Article de méthode

Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète

DOI :

10.3791/58117

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24 août 2018

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15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cultivant Caenorhabditis elegans (c. elegans) de façon à grande échelle sur des plaques de gélose peut être long et difficile. Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteuse pour obtenir un grand nombre d’animaux pour l’isolement des protéines de procéder à de nouvelles analyses protéomique, spectrométrie de masse ou une tache occidentale. Par ailleurs, une augmentation de nombre de nématodes pour immunostainings et l’intégration des analyses multiples dans les mêmes conditions de culture peuvent être facilement réalisées. En outre, un transfert entre plaques avec différentes conditions expérimentales est facilité. Les techniques courantes dans la culture de la plaque à la cession d’un seul c. elegans en utilisant un fil de platine et le transfert de gélose peuplée en morceaux à l’aide d’un scalpel. Cependant, avec l’augmentation du nombre de nématodes, ces techniques deviennent trop longues. Ce protocole décrit la culture à grande échelle c. elegans incluant de nombreuses mesures pour minimiser l’impact de la préparation de l’échantillon sur la physiologie du ver. Fluide et contrainte de cisaillement peuvent modifier la durée de vie et les processus métaboliques chez c. elegans, ce qui nécessite une description détaillée des étapes critiques afin de récupérer des résultats fiables et reproductibles. C. elegans est un organisme modèle, consistant en des cellules neuronales jusqu'à un tiers, mais n’ayant pas de vaisseaux sanguins, permettant ainsi la possibilité d’étudier uniquement des altérations neuronales indépendantes contrôle vasculaire. Récemment, début neurodégénérescence dans la rétinopathie diabétique a été trouvé avant des altérations vasculaires. Ainsi, c. elegans est d’un intérêt particulier pour l’étude des mécanismes généraux des complications du diabète. Par exemple, une formation accrue d’advanced glycation produits (Age) et les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont observée, que l'on retrouve de façon reproductible chez c. elegans. Protocoles pour gérer les échantillons de taille suffisante pour un plus large éventail d’enquêtes sont présentées ici, illustré par l’étude des altérations biochimiques induites par le diabète. En général, le présent protocole peut être utile pour les études nécessitant une grande c. elegans numéros et dans quelle culture liquide ne convient pas.

Introduction

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Les analyses de protéines, comme une tache occidentale ou la spectrométrie de masse, nécessitent milligrammes de protéines. Ce rendement nécessite une culture à grande échelle de centaines c. elegans, qui peut être accompli par la culture liquide ou sur des milieux solides, transférant les nématodes par lavage. Fluide et contrainte de cisaillement induit l’expression des canaux sodium épithélial (ENaC), ce qui pourrait augmenter le stress osmotique à travers une augmentation de l’absorption de sodium, potentiellement modifier la durée de vie de c. elegans et affectant les analyses métaboliques1 . Par conséquent, certaines étapes critiques dans le présent protocole pour l’approche axée sur la plaque prennent la réduction du stress affectant la variabilité expérimentale en compte. Milieu de culture liquide, d’autre part, influe sur le phénotype des nématodes et complique la culture et la collection d’un nombre exact de nématodes2. En outre, substances réactives peuvent être modifiés par les composants de médias et peuvent distribuer inégalement avant d’atteindre les nématodes. Relatives aux limitations de culture liquide, ce protocole prévoit une approche alternative à la culture des échantillons à grande échelle de c. elegans.

C. elegans est un organisme modèle avec un réseau distinct de 302 neurones, qui constituent un tiers de toutes ses cellules3. Depuis son introduction dans la science, bon nombre d’homologues et gènes orthologues ont été décrites, amplifiant sa valeur comme un modèle pour la recherche médicale. Récemment, les preuves pour des troubles neurologiques dans la rétinopathie diabétique, précédant les lésions vasculaires, a été présenté4. C. elegans est dépourvu de vaisseaux sanguins, mais contient un réseau neuronal distinct, ce qui en fait un modèle approprié pour enquêter sur des altérations neuronales en dehors vasculaire. Ainsi, c. elegans est d’un intérêt particulier pour l’étude des mécanismes généraux des complications du diabète. Les modifications biochimiques dans les complications du diabète impliquent la formation d’Age, qui influencent davantage la formation de ROS en réponse à l’hyperglycémie5. Sont trouvent chez c. elegans et contribuent aux dommages neuronaux6ans. Les maladies chroniques sont souvent causés par des processus complexes, polygéniques, nécessitant une approche multiparamétrique pour l’évaluation de leurs mécanismes sous-jacents, comme exemplifié ici avec l’évaluation des complications du diabète. Ce protocole peut être utiles pour l’obtention des paramètres multiples simultanément, ainsi que par la suite. Comparabilité accrue et la reproductibilité d’une approche multiparamétrique est possible en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.

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Protocole

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Remarque : Ce protocole est divisé en cinq sections. Dans les sections 1 à 3, le protocole principal à la culture de c. elegans à grande échelle est présenté. Les articles 4 et 5 fournissent des protocoles additionnels pour l’évaluation des métabolites dont témoigne en métabolites diabétiques. En détail, article 1 décrit une culture générale à grande échelle sur les plaques. Section 2 porte sur le transfert de grandes quantités c. elegans, considérant que le chapitre 3 explique la récolte d’un échantillon à grande échelle. Section 4 explique l’isolement des protéines de l’échantillon et la section 5 décrit la préparation des échantillons pour des analyses ultérieures liquid chromatography-spectrométrie de masse (LC-MS/MS).

1. Grande Culture sur plaques

  1. En général, travail sous hotte stérile ou à proximité d’une flamme nue pour éviter les contaminations.
  2. À la culture vers jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade adulte jeune, suivre ce protocole publiées antérieurement7 avec les adaptations suivantes.
    1. Bactéries vivantes Escherichia coli OP50 permet de nourrir les nématodes et préparer la gélose de fluorodésoxyuridine 400 µM (pas ampicilline/FUdR) pour des expériences.
    2. Pour la préparation d’une population synchrone, utilisez OP50 non concentrée et pour réussir les expériences avec les adultes, utilisez 3,3 x concentré OP50 enlève 70 % du liquide surnageant.
    3. Les intervalles d’alimentation quotidiennes sont recommandés. Lors de l’évaluation du stress oxydatif, à différents intervalles et volumes destinés à l’alimentation pourraient interférer avec les résultats.
    4. Pour l’inoculation, prenez une plaque avec plusieurs nématodes et coupez-la en morceaux d’environ 0,5 x 1 cm2 avec un scalpel. Le transfert de deux ou trois morceaux sur des plaques de croissance nématode médias (NGM) de 60 mm de diamètre, contenant OP50 non concentrée.
    5. Incuber les plaques à la température appropriée pour la souche (N2 sauvage devraient être cultivées à 20 ° C) jusqu'à ce que les oeufs sont visibles sur la plaque.
    6. Laver la plupart des œufs et des animaux adultes avec 2 mL de tampon de M9 et à leur rassemblement dans un tube de 15 mL. Centrifuger la suspension à 800 g pendant 2 min. Pendant ce temps, commencer à préparer la solution de blanchiment.
    7. Retirez le tube centrifugé et enlever le tampon M9 avec une pipette de 10 mL. Ajouter 10 mL de la solution de blanchiment et les mix sur le vortex jusqu'à ce que les nématodes adultes sont lysées. Cela prend habituellement environ 5 à 7 min, mais ne devrait pas prendre plu de 15 min ou les oeufs ne seront développera pas complètement plus tard sur dans l’expérience.
    8. Centrifuger la suspension à 800 g pendant 2 min. Laver 3 fois avec 10 mL M9 de tampon pour effacer les oeufs de la solution de blanchiment.
    9. Maintenant ajouter 150 µL de la suspension de le œuf sur plaques OP50. Une densité de 200 à 300 œufs doit être atteinte sur chaque plaque. Attendez que les nématodes ont atteint le stade adult.
      Remarque : Le M9 de tampon (pH 7,0) utilisé pour les expériences dépeinte se compose des substances suivantes : 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4et 86 mM NaCl. Après autoclavage le mélange, ajouter 1 mM MgSO4. La solution de blanchiment contient 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl résolu dans l’eau distillée.
    10. Préparer la tampon stérile de M9, pointes de pipette stérile avec une coupe astuce pour éliminer les vers et les tubes de 15 mL pour les recueillir dans.
    11. Appliquer environ 1 mL de tampon de M9 sur les plaques, doucement distribuer le tampon en balançant doucement et pipette les nématodes de la plaque.
    12. Maintenant, recueillir les nématodes dans le tube. S’appliquent, avec les pointes de pipette coupés, 150 µL de suspension directement sur les plaques (boutonnée avec OP50) et d’évaluer au microscope la densité des nématodes (recommandé : 50 – 100 nématodes par plaque de 60 mm).
    13. S’ils sont trop denses, diluer la suspension avec un tampon M9 et évaluez-la sous le microscope, jusqu'à ce que la densité désirée est atteinte. Si le rendement est trop peu, laissez les vers s’installent ou Centrifuger le s suspension 10 x 800 g pour éliminer le liquide.
      Remarque : Un exemple d’une densité suffisante est donné dans la Figure 1 a (macroscopique) et 1 b (microscopique) à une augmentation de X 20. Procéder empiriquement comme décrit.
    14. N’oubliez pas que les vers s’installent rapidement. Afin d’assurer une répartition égale entre les plaques, il faut inverser le tube après chaque pile de plaques (plaques de 4 – 5).
      Remarque : La coupe Pipeter pointe, ainsi que le doux balancement et lavage des plaques, réduit l’effort de cisaillement.

2. transférer de grandes quantités de Caenorhabditis elegans

  1. Laver les nématodes avec environ 500 µL de tampon de M9, selon l’âge et le degré de séchage des plaques. En utilisant le même tampon, répétez détacher les nématodes jusqu'à ce que la plupart des animaux est recueillie en suspension.
  2. Lentement relever les nématodes avec une coupe de pipette et de les transférer sur un plat préparé avec OP50. Sécher la plaque.
    Remarque : Veillez à ne pas faire beaucoup plus que le volume recommandé. En particulier dans les expériences à long terme, les plaques ne pourraient pas tolérer il et l’agar peut casser, ce qui permet des nématodes à ramper dans les mailles du filet.

3. la récolte d’un Large échantillon de Caenorhabditis elegans

  1. Selon la méthode choisie, commencent des expériences avec une quantité suffisante de c. elegans. Pour les analyses LC-MS/MS, préparer 20 plaques (60 mm x 15 mm) par groupe avec environ 100 nématodes par plaque afin d’assurer un rendement d’au moins 200 µg de protéines par exemple.
    Remarque : Cette partie du protocole ne requiert pas fonctionne dans des conditions stériles plus, car les nématodes seront récoltés et congelés.
  2. Le jour de la collecte d’échantillons, préparer l’azote liquide à snap-freeze les échantillons collectés. Gardez non-stérile M9 tampon sur la glace pour ralentir le métabolisme du nématode.
  3. Nettoyez c. elegans , des plaques en appliquant 1 mL de tampon de M9 et en agitant doucement les plaques. Cela évite de recueillir les nématodes décédés et la plupart des oeufs, si il sont tous présents, car elles collent aux bactéries et agar.
  4. Prendre le volume et le transférer dans un tube de 15 mL.
  5. Après le prélèvement de l’échantillon complet, attendez que les nématodes régler ou Centrifuger le tube brièvement à 800 x g et enlever la plupart de la mémoire tampon de M9. Laver l’échantillon 3 x avec environ 10 mL de M9 (10 x le volume de l’échantillon) pour éliminer toutes les bactéries.
    Remarque : Pour garantir que tous les nématodes décédés sont annulés, flottaison du saccharose est une autre option. Cependant, ce n’était pas approprié pour les expériences affiché15. Saccharose est hydrolysé en glucose et fructose. Dans les expériences dépeinte, a évalué le rôle du glucose pour promouvoir des changements biochimiques trouvés dans le diabète chronique. Ainsi, flottaison saccharose pourrait potentiellement entraîner des résultats.
  6. Préparer un tube de 1,5 mL avec 1 mL de tampon de M9 et un tube vide de 1,5 mL pour chaque échantillon. Transférer le culot avec une pipette de verre du tube 15 mL pour le tube vide de 1,5 mL. Cette étape est fondamentale assurer un transfert quantitatif.
    NOTE : Contrairement au cours des étapes précédentes, ici les nématodes sont plus concentrés. En raison d’une possible adhésion aux embouts en plastique, la perte d’une grande partie de l’échantillon est prévu. Par conséquent, utiliser des pipettes en verre à la place.
  7. Après le transfert, utiliser la pipette de verre pour prendre 1 mL de tampon de M9 dans le deuxième tube de 1,5 mL pour rincer les nématodes de la paroi de la pipette. En outre, laver les nématodes restantes dans le tube de 15 mL et transférez-les dans le tube échantillon.
  8. Centrifuger le tube d’échantillon à 19 000 x g pendant 1 min, puis retirez autant surnageant que possible.
  9. Fermer le tube avec du Parafilm et immédiatement snap-gel il dans l’azote liquide. Ranger le tube à-80 ° C jusqu'à ce que la préparation du lysate.

4. protein isolement de la spectrométrie de masse

Remarque : L’isolement de protéine décrite ici permet également d’autres épreuves (p. ex., la tache occidentale).

  1. Ajouter à l’échantillon congelé, les mêmes volumes de 0,5 mm oxyde de zirconium perles et au moins 2 x le volume de tampon lysat contenant un cocktail d’inhibiteur de protéase.
    Remarque : Les analyses de corrélation dépeinte de nématodes-à-protéine ont été effectuées à l’aide de 100 µL de tampon. LC-MS/MS des échantillons ont été lysées avec 200 µL de tampon.
  2. Commencer l’homogénéisateur pendant 1 min à vitesse 9. S’assurer que les échantillons sont complètement lysées. Répétez cette étape si elles ne sont pas complètement lysées.
  3. Centrifuger les échantillons pendant 30 min à 4 ° C à 19 000 x g. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sur la glace et conserver à-80 ° C jusqu'à ce que plus mesures vont être prises.
    Remarque : La mémoire tampon non dénaturants utilisée pour les expériences dépeinte se compose des substances suivantes : 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1 % Triton-X et 2 mM EDTA.
    Remarque : Après avoir suivi les étapes du présent protocole et après avoir appliqué le barème proposé, le rendement d’une pastille de protéine d’environ 1 000 nématodes devrait être environ de 500 µg. Pour plus de comparaisons, consulter la Figure 2 et les Résultats de représentant.

5. préparation des mesures de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide

Remarque : Selon le paramètre d’intérêt, la préparation de l’échantillon sera différente. Ce protocole met l’accent sur le méthylglyoxal et détermination de l’âge.

  1. Mesurer le méthylglyoxal intracellulaire par dérivation avec 1, 2-diaminobenzène (DB) comme décrit précédemment9.
    1. Homogénéiser les échantillons avec 20 µL de l’acide trichloroacétique glacee 20 % (wt/vol) dans le chlorure de sodium 0,9 % (wt/vol) et 80 µL d’eau dans un tube de 1,5 mL.
    2. Doper les échantillons de 5 µL avec l’étalon interne (13C3-MG ; 400 nM), mélangez-les au vortex et centrifuger à 21 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    3. Transférer 35 µL du liquide surnageant dans le flacon d’échantillon HPLC contenant un insert en verre 200 µL.
    4. Ajouter 5 µL de 3 % d’azide de sodium (wt/vol) à chaque échantillon suivie de 10 µL de 0.5 mM DB 200 mM HCl contenant 0,5 mM diéthylènetriaminepentaacétique de l’acide (DETAPAC) dans l’eau.
    5. Incuber les échantillons pendant 4 heures à température ambiante, abrie de la lumière.
    6. Analyse des échantillons par LC-MS/MS, comme précédemment décrit9.
      Remarque : Pour la mesure des âges, isoler les protéines comme décrit à l’article 4 du protocole.
  2. Mesurer la concentration de protéine des lysats (décongelées) à l’aide d’un dosage de Bradford10.
    1. Préparer des aliquotes de 30 µL pour une courbe standard additionnée de l’albumine sérique bovine (BSA) résolu en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de la concentration suivante : 0 ; 0.1 ; 0,2 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 ; et 1,0 mg/dL.
      Remarque : Si l’échantillon a été préparée à la taille suggérée (voir point 4.1 pour la préparation du lysat avec 200 µL de tampon), la concentration doit être de l’ordre de 2 à 7 mg/mL environ. Dans ce cas, diluer les échantillons 01:10 par PBS avant la mesure.
      Remarque : Pour les premières expériences à l’aide de cette méthode, il est recommandé de mesurer les échantillons à différentes dilutions (1, 01:10 et 1/100). Comme il n’y a aucune détermination exacte du nombre de nématodes, le rendement peut différer entre les chercheurs individuels.
    2. Utiliser une plaque transparente de 96 puits (polystyrène) et déposer 10µl de chaque concentration standard et des échantillons dans les dilutions choisies en double dans les puits.
    3. Diluer la protéine test colorant réactif concentré 1:5 avec de l’eau distillée (aq. dest.) et ajouter 200 µL de la dilution à chaque échantillon sur la plaque. Incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante.
    4. Mesurer l’absorbance à moins de 30 min à 595 nm avec un lecteur de plaque. Les échantillons peuvent être interpolées à partir de la courbe standard calculée. Plus de détails sur la méthode ont été largement décrits dans la littérature10.
  3. Mesurer les âges intracellulaires comme décrit précédemment11,12.
    1. Laver les extraits de protéines totales (environ 200 µg) x 3 avec de l’eau par ultracentrifugation en 10 unités de filtration centrifuge de kDa.
    2. Ajouter 10 µL de HCl à 100 mM, 10 µL de pepsine (2 mg/mL de HCl 20 mM) et 10 µL de thymol (2 mg/mL de HCl 20 mM) à la protéine Récupérée (environ 100 µL) et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 24 h.
    3. Neutralisent et les échantillons de tampon à pH 7,4 en ajoutant 12,5 µL de tampon de phosphate de potassium 0,5 M (pH 7,4) et 5 µL de 260 mM KOH.
    4. Ajouter 10 µL de la Pronase E [2 mg/mL dans le tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 7,4)] et 10 µL d’une solution de pénicilline-streptomycine et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 24 h.
    5. Ajouter 10 µL d’aminopeptidase [2 mg/mL dans le tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 7,4)] et 10 µL de prolidase [2 mg/mL dans le tampon de phosphate de potassium 10 mM (pH 7,4)] et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 48 h.
    6. Analyser l’hydrolysat résultante par LC-MS/MS, comme précédemment décrit12.

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Résultats

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Ici les exemples de la création d’une grande envergure c. elegans culture pour applications en recherche sur le diabète sont présentées. Il peut être intéressant de relier les paramètres pour un seul animal, plutôt que de normaliser ce à la concentration des protéines totales. Dans un test nécessitant un petit nombre de nématodes, ceci peut être facilement accompli en comptant les nématodes. Pour une envergure de c. elegans culture impliquant des centaines de nématodes p...

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Discussion

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Ce protocole présente une approche fiable pour la culture à grande échelle c. elegans afin d’obtenir des résultats quantitatifs. Les résultats de la littérature pourraient être transposés comme indiqué dans les Résultats de représentant. Même si ce protocole pour le prélèvement d’échantillons à grande échelle de c. elegans semble être une méthode directe, il y a certains pièges à prendre en compte. Concernant la synchronisation de la population des nématodes, ce protocole décrit une app...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le IRTG 1874 « Complications microvasculaires du diabète » et le CRC 1118 « Métabolites réactifs comme une cause de complications liées au diabète tardive ». Les souches de c. elegans N2 et CL2166 ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH Office de programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
E. coli OP50CGCn/a
C. elegans N2CGCn/a
C. elegans CL2166CGCn/a
Boîte de Pétri, 60 mm x 15 mmGreiner One628161
Pipette jaugée, verre, 10 mLNeolabE-0413
Protéinase comprimés cocktail inhibiteursRoche04693124001
Tampon de lysat non dénaturant :
Tris-HCl, pH 8SigmaT3253
Chlorure de sodium (NaCl)SigmaS7653
Triton X-100SigmaX-100
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)SigmaE5391
Plaques à 96 puits, fond transparentMarque781611
Infinite M200, lecteur de plaquesTecan30017581
Billes d’oxyde de zirconium, 0,5 mmNext advanceZROB05-RNA
Bullet Blender, homogénéisateuradvanceBBX24
Pepsin de la muqueuse gastrique porcineSigmaP6887
ThymolSigmaT0501
Pronase E/ Protéase de Streptomyces griseus SigmaP6911
Solution de pénicilline-streptomycineSigmaP43339
Prolidase de rein porcinSigmaP6675
Aminopeptidase de Aeromonas proteolyticaSigmaA8200
L’unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-0.5MerckmilliporeUFC501096
Les matériaux de base pour la culture sur plaque sont décrits dans la référence 6.
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Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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