Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.
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Article de méthode
Oeufs fécondés de livraison assistée par laser des gènes gène aux souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Lentivirus sont des vecteurs efficaces pour gène de cellules de mammifères. Suite de transduction, le génome des gènes est solidement intégré dans le chromosome de l’hôte et est transmis à la descendance. Ils sont donc un vecteur idéal pour la création de lignées cellulaires stables, en vivo livraison d’indicateurs et la transduction des oeufs seule cellule fertilisée pour créer des animaux transgéniques. Cependant, souris des oeufs fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène des gènes. Lentivirus sont trop grosses pour pénétrer la zona et sont généralement livrés par microinjection de particules virales dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires. L’exigence de techniciens hautement qualifiés et d’équipements spécialisés a réduit au minimum l’utilisation de lentivirus pour la livraison de gène à des embryons de souris. Cet article décrit un protocole pour perméabiliser les oeufs souris fécondée par perforer le zona avec un laser. Laser-perforation n’entraîne pas de dommages aux embryons et permet des lentivirus accéder aux cellules embryonnaires pour la livraison de gène. Transduite embryons peuvent devenir blastocyste in vitro et si implantés chez des souris pseudopregnant, évoluer vers des chiots transgéniques. Le laser utilisé dans le présent protocole est efficace et facile à utiliser. Gènes envoyés par lentivirus stablement incorporent sur les cellules embryonnaires de souris et sont transmissible germline. Il s’agit d’une méthode alternative pour la création de souris transgéniques qui ne nécessite aucun micromanipulation et microinjection des oeufs fécondés.
Introduction
Cette méthode fournit des instructions détaillées pour perméabiliser la zone pellucide des oeufs fécondée de souris pour fabriquer des cellules embryonnaires accessibles pour la livraison de gène de lentivirus. Lentivirus ont été conçues par nature pour la livraison efficace de gène aux cellules de mammifères. Ils infectent les cellules en division et non de division et intègrent le génome des gènes de leur hôte chromosomes1. La plage de cellules de l’hôte des gènes est facilement développée par pseudotypage le lentivirus recombinant avec la glycoprotéine de virus de stomatite vésiculaire (VSV-G), en raison de la large tropisme de la VSV-G prot....
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Protocole
Toutes les procédures animales et les traitements utilisés dans le présent protocole ont été en conformité avec les directives de protection des animaux de NIH/NIEHS et ont été approuvées par la protection des animaux et utilisation Comité (ACUC) au NIH/NIEHS, Animal protocole 2010-0004.
1. les préparatifs
- Préparer/achat recombinants non multiplication lentivirus portant votre gène d’intérêt. Dans cette étude, lentivirus SBI511 exprimant la protéine fluorescente verte copépode (copGFP ; en abrégé GFP) d’un allongement promoteur de facteur 1 a a été utilisé pour la transduction. 2 ont été utilisés pour produ....
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Résultats
Développement des oeufs de souris isolé/transduites fécondée peut être vérifiée au microscope par jour (Figure 1). Santé des embryons se développent en blastocyste en 3 à 4 jours. Dans ce protocole, 60 à 70 % des embryons non traités développent en blastocyste23. Hors 114 perforé laser transduits embryons, 54 devenue blastocyste (taux de 47 %) et 46 blastocystes exprimé GFP (46/54 = 85 %)23.
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Discussion
La capacité des lentivirus à intégrer dans leur génome de l’hôte rend un vecteur idéal pour la livraison de gène stable. Vecteurs LENTIVIRAUX peuvent transporter jusqu'à 8,5 kilobases paire (kbp) du matériel génétique pouvant accueillir les promoteurs spécifiques des cellules ou inductibles, marqueurs de sélection ou moitiés fluorescents. Constituée de matériel génomique peut répliquer dans le cadre de leur génome de l’hôte et réglementé pour exprimer ou désactiver aux moments souhaités. Ces vecteurs permettent la maîtri.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros du National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Nous sommes reconnaissants à m. Robert Petrovich et le Dr Jason Williams pour une lecture critique du manuscrit et conseils utiles. Nous tenons aussi à remercier Dr. Bernd Gloss, le noyau Knockout, le Flow Cytometry Facility, la microscopie de Fluorescence et centre d’imagerie et les installations de la direction générale de la médecine Comparative du NIEHS pour leurs contributions techniques. Nous tenons à remercier M. David Goulding de la branche de médecine Comparative et Mme Lois Wyrick le cent....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plasmide CD510B-1 | System Biosciences | CD510B-1 | utilisé pour emballer le lentivirus exprimant EF1a-copGFP |
| Diméthylpolysiloxane | Sigma | DMPS5X | culture d’embryons |
| hyaluronidase | Sigma | H3506 | utilisé pour éliminer les cellules |
| cumulus XYClone Laser | Hamilton Thorne Biosciences | perforant des œufs | |
| fécondés de sourisDispositif de transfert non chirurgical d’embryons (NSET) | ParaTechs | 60010 | NSET d’embryons |
| KSOM moyen | Millipore | MR-020P-5F | culture d’embryons |
| Composition de KSOM : | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18.5 | ||
| KH2PO4 | 4.75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4.95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glucose | 3.6 | ||
| Na-Pyruvate | 2.2 | ||
| DL-Acide lactique, sel | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µ ; L | ||
| Streptomycine | 5 | ||
| Pénicilline | 6.3 | ||
| 0.5 % rouge | 0.1mL | ||
| L-Glutamine | 14.6 | ||
| MEM Acides | 1mL | ||
| MEM Non essentiel AA | 0.5mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 moyen | Millipore | MR-015-D | culture d’embryons |
| Composition de M2 : | mg/100mL | ||
| Chlorure | 25.1 | ||
| Sulfate de magnésium (anhydre) | 16.5 | ||
| Chlorure | 35.6 | ||
| Phosphate de potassium monobasique | 16.2 | ||
| Bicarbonate | 35 | ||
| Chlorure | 553.2 | ||
| Albumine | 400 | ||
| D-glucose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54.3 | ||
| Rouge | 1.1 | ||
| Acide | 3.6 | ||
| DL-Acide | 295 |
Références
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., ....
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Réimpressions et autorisations
