Neurogenèse à l'aide de cellules de carcinome embryonnaire P19

Résumé

La lignée cellulaire embryonnaire de carcinome de souris P19 (ligne cellulaire P19) est largement utilisée pour étudier le mécanisme moléculaire de la neurogenèse avec une grande simplification par rapport à l'analyse in vivo. Ici, nous présentons un protocole pour la neurogenèse acide-induite rétinoïque dans la ligne de cellules de P19.

Résumé

La lignée cellulaire P19 dérivée d'un tératocarcinome dérivé de l'embryon de souris a la capacité de se différencier en trois couches germinales. En présence d'acide rétinoïque (RA), la lignée cellulaire P19 cultivée en suspension est induite pour se différencier en neurones. Ce phénomène est largement étudié comme un modèle de neurogenèse in vitro. Par conséquent, la lignée cellulaire P19 est très utile pour les études moléculaires et cellulaires associées à la neurogenèse. Cependant, les protocoles pour la différenciation neuronale de la lignée cellulaire P19 décrite dans la littérature sont très complexes. La méthode développée dans cette étude est simple et jouera un rôle dans l'élucidation des mécanismes moléculaires dans les anomalies neurodéveloppementales et les maladies neurodégénératives.

Introduction

Pendant le développement embryonnaire, une seule couche cellulaire est transformée en trois couches germinales distinctes^1,2,3. Pour augmenter les possibilités de recherche des phénomènes se produisant in vivo, la génération d'agrégats tridimensionnels (corps embryonnaires) a été développée comme modèle pratique. Les agrégats cellulaires formés de cette façon peuvent être exposés à diverses conditions causant la différenciation cellulaire, qui reflètent le développement de l'embryon^4,5. La lignée cellulaire embryonnai....

Protocole

1. Entretien de la culture

1. Culture de la lignée cellulaire P19 dans le milieu d'entretien (le milieu modifié d'aigle de Dulbecco avec 4 500 mg/L de glucose complété par 10 % de FBS, 100 unités/mL de pénicilline et 100 unités/mL de streptomycine). Incuber à 37 oCet 5 % de CO 2.

2. Cellules de sous-culture

1. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence, retirez le milieu usé des flacons de culture cellulaire (surface de 25 cm²).
2. Laver les cellules avec 2 ml de phosphate tamponné salin (PBS) exempt de calcium et de magnésium.
3. Ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (acide ét....

Résultats

Le schéma simplifié de protocole pour l'induction de neurogenèse dans la lignée cellulaire P19 est présenté dans la figure 1. Afin de définir le caractère de la lignée cellulaire P19 dans un état indifférencié et pendant la neurogenèse, la méthode RT-PCR (réaction en chaîne de transcription-polymériase inversée) a été utilisée. La lignée cellulaire Indifférenciée P19 exprimait les gènes de la pluripotence tels que le transporteur de cation/carnitine organique.......

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole simple pour la neurogenèse utilisant la ligne cellulaire de P19. Bien que de nombreux rapports aient été publiés à cet égard, une méthodologie détaillée pour l'induction de neurogenèse utilisant la lignée cellulaire De P19 demeure peu claire. En outre, nous avons utilisé un simple high glucose (4,500 mg/L) milieu DMEM avec 10% FBS pour l'ensemble de l'expérience. Cela nous a permis d'effectuer l'expérience neurogène d'une manière conviviale et d'élargir l'utilisation de cette méthode pour.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
6x Colorant de chargement d’ADN	EURx	E0260-01
Agarose	Sigma- Aldrich	A9539
Kit de synthèse d’ADNc	EURx	E0801-02
DAPI (4&prime ;,6-Diamidine-2&prime ;-dichlorhydrate de phénylindole)	Sigma- Aldrich	10236276001	Concentration de travail : 1 &mu ; g/mL
de DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) avec L-glutamine	Lonza	BE12-604Q
Éthanol 99,8 %	Chempur	CHEM*613964202
Sérum fœtal de veau (FBS)	EURx	E5050-03
Anticorps MAP2	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilution 1:100
Kit de réaction	PCR EURx	E0411-03
Pénicilline/Streptomycine 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x concentré sans Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Acide rétinoïque	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	²nbsp ; dissous dans de l’éthanol à 99,8 %; Stocker à -20 ° ; C jusqu’à 6 mois
Anticorps secondaire (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilution 1:500
Lait écrémé	Sigma- Aldrich	1153630500
TBE	Buffer Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsine 0,25 % - EDTA dans HBSS, sans  ; Ca2+, Mg2+, avec biosérum rouge de phénol		LM-T1720/500
			de culture cellulaire
1 mL Pipettes sérologiques	Profilab	515.01
10 mL Pipettes sérologiques	Profilab	515.10
Boîte de 100 mm dédiée à la culture en suspension	Corning	C351029
Tubes à centrifuger de 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipettes sérologiques de 5 mL	Profilab	515.05
Plaque 6 puits	Corning	CLS3516
Fioles de culture cellulaire, surface 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA

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