Isolement des Cardiomyocytes auriculaires d’un modèle de Rat de métaboliques liées Syndrome une insuffisance cardiaque avec Fraction d’éjection préservée

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des cardiomyocytes auriculaires cellule unique d’un modèle de rat de métabolique associés au syndrome d’une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée. Une régulation manuelle de la pression intraluminale des cavités cardiaques est mis en œuvre pour produire des myocytes fonctionnellement intactes adaptés aux études couplage excitation-contraction.

Résumé

Dans cet article, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des unicellulaires auriculaires cardiomyocytes (ACMs) d’un modèle de rat du syndrome métabolique (MetS)-liés à une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF). Augmente la prévalence de HFpEF axés sur les MetS et auriculaires cardiomyopathies associées de remodelage de l’auriculaire et fibrillation auriculaire sont cliniquement très pertinents comme transformant auriculaire est un facteur prédictif indépendant de mortalité. Des études avec des cardiomyocytes isolés unicellulaires sont fréquemment utilisés pour corroborer et compléter en vivo résultats. Raréfaction du vaisseau circulatoire et fibrose du tissu interstitiel constituent un facteur potentiellement limitatif pour l’isolement de cellule unique succès de ACMs de modèles animaux de cette maladie.

Nous avons abordé cette question en employant un dispositif capable de réguler manuellement la pression intraluminale des cavités cardiaques au cours de la procédure d’isolement, d’augmenter considérablement le rendement de l’ACMs morphologiquement et fonctionnellement intactes. Les cellules acquis peuvent être utilisés dans une variété de différentes expériences, telles que la culture cellulaire et l’imagerie fonctionnelle de Calcium (c.-à-d., couplage excitation-contraction).

Nous fournissons un protocole étape par étape, une liste de solutions optimisées, approfondies instructions pour préparer le matériel nécessaire et un guide de dépannage complet le chercheur. Bien que l’implémentation initiale de la procédure peut être assez difficile, une adaptation réussie permettra au lecteur d’effectuer des isolations de ACM state-of-the-art dans un modèle de rat de HFpEF MetS liés pour un large éventail d’expériences.

Introduction

MetS décrit un ensemble de facteurs de risque de maladies cardiovasculaires et le diabète type 2 et comprend une augmentation tension artérielle, dyslipidémie (originaire de triglycérides et réduit le cholestérol des lipoprotéines de haute densité), augmenté de jeûne glucose et l’obésité centrale¹. La prévalence dans le monde entier des MetS est estimée à 25 – 30 % et constante augmentation². HFpEF est un syndrome clinique hétérogène, souvent associé aux MetS. Le remodelage cardiaque au cours de la HFpEF et ses phases précédentes (c'est-à-dire, cardiopathie hypertensive) est également accompagné d’un remodelage ....

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvés par le Comité d’éthique local (TVA T0060/15 et T0003-15) et interprétés en accord avec les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Institute of Health, U.S.A.).

NOTE : Un organigramme simplifié de la procédure est illustré à la Figure 1.

1. arrangements préalables

1. Préparez les tampons selon le tableau 1.

Solution

PB....

Résultats

À 21 semaines d’âge, 60 à 90 % de l’ACMs viables (estimé comme décrit à l’étape 6.1), après la réadaptation calcium (étape 5.4 – 5,7), peuvent être isolé des rats obèses ZSF-1 par cette méthode (Figure 4 a). Chez le rat, ACMs sont caractérisés par un autre et plus phénotype hétérogène par rapport aux versions^24,25. Figure 4 b montre un ACM individuel avec membranes préser.......

Discussion

Ici, nous avons tout d’abord décrit un protocole pour l’isolement de l’ACMs cellule unique d’un modèle de rat de MetS liés HFpEF qui montre marqué auriculaire retouche²². La procédure est particulièrement difficile car l’excès de tissu graisseux peut faire la préparation chirurgicale, ainsi que la canulation de l’aorte, de plus en plus difficile. Le guide de dépannage fourni dans le tableau 2 adresses les questions les plus courantes de la technique d’isolation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ZSF-1 Rat obèse	Charles River Laboratories, Inc.		21 semaines
Ciseaux à iris fins	Fine Science Tools GmbH	14094-11
Ciseaux chirurgicaux	Fine Science Tools GmbH	14001-18
Micro pince à pansement (courbée, dentelée)	Aesculap, Inc.	BD312R
Pince à tissus (droite, 1 x 2 dents)	Aesculap, Inc.	BD537R
Pince à attacher (coudée)	Aesculap, Inc.	MA624R
Guillotine pour rongeurs et petits animaux	Kent Scientific Corp.	Chambre d’induction à faible coût DCAP
3.0 L	Kent Scientific Corp.	SOMNO-0730  ;
Ensemble d’infusion papillon ailé 21 g	Hospira, Inc.
Abbocath 16 G	Hospira, Inc.	0G7149702
Microlance Aiguille Hypodermique	Becton Dickinson GmbH	301300	modifier l’aiguille pour faire une canule
Braun Original Perfusor Seringue 50 ml	B. Braun Melsungen AG	8728810F
Braun Inject Solo Seringue 10 ml	B. Braun Melsungen AG	2057926
Beaker 50ml	Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)	21 106 17
Boîte de Pétri Duroplan (100 x 20 mm)	Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)	21 755 48
Suture Seraflex USP 3/0	SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG	IC208000
VWR Weigh Boats carrés jetables 100ml	VWR, Inc.	10803-148
			polystyrène
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich, Inc.	71380
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich, Inc.	P4504
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich, Inc.	P5379
Phosphate dibasique de sodium	Sigma-Aldrich, Inc.	S0876
Sulfate de magensium heptahydraté	Sigma-Aldrich, Inc.
Chlorure de magensium	Sigma-Aldrich, Inc.	M8266
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375
Taurine	Sigma-Aldrich, Inc.	T0625
Glucose	Sigma-Aldrich, Inc.	G7528
Monoxime de 2,3-butanedione	Sigma-Aldrich, Inc.	B0753
Solution de chlorure de calcium (1 M)	Sigma-Aldrich, Inc.	21115
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich, Inc.	A9647
Liberase	Roche (Sigma-Aldrich, Inc.)	LIBTM-RO
Heparin	Rotexmedica GmbH	3862357
Forene (Isoflurane)	Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG	10182054
Laminine de la membrane basale du sarcome murin Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich, Inc.	L2020
WillCo Plat à fond de verre 500µ ; l 0,005 mm	WillCo Wells B.V.	HBST-3522
Fluo4 AM	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)	F14201	5µ ; M pendant 20 minutes à RT
Di-8-ANNEPS	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)	D3167	10µ ; M pour 45 min à 37° ; C  ;
Mitotracker RED FM	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)	M22425	20nM pendant 30 min à 37° ; C
Récipient de réaction chemisé 500 ml	Gebr. Rettberg GmbH	107024414
Récipient de réaction chemisé 1000 ml	Gebr. Rettberg GmbH	107025414
Piège à bulles chemisé	Gebr. Rettberg GmbH	134720001
ED thermoplongeur	Julabo GmbH	9116000
Reglo Digital MS-2/6 pompe péristaltique	Ismatec (Cole-Parmer Gmbh)	ISM 831
Voltcraft Thermomètre 302 K/J	Conrad Electronic SE 030300546
Tubing
LSM 700 microscope	Carl Zeiss, Inc.
Logiciel d’imagerie ZEN 2.3	Carl Zeiss, Inc.	410135-1011-240  ;
Contrôleur de chauffage monocanal TC-324B	Warner Instruments, LLC	64-2400
Système de perfusion 8 canaux	Warner Instruments, LLC	64-0185
Chauffage en ligne multiligne 8 canaux	Warner Instruments, LLC	64-0105

181106101Surface en230391