
  4. Commencer la gouttelette lecture en cliquant sur exécuter. Sélectionnez FAM/HEX ou FAM/VIC comme chimie détection lorsque vous travaillez avec des sondes d’hydrolyse.
    Remarque : Le logiciel commercial dPCR va alors auto-analyser les données.
  5. Vérifier les numéros de gouttelettes dans le tableau de résultats afin d’assurer une génération de gouttelettes correct.
  6. Sélectionnez tous les puits avec le même miRNA quantifié et cliquez sur ANALYZE. La tache 2D permet de marquer les gouttelettes positives et corriger manuellement les données d’analyse automatique (Figure 1).

5. corriger les calculs sur l’échantillon

  1. Normaliser l’échantillon en multipliant l’échantillon par le facteur de normalisation (NF).
    NF = médiane [c. elegans miR-39 mesures]tous les échantillons/ [c. elegans miR-39]échantillon donné
  2. Calculer la concentration sérique de miRNA final, ajustement pour les facteurs de dilution (DF).
    [miRNA] finale = [miRNA]valeur brute x DF,RT , x DFdPCR x DFEx
    Où :
    [miRNA] valeur brute = la miRNA quantifié par dPCR commercial software ;
    DFRT = le facteur de dilution du modèle dans la transcription inverse ;
    DFdPCR = le facteur de dilution du modèle dans dPCR ;
    DFEx = le facteur de dilution dans l’extraction.

6. synthèse d’oligonucléotide Dilution série

  1. Dégelez lyophilisée oligonucléotide synthétique sur la glace. Brièvement, centrifuger il.
  2. Diluer l’oligonucléotide synthétique lyophilisé dans une eau exempte de nucléase à une concentration finale de 10 pmol / µL. brièvement centrifuger il.
  3. Le diluer dans de l’eau exempte de nucléase tel que décrit dans le tableau 5. Centrifuger la dilution brièvement entre chaque étape de dilution à 8 000 x g pendant 10 s.
  4. Poursuivez la transcriptase inverse, tel que décrit à l’étape 2 et analyser les échantillons avec PCR numérique tel que décrit dans les étapes 3 et 4.

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Résultats

PCR numérique combiné avec les sondes fluorescentes hydrolyse permet aux chercheurs de quantifier directement les quantités absolues des miARN spécifique en copies/µL. Comme l’échantillon en dPCR est partitionnée en environ 20 000 réactions individuelles de PCR, dPCR ne nécessite pas de technique réplique10. Le système dPCR utilise une analyse statistique mathématique de Poisson des signaux fluorescents (différant entre les réactions positives et négatives) qui per...

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Discussion

PCR numérique est une méthode relativement nouvelle butée de PCR qui permet la quantification absolue directe d’acides nucléiques dans un échantillon. La méthode possède des avantages particuliers, notamment une diminution de la variabilité, une reproductibilité quotidienne accrue et une sensibilité supérieure11,12. En outre, en raison de la répartition de l’échantillon dans environ 20 000 réactions simples et des analyses de point de terminaison, dPCR est plus r...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs n’ont aucuns accusés de réception.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forte
miRNkit Sérum/Plasma facile (50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland217184Kit pour l’extraction de microARN. Le kit contient un tampon RWT commercial (appelé numéro un dans le manuscrit)  ; et RPE (appelé numéro deux dans le manuscrit).
miRNeasy Sérum/Plasma Spike-in-Control ; miARN Syn-cel-miR-39 ; 10pmolQiagen-Échantillon & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610Spike-in pour la normalisation , Séquence : 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Transcription Kit (1000 Reactions)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4366597Kit pour la transcription inverse des microARN
TaqMan MicroRNA Assays MApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Dosages utilisés en transcription inverse
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 000200
Plaque PCR, 96 puits, segmenté, semi-jupeThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAAB0900 Plaque96 puits pour transcription inverse
Microseal ' B’ seal SealsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-UnisMSB1001Feuille pour assurer un stockage approprié
C1000 Touch ThermalCycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1851196Cycler utilisé pour la transcription inverse
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5pIntegrated DNA TechnologiesCustomSéquence : 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix pour sondes (sans dUTP)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863024Supermix utilisé dans la génération de gouttelettes
TaqMan MicroRNA AssaysApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Assays used in digital PCR (sonde d’hydrolyse fluorescente)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 001352, amorces commerciales
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, États-Unis4440887Numéro de dosage 000200, amorces commerciales
DG8 Cartouches et jointsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-UnisLa cartouche 1864007prend jusqu’à 8 échantillons pour la génération de gouttelettes
La cartouche DG8 SupportBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863051Contient des cartouches dans la génération de gouttelettes
Huile de génération de gouttelettes pour sondesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863005Huile utilisée dans la génération de gouttelettes
ddPCR Plaques à 96 puitsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis12001925Plaque à 96 puits pour ddPCR
Plaque Thermoscellable, feuille, perçableBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1814040Feuille perçable, compatible avec le lecteur de gouttelettes
ddPCR Huile de lecteur de gouttelettesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863004Huile utilisée dans la lecture de gouttelettes
Générateur de gouttelettes QX100 ou QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863002Générateur de gouttelettes, génère les gouttelettes à partir de l’émulsion d’échantillon/huile
PX1 PCR Scelleuse de plaquesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1814000Scelle la plaque avant la PCR
C1000 Thermocycleur tactileBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1851196Cycleur utilisé pour le lecteur de gouttelettes ddPCR
QX100 ou QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863003Lecture des gouttelettes PCR positives et PCR négatives à l’aide d’un détecteur optique
Contrôle tampon ddPCR pour sondesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis1863052Contrôle des blancs  ; et pour remplir les puits restants de cassettes à 8 puits
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864011Programme de lecture de gouttelettes
Prism Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USAProgramme d’analyse statistique
à

Références

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