Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

Résumé

Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

Résumé

Cellules entérochromaffines (EC) dans l’épithélium de la gastro-intestinal (GI) constituent la plus grande population de cellules entéroendocrines. Comme les cellules sensorielles spécialisées, cellules EC sentiment stimuli luminales et convertissent en événements de libération de la sérotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Toutefois, l’électrophysiologie de ces cellules est mal comprise parce qu’ils sont difficiles à culture et à identifier. La méthode présentée dans ce document contours primaire EC des cultures cellulaires optimisés pour l’électrophysiologie cellulaire unique. Ce protocole utilise un reporter de la protéine fluorescente cyan transgéniques (CFP) pour identifier les cellules EC souris dans des cultures primaires mixtes, faire progresser la démarche pour obtenir des enregistrements de haute qualité d’électrophysiologie de germes entiers dans les modes de bride de tension et de courant.

Introduction

L’épithélium gastro-intestinal de (GI) est une communauté diversifiée composée de plusieurs types de cellules. Cellules entéroendocrines représentent environ 1 % de toutes les cellules épithéliales et les cellules entérochromaffines (EC) sont la population des cellules entéroendocrines plus grand¹. Des études récentes montrent qu’entéroendocrines² et^3,4 cellules EC sont électriquement excitables. Nous sommes intéressés par la compréhension primaire électrophysiologie cellulaire EC. Ainsi, le but de cette étude était d’établir les cultures primaires de cellules EC....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de la clinique Mayo. La partie de la culture de cellules primaires du présent protocole est basée sur des méthodes publiées antérieurement qui peuvent être référencés pour plus de détails¹⁰. Toutes les procédures expérimentales doivent être approuvés par le (IACUC), et toutes les expériences doivent être effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes.

1. préparation de la culture

1. Les médias.
   1. Préparation des milieux de culture complète ce ce....

Résultats

Cultures :
Des cellules épithéliales primaires murines fabriqués à partir d’un modèle transgénique de Tph1-CFP attachent à plats après 4 heures et sont prêts pour des expériences physiologiques entre 24 à 72 h. Lorsque les conditions de culture n’avaient pas été optimisées, la culture de cellules épithéliales se composait de grosses touffes, flottant des débris cellulaires et les membranes endommagées signal faible de PCP dans les cellules EC (Figu.......

Discussion

Bien comprendre la fonction des cellules EC requiert une méthode de culture primaire de haute qualité pour générer des cellules pour l’électrophysiologie de cellules entières. Les cultures primaires de l’épithélium de la GI ont toujours été difficiles en raison du faible taux de survie. Alléger ce facteur de confusion, la présente méthode rendements des cultures de cellules EC du singulier de l’intestin soit petite ou grande qui sont capables de survivre pendant plusieurs jours.

Nous avons tro.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de culture 100 mm x 15 mm	Corning (Falcon)	351029
Pipette de transfert	Fisherbrand	13-711-7M
Pipette sérologique 10 mL	Corning (Falcon)  ;
50 mL Conique	Corning (Falcon)  ;
15 mL Conique	Corning (Falcon)  ;
1 000 mL Pointes de pipette barrière	Thermo Scientific (Art)	2079E	Maintenir stériles
Plats à fond en verre	MatTek Corporation P35G-1.5-14-C		Garder stériles
Pince de micro-dissection - Pointes très fines et extra-longues	Outils scientifiques fins	SB12630M
ciseaux chirurgicaux-Sharp	Nasco	14002-14
Ciseaux de micro-dissection	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
; Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Utiliser des souris mâles ou femelles âgées de 4 à 7 semaines
Aiguilles de seringue non métalliques Microfil (calibre 34, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm « M » Film de laboratoire	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Seringue Dow Corning
6 mL avec embout Luer régulier	Seringue Monoject
3 mL avec embout Luer régulier	Monoject
Équipement d’électrophysiologie
	Amplifier Molecular Devices	Axopatch 200B
Système d’acquisition de données (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Conditionneur	de signalDispositifs moléculaires CyberAmp	320
	Logiciel Dispositifs moléculaires	pClamp 10.6

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