Préparer un 68Ga-étiqueté Arginine Glycine Aspartate (RGD)-peptide de l’angiogenèse

Résumé

L’intégrine α_vβ₃ est un type de protéine qui est fortement exprimée sur les cellules endothéliales activées subissant l’angiogenèse. Ainsi, évaluer l’intégrité de l’intégrine est d’un grand intérêt en oncologie. Ici, nous présentons une méthode pour préparer les ⁶⁸marqués au Ga radiopeptides et une méthode pour évaluer son efficacité biologique.

Résumé

L’intégrine α_vβ₃ est une molécule d’adhésion hétérodimérique impliqués dans l’angiogenèse et la migration des cellules tumorales. L’intégrine est surexprimé dans les cellules endothéliales tumorales angiogénique, où il porte généralement une faible concentration. Cette expression précise de α_vβ₃ rend un biomarqueur valide pour anti-angiogéniques et drogues d’imagerie. Comme une modalité d’imagerie fonctionnelle, par émission de positrons (TEP) fournit des informations sur biochimiques et physiologiques changent in vivo, grâce à sa haute sensibilité unique à l’échelle de nanomolaires. Par conséquent, basé sur radiometal preps ont reçu beaucoup d’attention pour la quantification non invasif de l’angiogenèse tumorale. Cet article fournit un protocole systémique pour préparer un nouveau peptide radiometal marqué pour l’évaluation de l’angiogenèse. Ce protocole contient des informations sur la fiabilité de radiochimie, la lipophilie, apport des cellules, sérum stabilité et propriétés pharmacocinétiques. Les ⁶⁸Ga-RGD-peptide est l’un des ligands PET représentatifs vers α, β_v3 intégrine. Ici, nous introduisons un protocole visant à préparer un ⁶⁸Ga-RGD-peptide et l’évaluation de son efficacité biologique.

Introduction

L’angiogenèse est un processus biologique qui se caractérise par le développement de nouveaux vaisseaux sanguins. Parmi les nombreux facteurs angiogénétique, α, β_v3 intégrine est associé à caractère invasif, parce que l’Integra est fortement exprimée dans les vaisseaux de tumeur angiogénique mais est absent dans les tissus normaux¹_.

Radioactifs-liaison aux récepteurs des peptides avec le domaine d’aspartate (RGD) glycine arginine, qui présente une forte affinité vers₃ d’intégrines α_vβ, sont considérées comme prometteuses angiogenèse imaging agents^{2,3 , 4 , 5 , 6 , 7}. plusieurs radiopharmaceutiques ont été créés pour animal de compagnie et de ses propriétés biologiques ont été validées dans divers modèles animaux^8,9,10,11. En ce qui concerne un radionucléide, ⁶⁸Ga a plusieurs avantages par rapport aux autres radioisotopes. Tout d’abord, il a une grande accessibilité pour les utilisateurs et est économiquement avantageuse car un cyclotron n’est pas nécessaire. Deuxièmement, ⁶⁸Ga axée sur les produits radiopharmaceutiques produisent une résolution spatiale élevée par rapport à la tomographie d’émission monophotonique (SPECT), ce qui permet une quantification plus précise. Enfin, la demi-vie de 67,71 minutes de ⁶⁸Ga peut suffire pour la préparation de petits peptides ou protéines.

Pour produire un complexe stable avec ⁶⁸Ga, chélateurs beaucoup ont été développés. Les chélateurs représentatifs sont l’acide 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (TETA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA), acide 1,4,7-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique (NOTA), diéthylènetriaminepentaacétique acide (DTPA) et N, N'-di(2-hydroxybenzyl) éthylènediamine-N, N'-acide diacétique (HBED). NOTA a été signalé pour former un complexe très stable avec ⁶⁸Ga (journal stabilité constante 30,98)^12,13,14.

Le but de cette étude est de fournir un protocole concis pour l’élaboration d’une nouvelle radiopeptide (Figure 1). À titre d’exemple, nous préparons ⁶⁸Ga-étiqueté RGD-peptides et des méthodes actuelles d’évaluation biologique de ces analogues dans un modèle de xénogreffe.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées en conformité avec les directives pour le soin et l’utilisation de la recherche animaux sous protocoles approuvés par l’Institut de radiologie de Corée et Sciences médicales Animal Studies Committee. Tous les réactifs et solvants ont été achetés et utilisés sans davantage de purification. NOTA-RGD-peptides ont été préparés selon les méthodes de littérature¹⁵.

Attention : ⁶⁸Ga émet positrons et rayons gamma. Toutes les expériences, y compris le contact direct ou indirect avec des substances radioactives, doivent être réalisés par formé et autorisé uniquement au personnel. Lors de la manipulation de matières radioactives, équipement de protection adéquat, blindage, badge dosimètre radiation et anneaux et un radiamètre devraient être utilisés.

1. radiolabeling RGD-peptides avec ⁶⁸GaCl₃

Remarque : ⁶⁸Ga (t_1/2 = 68 min, β⁺ = 89 % et ce = 11 %) provenaient de la ⁶⁸Ga / générateur de Ge de⁶⁸.

1. Éluer les ⁶⁸GaCl₃ du générateur avec 4 mL de 0,05 M HCl.
2. Purge à l’azote à 80 ° C pendant 30 min à sec ⁶⁸GaCl₃ (333 kBq, 1 mL) dans un flacon de 5 mL réaction.
3. Ajouter une solution de peptide RGD (100 µg) en acétate de sodium 1 M (100 µL, pH 5-6) dans le flacon de réaction contenant ⁶⁸GaCl₃ à l’étape 1.2.
4. Faire chauffer le mélange réactionnel à 80 ° C pendant 5 min. Puis, refroidir à température ambiante.
5. Purifier le produit brut avec la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Utilisez le système suivant : une colonne de C-18, un débit de 0,5 mL/min, une pente gradient d’acétonitrile de 1.17%/min (5 % - 40 % en 30 min) et de composants d’élution : A = 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans l’acétonitrile, B = 0,1 % TFA dans l’eau.
   Remarque : L’HPLC est équipé d’un détecteur à barrettes photodiode et un détecteur de radioactivité. Les ⁶⁸Ga-RGD-peptide a été recueilli à un temps de rétention de 12,5 min (Figure 2).
6. Purifier la résultante ⁶⁸Ga-RGD-peptide en utilisant un système d’extraction en phase solide.
   1. Passer la solution à travers une cartouche de phase inverse C18 et laver avec 2 mL de solution saline.
   2. Éluer ⁶⁸Ga-RGD-peptide 0,7 ml d’éthanol à 95 %. Enlever le solvant à 80 ° C sous azote gazeux pendant 20 min et reconstituer avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant utilisation.
   3. Filtrer le produit radiomarqué à travers un filtre stérile de 0,22 µm et formuler dans 1 mL de solution saline stérile.
7. Vérifier le rendement radiochimique par radio-couche mince, chromatographie (TLC).
   1. Spot 1 µL sur une plaque de chromatographie sur couche mince instantanée (technologique, 10 cm de longueur). Mettre la plaque dans une chambre contenant l’éluant (acide citrique en solution aqueuse 0,1 M, pH 5.0) jusqu'à 9 cm loin de l’endroit.
      Remarque : Le facteur de rétention de ⁶⁸Ga-RGD-peptide est 0 et le facteur de rétention pour n’ayant pas réagi ⁶⁸Ga^{3 +} est 1.
8. Calculer l’activité spécifique finale du rapport de la radioactivité correspondant à la non-radioactivité comme MBq/nmol.
   Remarque : Après l’injection de 100 µL de la formulé ⁶⁸Ga-RGD-peptide à l’HPLC, le montant de la composante non radioactif a été calculé à partir de la courbe d’étalonnage standard non radioactif Ga-RGD-peptide.

2. incorporation de cellulaire in Vitro

Remarque : Les cellules de glioblastome humain de gliomes malins (U87MG) Uppsala 87 ont été cultivés dans les médias de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), additionné de 10 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine. Cellules sont cultivées dans des plats de 150 mm à 37 ° C en atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂. Les cellules ont été récoltées ou divisés par trypsinisation : trypsine 0,25 % (p/v) et acide éthylènediaminetétraacétique 0,02 % (p/v) (EDTA) dans du PBS à 37 ° C pendant 3 à 5 min.

1. Cellules U87MG semences en plaques 6 puits à une densité de 1 x 10⁶ cellules/puitsent.
2. Incuber les cellules avec ⁶⁸Ga-RGD-peptide (111 kBq) à 37 ° C pendant 30, 60, 90 et 120 min. préparation des échantillons en trois exemplaires.
3. Laver les cellules 2 x 2 ml de PBS et récolte par trypsinisation. Utilisez la trypsine 0,25 % (p/v) et l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,02 % (p/v) dans du PBS à 37 ° C pendant 3 à 5 min.
4. Recueillir la suspension cellulaire (500 µL) et la mesure dans un compteur-γ.
5. Calculer la pourcentage absorption du composé par les cellules en % (chiffres dans la numération de cellules/total).

3. in Vitro sérum stabilité

1. Ajouter 500 µL de sérum de souris fraîchement préparés, 500 µL de sérum humain et 500 µL de PBS. Incuber le mélange à 37 ° C pendant 2 h.
2. Évaluer par technologique à des intervalles de temps spécifiés (30, 60, 90 et 120 min). Repérer la quantité de 1-2 µL du mélange sur la plaque technologique (phase mobile : acide citrique 0,1 M). Développer la plaque comme au point 1.7.
   NOTE : ⁶⁸Ga^{3 +} devrait se déplacer avec le front de solvant, tandis que le précurseur marqué restera à l’origine.

4. la détermination du caractère lipophile

1. Ajouter ⁶⁸Ga-RGD-peptide (3,7 MBq, 3,7 µL) au système octanol-PBS (1:1, v/v, total 1 mL).
2. Mélanger les flacons vigoureusement pendant 5 min à température ambiante et centrifuger à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
3. Prélever 100 µL de chaque couche et mesurer la radioactivité avec un compteur-γ. La valeur signalée log P est basée sur la moyenne des trois échantillons.

5. tumeur modèle

Remarque : Souris nude de souris BALB/c (6-8 semaines ancienne, femelle, n = 23) ont été utilisées pour cette étude. Les souris ont été utilisés par la suite pour les études de PET (n = 3) et de biodistribution (n = 20) lorsque le volume de la tumeur a atteint 200 à 300 mm³ (1-2 semaines après l’implantation).

1. Charger des cellules tumorales dans 28 G, 1/2 pouce seringues à insuline.
2. Injecter des cellules U87MG (5 x 10⁶) dans 100 µL de PBS dans la région du bras gauche.
3. Anesthésier la souris à l’isoflurane 2 % dans les gaz d’oxygène au cours de l’injection de cellules.
   1. Veiller à ce que la souris a été anesthésiée par la perte de la pédale retrait réflexe suivant pincer avec une pince entre les orteils du pied postérieur droit. Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.

6. in Vivo la Quantification des α_vβ₃ PET à l’aide de l’intégrine

1. Anesthésier les souris à l’isoflurane 2 % d’oxygène.
   1. Veiller à ce que la souris a été anesthésiée par la perte de la pédale retrait réflexe suivant pincer avec une pince entre les orteils du pied postérieur droit. Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
2. Placez la tête dans le centre du portique de PET.
3. Administrer par voie intraveineuse le ⁶⁸solution Ga-RGD-peptide (7,4 MBq, 200 µL) à la xénogreffe souris modèle via la veine caudale pendant 1 min.
4. Dans le même temps, effectuer un PET scan en mode liste (analyse dynamique) pour 150 min.
   NOTE : Les données brutes de PET ont été reconstruites en un laps de temps défini par l’utilisateur (c'est-à-dire, toutes les 30 minutes). Après le PET scan, un balayage de micro-la tomodensitométrie (CT) (50 kVp de rayons x, 0,16 mA) a été réalisée pour la correction d’atténuation.

7. la Biodistribution Ex Vivo

1. Injecter des ⁶⁸Ga-RGD-peptide (0.37 MBq, 200 µL) dans la veine caudale de la modèle de xénogreffe de souris. Anesthésier la souris à l’isoflurane 2 % dans les gaz d’oxygène pendant les injections.
   Remarque : Souris Nudes BALB/c, tel que décrit à l’article 5, ont été divisés en quatre groupes et sacrifiés à des moments différents (n = 5 par groupe).
2. Réveiller les souris immédiatement après l’administration de ⁶⁸Ga-RGD-peptide et les sacrifier à 30, 60, 90 et 120 min après l’injection avec l’euthanasie de dioxyde de carbone.
   Remarque : Les tissus d’intérêt ont été tirées. Cibles choisies étaient de sang, muscles, coeur, poumon, foie, rate, estomac, intestin, reins, OS et tumeur.
3. Peser le tissu et mesurer la radioactivité avec un compteur-γ.
   NOTE : Les résultats étaient exprimés comme la pourcentage de dose injectée par gramme de tissu (ID/g %).

Résultats

La chélation de ⁶⁸GaCl₃ avec le NOTA-RGD-peptide était simple, et le rendement radiolabeling était de 99 %. Impuretés de réaction ont été correctement supprimées, comme illustré à la Figure 2. La pureté radiochimique de ⁶⁸Ga-RGD-peptide était supérieure à 99 %, et l’activité spécifique à la fin de la synthèse est 90-130 MBq/nmol (Figure 3).

Discussion

Dans la présente étude, nous avons introduit un protocole visant à préparer un radiopeptide visant α, β_v3 intégrine et son évaluation biologique. Développement des médicaments traditionnels implique une procédure compliquée. Elle nécessite une grande quantité de documents de référence et une durée d’évaluation relativement longue. Bien que la méthodologie proposée ne peut pas remplacer le processus d’évaluation délicate, ce système peut servir à des fins de dépistage. Le projet de système permettrai...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
68Ga/68Ge générateur	ITG	Company-10	mCi  ;
Solution de chlorure d’hydrogène	Sigma-aldrich	84429
Acétate	de sodium Sigma-aldrich	S2889
C18 cartouche en phase inverse	Waters	WAT020515
0.22-&mu ; m filtre stérile	Milllipore	SLGV033RS
Scanner Radio-TLC	Bioscan	AR2000
Papier ITLC	Agilent	SGI001
Acide citrique	Sigma-aldrich	251275
Système HPLC	Waters-Waters		1525 contenant pompe binaire, réseau de photodiodes (Waters 2998), détecteur de radioactivité (Raytest, Gabi)
Acétonitrile	J.T. Baker	14-650-359
Acide trifluoroacétique	Sigma-aldrich	302031
Eagle media modifié de Dulbecco  ;	Thermo fisher scientific	11965092
sérum fœtal bovin	Thermo fisher scientific	16000044
flacons T175	Corning	CLS431080
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Thermo fisher scientifique	25200072
pénicilline-streptomycine	Thermo fisher scientific	15240112
&gamma ;-counter	Perkin Elmer-1480		Wizard 3
Seringue Insunlin	Becton Dickinson	326105
Pompe à résonance	Harvard Appareil	70-4500
micro-PET/CT	Siemens Inveon	-