Mesure sensible des Mitophagy par Flow Cytometry à l’aide de la fonction du pH Fluorescent journaliste mt-Keima

Résumé

Mitophagy, la dégradation sélective des mitochondries, a été impliquée dans l’homéostasie mitochondriale et est déréglementé dans diverses maladies humaines. Cependant, les méthodes expérimentales commodes pour mesurer l’activité de mitophagy sont très limitées. Ici, nous fournissons une analyse sensible pour mesurer l’activité mitophagy à l’aide de cytométrie en flux.

Résumé

Mitophagy est un processus d’élimination sélective des mitochondries endommagés ou inutiles à l’aide de machines de l’autophagie. Des liens étroits ont été trouvés entre mitophagy défectueux et diverses maladies humaines, y compris les maladies neurodégénératives, le cancer et les maladies métaboliques. En outre, des études récentes ont montré que mitophagy est impliqué dans les processus cellulaires normaux, tels que la différenciation et le développement. Cependant, le rôle précis des et des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les mitophagy nécessitent une étude plus approfondie. Par conséquent, il est essentiel d’élaborer une méthode robuste et pratique pour mesurer les changements dans l’activité mitophagy. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour évaluer quantitativement l’activité mitophagy par cytométrie de flux à l’aide de la protéine fluorescente axés sur les mitochondries Keima (mt-Keima). Ce dosage de cytométrie de flux peut analyser l’activité de mitophagy plus rapidement et plus sensible que les méthodes conventionnelles microscopie ou immunoblotting dotés. Ce protocole peut être appliqué pour analyser l’activité mitophagy dans divers types de cellules.

Introduction

Les mitochondries sont des organites qui sont essentiels pour la physiologie et la prolifération cellulaire. Les mitochondries sont chargés de générer plus de 80 % de l’approvisionnement en ATP par phosphorylation oxydative, et elles offrent aussi des intermédiaires métaboliques divers biosynthèse et métabolisme^1,2. En plus de leur rôle dans l’approvisionnement énergétique et le métabolisme, les mitochondries jouent un rôle central dans de nombreux autres processus importants, y compris génération de réactives de l’oxygène (DRO), la régulation de la mort cellulaire et intracellulaire Ca^{2 +} dynamique....

Protocole

1. génération de cellules HeLa exprimant mito-Keima (mt-Keima)

1. Préparation des lentivirus mt-Keima
   1. Recouvrir une boîte de Petri de 100 mm en ajoutant 2 mL de solution saline à 0,001 % poly-L-lysine/tamponnée au phosphate (PBS) et laisser reposer pendant 5 min à température ambiante.
   2. Enlever la solution de la poly-L-lysine à l’aide d’une pipette en verre reliée à un aspirateur et lavez la boîte de Petri en ajoutant 2 mL de solution 1 PBS x.
   3. Plaque de 1,5 x 10⁶ HEK293T cellules sur la culture revêtue plat avec 10 mL de DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine et culture les cell....

Résultats

Un exemple de l’analyse de cytométrie de flux de mitophagy induite par le CCCP dans les cellules HeLa-Parkin est illustré à la Figure 4. À l’aide de la méthode d’analyse de cytométrie en flux décrite ci-dessus, nous pouvons détecter une augmentation spectaculaire dans les cellules de mitophagic dans la porte « élevée ». Le pourcentage de cellules dans la « haute » porte a augmenté de plus de 10 fois par rapport aux cellules témoins non traitées (

Discussion

Nous présentons ici une méthode rapide et sensible pour cytométrie pour mesurer l’activité de la mitophagy cellulaire dans les cellules exprimant mt-Keima. Les cellules subissant un niveau élevé de mitophagy montrent une augmentation du rapport du PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitation. Ainsi, mitophagy activité peut être exprimée comme le pourcentage de cellules présentant un taux élevé de 561/405. Nous avons calculé le pourcentage de cellules dans la région de la « haute » porte sur un terrain de dot de PE-CF594.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FORTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
pénicilline/streptomycine	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM  ;	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientific	R0531
0.45 &mu ; m filtre seringue	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrène	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromycine	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml  ;
Cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazine (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
trypsine-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)