Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité

Résumé

Ce protocole décrit une approche sans étalonnage pour quantifier les protéines homo-oligomérisation in vitro basée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation en utilisant la lumière commerciale au microscope à balayage. Les paramètres d’acquisition correcte et les méthodes d’analyse sont affichés.

Résumé

Nombre et l’éclat est une technique de spectroscopie (FFS) de fluctuation de fluorescence exempte d’étalonnage pour la détection des protéines homo-oligomérisation. Il peut être utilisé à l’aide d’un microscope confocal classique muni de détecteurs numériques. Un protocole pour l’utilisation de la technique in vitro est indiqué au moyen d’un cas d’utilisation où le nombre et la luminosité peuvent être vu à quantifier avec précision l’État oligomère de FKBP12F36V marqué au mVenus avant et après l’ajout de la dimérisation drogue AP20187. Les auteurs discutent l’importance d’utiliser les paramètres d’acquisition microscope correcte et les méthodes de prétraitement et l’analyse des données correctes. En particulier, l’importance du choix de la correction de photoblanchiment est soulignée. Cette méthode peu coûteuse peut être employée pour étudier les interactions protéine-protéine dans de nombreux contextes biologiques.

Introduction

Protein-protein Interactions j’ai n Vitro

Traditionnellement, la cristallographie et expériences de résonance magnétique nucléaire combinés avec cryo microscopie électronique (cryoEM) sont les technologies choisies pour décrire avec précision l’architecture tridimensionnelle des protéines et d’en déduire leur fonction par scrutant leurs détails structurels de haute résolution. Protéines, cependant, ne sont pas des structures statiques et peuvent subir une variété de changements de conformation et de vibrations dans le temps et l’espace. C’est pourquoi structurels informations cristallographiques ou CryoEM de données doit être complétée avec d’autres techniques (par exemple, les simulations de dynamique moléculaire et techniques de la molécule unique) : la fonction d’une protéine est liée à sa conformation changements et interactions et cette information n’est pas présent dans une structure statique. Afin de sonder dynamique intra-moléculaire, techniques basées sur la seule molécule Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) sont très efficaces¹. Ces approches sont en mesure d’évaluer différentes sous-populations de molécules dans des milieux complexes. C’est très important, car ces changements sont rapides et se produisent lors de l’acquisition des données (c.-à-d. la nanoseconde à la seconde plage).

Deux approches principales sont couramment employées pour détecter et quantifier ces changements : les protéines en solution et surface-immobilisation. Pour la détection de leurs interactions et en particulier, le processus de dimérisation induite par les ligands, smFRET n’est pas toujours le meilleur outil. En effet, frette dépend non seulement de la distance (≈10 nm), mais aussi sur l’orientation des deux dipôles (donneur et accepteur, χ²) et le chevauchement de l’émission du donneur avec les spectres d’absorption de l’accepteur², mais peut-être cette dernière condition est inférieur important pourvu que l’expérimentateur peut a choisi le bon couple de frette. Un désavantage particulier de smFRET pour sonder les homo-dimérisation vient de l’étiquetage de la protéine d’intérêt : pour smFRET Hétéro, dimérisation ne peut être détectée jusqu'à 50 % (c.-à-d., hétéro-FRET ne sera capable de détecter le donneur-accepteur et donneur-accepteur homo-dimères mais pas donneur donneur ou accepteur d’accepteur, qui est l’autre 50 % des dimères). L’utilisation de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et dérivés (SCCC, etc.³) afin de déterminer les constantes de diffusion de protéine et liaison constantes in vitro est une autre alternative. Ces approches ne sont pas en mesure de quantifier pleinement les homo-dimérisation soit, comme le coefficient de concentration et diffusion et le rayon et la diffusion de mesures FCS celui d’une particule de diffusion dépendent très mal le poids moléculaire ; par exemple une augmentation de 10 fois le poids moléculaire impliquera seulement un changement de 2,15 pli dans le coefficient de diffusion⁴. Dans le cas de deux couleurs FCS ou HCFC, seulement 50 % des homo-dimères verra pour la même raison que ci-dessus. Approche la plus pragmatique et quantitatives pour détecter les homo-dimérisation in vitro et in vivo est homo-FRET⁵ , nombre et luminosité (N & B)⁶. Compte tenu du fait que homo-FRET exige une instrumentation spécifique récupération de la valeur de l’anisotropie (c.-à-d., optique éléments/analyseurs de récupérer la polarisation parallèle et perpendiculaire), N & B sont présentée ici comme une technique favorable à détecter la protéine homo-dimérisation et agrégation. Il peut être employé aussi bien in vitro et in vivo avec une installation commerciale.

Nombre et la luminosité

N & B a été récemment révisé⁷. Cet examen a porté sur l’application de la technique dans des cellules vivantes. Il est utile de reproduire le formalisme mathématique ici comme ces équations s’appliqueront aux données collectées in vitro. Tout d’abord, il est nécessaire de définir certains termes et quantités mathématiques :

• Une entité est un ensemble de molécules qui sont liés entre eux.
• La ε de luminosité d’une entité est le nombre de photons, qu'il émet par unité de temps (par image).
• n est le nombre d’entités présentes.
• D’un pixel donné au cours d’une série d’image, < i > est que sa moyenne intensité et σ² est la variance dans son intensité.

Puis, avec détecteurs de comptage de photons et en supposant que les entités mobiles et pas de fond,

où N est le nombre apparent et B est la luminosité apparente. Cela se traduit par

Dali et al. ⁸ a montré qu’avec un équipement analogique, il faut trois termes de correction : le facteur S, l' arrière-plan offsetet le bruit de lecture σ₀². Puis, à nouveau en supposant que les entités mobiles,

ce qui donne

Noter que l’équation ci-dessus pour est différente de celle donnée dans Dali et al. ⁸ et une révision ultérieure. ⁷ à Dali et coll. le S dans le dénominateur a été omis en raison d’une faute de frappe, et cette erreur a été reproduite dans la revue. L’équation ci-dessus est la bonne. Instructions pour la mesure de S, offset et σ₀² - ainsi qu’une explication de leur sens - sont donnés par Dali et al. ⁸

La ε de luminosité est proportionnelle à l’État oligomère des entités diffusants : ε sera deux fois plus gros pour les dimères comme c’est pour les monomères, trois fois plus gros pour trimères comme c’est pour les monomères, deux fois aussi grands pour hexamères comme c’est des trimères et ainsi de suite. De cette façon, en mesurant la luminosité ε, on peut quantifier tout type de multimerization.

S’il y a un mélange d’oligomères Etats présents, nombre et la luminosité n’est pas capable de récupérer les différents États d’oligomères présents. Il s’agit d’une limitation de la technique.

Detrend logiciel d’algorithme et nandb

L’importance de la correction pour le photoblanchiment a été souligné précédemment⁹. Photoblanchiment se produit inévitablement au cours d’expériences de microscopie photonique en mode Time-lapse ; aussi bien dans des cellules vivantes et in vitro. Plusieurs approches ont été décrits dans la littérature pour corriger pour la décoloration des⁷. La technique de filtrage exponentielle avec choix automatique de paramètre de la méthode T est le meilleur actuel. Elle est intégrée dans le nandb du logiciel open source gratuit,⁹. En effet, un logiciel qui oblige l’utilisateur à choisir manuellement leur paramètre de méthode peut conduire à des résultats incorrects parce que ce choix de paramètre sera probablement arbitraire et erronée. L’algorithme automatique vérifie les données et détermine le paramètre approprié pour elle, sans la nécessité d’une intervention de l’utilisateur⁹. Même avec le meilleur choix du paramètre de lissage, dissociation a ses limites et ne fonctionne bien qu’avec photoblanchiment pourcentages inférieurs à 25 %, comme le montre avec des simulations⁹. Fait intéressant, lorsque vous utilisez la méthode de routine automatique, sa précision est telle que l'on peut travailler avec des valeurs de luminosité faible (même B < 1,01), d'où de faibles intensités et encore être assez précis pour quantifier les homo-dimérisation.

Photoblanchiment provoque aussi un autre problème : la présence de fluorophores photobleached dans un polymère complexe. Ce qui rend par exemple, un trimère apparaissent comme un dimère lorsque l’une des trois unités dans le trimère est non fluorescent. Hur et Mueller¹⁰ a montré comment faire pour corriger cela et cette correction a également été soulignée dans une révision ultérieure⁷. Le logiciel de nandb comprend cette correction⁹.

La FKBP12 F36V système

FKBP12F36V est une protéine qui ne pas naturellement oligomerize, mais sait se dimériser lors de l’addition des drogues (familièrement appelé le BB dimérisation ligand)^11,AP20187¹². Cela en fait un cas de test idéal pour le nombre et l’éclat : avec FKBP12F36V marqués, un doublement des oligomère État doit être observé lors de l’addition de BB.

Protocole

1. FKBP12 F36V mVenus - Purification

1. Transformer des cellules pLysS (DE3) avec le vecteur pET22b contenant les monomerized de le FKBP12F36V humaine¹² et balises d’His6 et de mVenus N-terminal (vector disponible sur demande). Cellules de la plaque sur une gélose LB additionné de 50 µg/mL d’ampicilline et 34 µg/mL de chloramphénicol.
2. Transfert des colonies transformées en culture starter 100 mL LB et croître pendant 16 à 20 heures à 37 ° C sous agitation.
3. Diluer la culture starter dense (DO600 > 1/100 1) dans le milieu LB (lot de 2 x 500 mL) et de grandir pendant 2-3 heures pour DO600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 tr/min).
4. Cultures cool sur la glace. Induire à 250 µM IPTG et croître pendant 16 à 20 heures à 21 ° C, 200 tr/min.
5. Récolter les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 20 minutes.
6. Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon d’IMAC (20 mM sodium phosphate pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazole de 3 mM, 1 mM β-mercaptoéthanol) complété avec des inhibiteurs de protéase sans EDTA (1 comprimé par culot cellulaire).
7. Soniquer cellules (amplitude de 500 Watts, 20 kHz, 40 %, 9 s, 11 s éteint pendant 15 min) sur la glace et la récolte des matières solubles par centrifugation à 20 000 x g.
8. Transfert soluble lysat dans une fiole conique et ajouter 2 mL de résine (voir Table des matières). Incuber pendant 1 heure avec rotation 105 tr/min
   NOTE : Nickel Sépharose peut également être utilisé pour cette étape de l’IMAC.
9. Récolter la résine et laver avec 250 mL de tampon de l’IMAC A suivi de 500 mL de tampon de IMAC B (20 millimètres sodium phosphate pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazole de 7 mM, 1 mM β-mercaptoéthanol).
   NOTE : Augmenter à imidazole de 50 mM, si à l’aide de résine de Sépharose Nickel.
10. Éluer les protéines His6-tag à l’aide de tampons IMAC C (20 mM sodium phosphate pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazole de 300 mM, 1 mM β-mercaptoéthanol).
11. Injecter sur une exclusion de taille colonne (voir Table des matières) équilibrées dans 10 millimètres HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 millimètre DTT. FKBP12F36V a son élution de pic à 87,71 mL sur la colonne, nous avons utilisé.
12. Évaluer la pureté par SDS-PAGE et de la piscine et se concentrent au besoin.

2. préparation du tableau plaque multipuits

1. Décongeler le FKBP12F36V purifié (ou protéine d’intérêt marquée) de-80 ° C.
2. Préparer une solution de 100 nM purifiée FKBP12F36V (moyennes, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 millimètre DTT). Soniquer et centrifuger (essorage rapide de 13 000 tr/min) pour éviter la formation d’agrégats.
3. Pipetter 100-200 µL dans une chambre d’observation bien 8 à fond de verre.
4. Ajouter le dimerizer de BB à la concentration finale de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 et 500 nM^12,13.
5. Comme référence, préparer une solution de 100 nM de mVenus seul pour évaluer les effets potentiels de l’agrégation et la précipitation et de récupérer une valeur de luminosité pour le monomère avec les mêmes paramètres d’acquisition.

3. étalonnage exempt Confocal Acquisition

1. Démarrez le système confocal (Figure 1). N’importe quelle lumière microscope système confocal à balayage équipé de détecteurs numériques ou bien caractérisés détecteurs analogiques⁸et capable de garder une temporisation constante pour chaque pixel de l’acquis fonctionnera.
2. Définissez le chemin de faisceau d’excitation :
   1. Allumez, 514 nm laser et ensemble il au nW de 20 à 100 de puissance à la sortie de l’objectif (pour FKBP12F36V-mVenus).
   2. Sélectionner l’objectif 63X1.4NA ou un objectif à immersion d’eau collier correction conçu pour FCS.
   3. Allumez un HyD, APD ou détecteur de PMT calibré. Détecteurs de mesure de comptage de photons sont préférables, comme en l’espèce, le calcul de S, offset et σ₀² ne sont pas nécessaires.
   4. Sélectionnez la fenêtre d’émission de 520-560 nm
   5. Définissez le trou d’épingle à 1 unité aérée pour l’émission ~ 545 nm correspondant.
   6. Définir le mode d’acquisition à 16 x 16 pixels
   7. Réglez le temps de s’attarder de pixel t_habiter qu’il répond t_cadre >> T_D >> t_habiter, où _D est le temps de résidence de la diffusion t de protéine et _cadre est la cadence. Cela correspond au réglage de l’heure de s’attarder à ~ 13 µs.
      Remarque : Certains fabricants commerciaux avaient scanners qui ne conservaient pas le temps d’arrêt par pixel constante. Cette constance est cruciale pour la méthode fonctionne.
   8. Définir la taille de pixel à ~ 120 nm.
   9. Sélectionnez le mode d’acquisition de xyt , puis sélectionnez le nombre d’images à acquérir par achat et bien (par exemple 5 000).
   10. Si le système est équipé d’un mode haut débit, introduire les coordonnées de chaque puits et le nombre d’acquisitions / puits pour automatiser le processus.
       Remarque : Veillez à assurer la présence d’un distributeur d’eau pour si vous utilisez un objectif à immersion.
   11. Si le système est équipé d’un système de perfusion, chargez la solution BB et programmer la perfusion pour démarrer droit-après le 5000^ème cadre pour évaluer la cinétique de dimérisation tout en acquérant par exemple, 10 000 images.
3. Ajouter une goutte d’huile dans l’objectif à immersion d’huile / eau si utilisant un objectif à immersion d’eau collier correction conçu pour FCS.
4. La chambre 8 observation bien monter la scène.
5. Sélectionnez le bon puits et se concentrer sur la solution.
   Note : IMPORTANT : éviter de se concentrer à proximité de la vitre de fond pour éviter la réflexion et diffusion. Lorsque nous nous concentrons plus profondément dans la solution, déconnecter l’option de mise au point automatique.
6. Démarrer l’acquisition et économiser la pile résultante d’images au format TIFF.

4. detrend et analyse de luminosité à l’aide du progiciel R nandb

1. Prétraitement contrôle qualité, utilisez ImageJ¹⁴ pour regarder les images et récupérer le profil d’intensité, comme illustré à la Figure 2a. Ceci est utile pour déterminer si oui ou non trop photoblanchiment est survenue. S’il y a trop de blanchiment, les données ne convient pas pour une analyse ultérieure.
   Note : ImageJ peut également être utile pour convertir des images au format TIFF depuis les formats commerciaux. Le logiciel nandb décrit ci-dessous ne peut fonctionner avec des fichiers TIFF.
2. Téléchargez et installez R et RStudio^15,16. Il est préférable de télécharger et d’installer R d’abord, puis RStudio.
   NOTE : Ce qui suit est une description de la façon d’utiliser le paquet de nandb R. Connaissance de la langue R n’est pas tenue d’utiliser nandb, mais il rendra la vie plus facile.
3. Installez le paquet nandb.
   1. Ouvrez RStudio et dans la console, tapez install.packages("nandb") et attendez que l’installation.
4. Faire connaissance avec nandb
   1. Consulter le manuel¹⁷.
   2. Consultez l’aide intégrée de RStudio pour diverses fonctions. La fonction plus susceptible d’être utilisé sera à l’aide de sera brightness(). Consulter le fichier d’aide de cette fonction en tapant ? Brightness() à la console.
5. Calculer la luminosité
   1. Dire qu’on a un fichier image sur le bureau appelé img001.tif (Notez que « nandb » ne fonctionne qu’avec des fichiers TIFF). On peut calculer la luminosité de cette image :
      b <-luminosité ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Ceci affecte la luminosité de l’image à la variable b dans R. Le tau = « auto » fait en sorte que l’image est correctement redressée avant calcul de la luminosité. La chose plus commune à faire d’ici est de calculer la moyenne ou la médiane luminosité de l’image. On peut faire cela en tapant mean(b) ou median(b). On peut aussi écrire l’image de la luminosité à l’aide de fonds
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Dire un a dossier rempli d’images images_folder sur le bureau et il faut calculer la luminosité de ces images et écrire les images de luminosité sous forme de fichiers TIFF. Ensuite, voir ? brightness_folder(). Cette fonction traite un dossier entier à la fois :
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      C’est particulièrement bon pour ceux qui ont un logiciel qu’ils préfèrent à R, parce que tous les fichiers sont traités en une seule commande, et puis on peut continuer à travailler avec les images TIFF luminosité dans leur logiciel choisi, que ce soit ImageJ¹⁴ , Python ou autre chose.

Résultats

Luminosité de redressement et de monomère

Une fois que les données ont été acquises, on peut commencer les calculs de luminosité pour déterminer l’État oligomère de la protéine d’intérêt dans la solution. Même si l’effet de blanchiment en solution n’est peut-être pas aussi drastique qu’elle peut être in vivo, la trace d’intensité probablement pas auront toujours stationnaire moyenne, probablement à caus...

Discussion

N & B sont une technique pour détecter les multimerization à l’aide de lumière commercial balayage confocal microscopes équipés de détecteurs numériques. Cette approche est assez attrayante par rapport à point unique FCS, SCCC et smFRET parce qu’il est libre d’étalonnage et le calcul de la luminosité est simple et concentration indépendant⁶. Il est important, cependant, afin de corriger les fluctuations d’intensité de blanchiment et à long terme avant d’effectuer les calculs de luminosité

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RosettaTM (DE3) Cellules pLysS	Novagen	70956-3
Ampicilline	Sigma Aldrich	PubChem ID de la substance 329824407
Chloramphénicol	Sigma Aldrich	PubChem ID de la substance : 24892250
LB culture de démarrage	QIAGEN
LB medium	QIAGEN
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem ID de substance 329815691
tampon IMAC	Medicago	09-1010-10
Inhibiteurs de protéase sans EDTA  ;	Sigma Aldrich	11873580001
TALON résine	Clonetech
Nickel sépharose	GE Healthcare
S200 16/60 colonne	GE Healthcare
Fond de verre 8 puits	plat d’observation Ibidi	80827