Un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR)

Summary

Nous présentons ici la chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR), une méthode pour multiplexer facilement gRNA vecteurs pour les approches de CRISPR/Cas9. STAgR rend gRNA multiplexage simple, efficace et personnalisable.

Abstract

Le système CRISPR/Cas9 bactérien a considérablement augmenté les options méthodologiques pour les scientifiques de la vie. En raison de son utilisation, génie génétique et génomique est devenue applicable à un large éventail de systèmes. En outre, bon nombre de transcriptional et épigénomique approches techniques sont maintenant généralement réalisables pour la première fois. Une des raisons pour l’applicabilité large de CRISPR tient à sa nature bipartite. Petits gRNAs déterminer les cibles génomiques du complexe et variantes de la protéine Cas9 les conséquences moléculaires les. Cependant, beaucoup d’approches CRISPR dépendre de l’exécution simultanée de multiples gRNAs dans des cellules individuelles. Ici, nous présentons un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR), une méthode qui permet la génération simple, rapide et efficace de gRNA multiplexé des vecteurs d’expression dans un clonage unique étape. STAgR est rentable, étant donné que (dans le présent protocole) les séquences individuelles de ciblage sont introduites par des amorces de porte-à-faux courts tandis que les modèles d’ADN longs les gRNA des cassettes d’expression peuvent être réutilisés plusieurs fois. De plus, STAgR permet d’incorporation seule étape d’un grand nombre de gRNAs, ainsi que des combinaisons de gRNA différentes variantes, les vecteurs et les promoteurs.

Introduction

Chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR) est une méthode permettant la génération de nuit efficace des vecteurs d’expression contenant plusieurs gRNA expression cassettes dans un clonage unique étape. Le protocole de STAgR ne dépend pas de compétences spécialisées ou matériaux et offre plusieurs options pour la personnalisation.

La protéine bactérienne de CRISPR Cas9 a une capacité unique. Il est capable de trouver et de lier sélectivement seulement ces séquences d’ADN encodés en crRNAs naturelle ou ingénierie gRNAs¹. Son utilisation comme outil moléculaire a permis à un grand nombre d’approches qui ont été impossible, irréalisable ou seulement limité à certains modèles cellulaires, jusqu'à une date récente. Il s’agit de mutations de gène ciblé², génie de génome³, épigénome édition^4,5,6, activation de la transcription et gene silencing^7,8. Car autant que nous sachions que Crispr est universellement déployable, comme les rapports d’application existe pour un large éventail de sites cibles, des espèces et des types de cellules. Cependant, beaucoup d’applications CRISPR dépendre directement ou indirectement sur la livraison de gRNAs multiples, y compris une série de manipulations génomiques (translocations^9,10, moyen¹¹ et altérations génomique à grande échelle ^{12 ,} ( ¹³), génie de génome (utilisation de Cas9 nickases¹⁴), génération d’allèles conditionnelle^11,15 ou¹⁶de la série de mutations et de suivi des stratégies¹⁷. En outre, d’autres approches (transcription ingénierie¹⁸, épigénome ingénierie^19,20) plusieurs sites de ciblage ne sont pas strictement obligatoire, cependant qu’ils atteignent leur maximum d’effet souvent uniquement en vertu du présent condition.

Plusieurs méthodes utiles ont été décrites pour générer des vecteurs gRNA contenant plus d’un gRNA expression cassette^{21,22,23,24,25,26, 27}. Nous présentons ici un protocole pour STAgR, chaîne Assemblée gRNA clonage, qui est remarquable dans sa combinaison de simplicité et de vitesse (pendant la nuit qu’une seule étape de clonage est requise), faible coût (comme modèles d’ADN peuvent être réutilisés plusieurs fois), personnalisation (pour gRNA différents systèmes et promoteurs) et de l’efficacité (il permet la génération des vecteurs contenant un nombre élevé de cassettes gRNA)²⁸.

STAgR peut, en principe, être utilisé pour générer des vecteurs d’expression avec quelques (1 – 2 gRNAs), plusieurs (3 à 5 gRNAs) et certains du plus grand nombre de cassettes d’expression signalé jusqu’ici (6 – 8 gRNAs)²⁸. De même, STAgR est applicable pour toute séquence gRNA, la colonne vertébrale ou le promoteur. Depuis cependant, STAgR repose principalement sur les réactions en chaîne par polymérase (PCR) et l’Assemblée Gibson, gRNAs avec des similitudes de séquences haute doit être généré à l’aide d’une méthode alternative.

Protocol

1. conception de STAgR stratégie de clonage

1. Décider sur combien gRNA cassettes seront inclus dans le vecteur d’une expression et dans quel ordre. Déterminer les promoteurs et les gRNA échafaudages doivent servir à chacun du gRNAs. Concevoir le gRNAs en utilisant n’importe quel outil en ligne (p. ex., www.benchling.com).

2. conception de STAgR clonage des amorces avec porte-à-faux

Remarque : La séquence de protospacer sens de la dernière gRNA et l’anti-sens de la première gRNA sont respectivement ajoutés pour les amorces PCR utilisées pour l’amplification de l’épine dorsale du vecteur (Figure 1). Les séquences restantes sont amplifiées des cordes, attachant ainsi le sens et antisens gRNAs dans l’ordre souhaité. La première chaîne morceau est amplifié avec un primer avant contenant la première gRNA N20 séquence sous un surplomb et un apprêt inverse avec la deuxième gRNA N20 séquence (complément inverse) sous un surplomb. Toutes les pièces suivantes sont générées en conséquence.

1. Ajouter des séquences gRNA N20 pour les amorces avant amplification pour chaîne d’ADN de STAgR que surplombe (tableau 1). Ajouter sens gRNA des séquences 5' à l’apprêt avant « EFC-FP » (pour les échafauds classiques) ou « sam-FP » (pour les échafauds contenant MS2). Des amorces FP recuisent à la partie de l’échafaudage/MS2 de la chaîne de STAgR respectif (Figure 1).
2. Ajouter le complément inverse N20 gRNA séquence aux séquences d’amorce de marche arrière. Le choix des amorces RP selon les promoteurs spécifiques et les cordes utilisées (RP-hU6, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).

3. génération de clonage de Fragments de STAgR

1. Pour générer les fragments individuels de clonage pour Assemblée de Gibson, effectuer PCRs en mettant en place 10 µL de tampon de haute fidélité (HF), 1 µL de 10 mM dNTPs, 0,25 µL de surplomb-primer (100 µM), 10 ng de la polymérase ADN modèle (chaîne ou vecteur), 0,5 µL HF , 1,5 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajouter H₂O pour faire un volume final de 50 µL.
   Remarque : Utilisez le plasmide « STAgR_Neo » comme modèle pour la colonne vertébrale PCR d’incorporer l’échafaud gRNA à la dernière gRNA, si l'on choisit le Scaffold SAM, utilisez « STAgR_SAM ». Pour un plasmide STAgR avec gRNA six cassettes par exemple, six RFT est nécessaires, que cinq avec l’ADN des chaînes comme modèles et l’autre avec l’épine dorsale du vecteur comme modèle.
2. Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 98 ° C pendant 1 min 30 s ; 38 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 59 ° C (pour échafaudage gRNA) / 68 ° C (pour la boucle de SAM) pendant 10 s, 72 ° C pendant 30 s (pour les insertions) / 1 min 30 s (des vecteurs) ; 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min.
3. Enlever 5.5 µL de la réaction PCR, ajoutez le colorant de chargement et d’analyser les fragments amplifiés sur un gel d’agarose à 1 %. Charge une échelle d’ADN appropriée pour dimensionnement (100 bp échelle/1 kb DNA échelle d’ADN) et exécuter le gel dans une gestion appropriée de gel tampon (par exemple, buffer TLE) à 120 V pendant 30 min.
4. Lorsque le gel est en marche, ajouter 5 µL de la mémoire tampon fournie avec l’enzyme de restriction et de 0,5 µL DpnI (10 unités) de la réaction de PCR 44,5 µL restante et laisser incuber 30 min à 1 h à 37 ° C.
5. Effectuer la purification de l’ADN à l’aide de billes magnétiques.
   1. Ajouter 1,8 billes magnétiques µL par 1 µL du produit PCR et mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).
   2. Séparer les perles et les fragments d’ADN de liquide résiduel avec un aimant. Laver les perles deux fois avec l’éthanol à 70 % en rinçant le culot sans resuspendant complètement.
   3. Retirer tout l’éthanol avec une pipette et laissez le pellet air sec.
   4. Dissoudre le culot dans 15 à 20 µL H₂O de pipetage de haut en bas et séparer les perles du liquide à l’aide d’un aimant. Transférer le liquide clair surnageant dans un nouveau tube.
      Remarque : Par ailleurs, kits de nettoyage basée sur les colonnes de réaction peuvent être utilisés.
6. Déterminer les concentrations d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre comme décrit ailleurs²⁹.

4. Gibson Assemblée réaction et Transformation bactérienne

Remarque : Les étapes suivantes sont adaptées de Gibson et al. ³⁰.

1. Préparer une maison Gibson réaction mélanger ou utiliser un kit clonage commercial de Gibson.
   1. Mélanger 3 mL de 1 M Tris (Tris (hydroxyméthyl) aminométhane)-HCl pH 7.5, 300 µL de 60 µL de (dCTP) 100 mM, 60 µL de dATP 100 mM (adénosine triphosphate), 1 M MgCl, 60 µL de dTTP 100 mM (désoxythymidine triphosphate), 60 µL de 100 mM dGTP (désoxyguanosine triphosphate) désoxycytidine triphosphate), 300 µL de 1 M DTT (dithiothréitol), 1,5 g de PEG-8000 (polyéthylène glycol), 300 µL de 100 mM NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) et ajouter H₂O pour obtenir 6 mL de tampon de réaction isotherme × 5.
      Remarque : Aliquoté tampon peut être stocké à-20 ° C pendant au moins 12 mois.
   2. Pour le maître de l’Assemblée de Gibson mélanger, combiner 320 µL de tampon de réaction isotherme 5 x 697 µL d’H₂O et ajouter 3 µL de 10 U/µL T5 exonucléase, 20 µL de 2 U/µL ADN polymérase et 160 µL de 40 U/µL Taq DNA ligase.
      Remarque : Ce mélange peut être aliquotés et congelés à-20 ° C pendant au moins 12 mois.
2. Utilisez 7,5 µL du mélange maître Assemblée avec 2,5 µL d’insertion et de vecteur. Pour une réaction x STAgR 2 utilisez un vecteur molaire pour insérer le ratio de 1:1 mais pas plus de 0,2 pmol d’ADN au total. Pour plus de 2 cassettes d’expression gRNA, utilise un vecteur d’insérer le rapport de 1:3, mais ne dépassent pas un montant total de l’ADN de 0,5 pmol.
   Remarque : Toutes les cassettes d’expression amplifié gRNA doivent être utilisés en quantités équimoléculaires. Inclure un contrôle plasmidique avec la somme identique de vecteur mais aucune insertions au contrôle pour non digérés template vecteur (ou individu-ligature).
3. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 45 à 60 min. des échantillons de magasin sur la glace ou à-20 ° C pour transformation ultérieure.
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
4. Directement la moitié du mélange de transformer les bactéries compétentes chimiquement.
   1. Décongeler les bactéries TOP10 Escherichia coli chimiquement compétents sur la glace.
   2. Ajouter 5 µL du mélange Gibson à 50 µL de bactéries compétentes. Mélanger doucement en effleurant le fond du tube. Incuber sur glace pendant 30 min.
   3. Effectuer un choc thermique en plaçant le tube dans un bain d’eau de 42 ° C ou un bloc chauffant pour 45 s.
   4. Remettez les tubes sur glace. Ajouter 250 µL de milieu SOC pour les bactéries et les laisser récupérer à 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 30 à 45 min.
5. Après la restauration, de la plaque les bactéries transformées sur 1,5 % lysogénie bouillon (LB) boîtes de gélose contenant l’ampicilline (100 µg / mL) et incuber une nuit à 37 ° C.

5. sélection des Clones de STAgR par PCR sur colonie bactérienne

1. Préparer au moins deux séries de 200 tubes de réaction PCR µL (entre 3 et 24) pour chaque construction, qui sont étiquetés de manière identique.
2. Remplir un ensemble de 100 µL de milieu LB contenant 100µg / ampicilline mL.
3. Utiliser un embout de la pipette stérile à gratter de la matière biologique d’une colonie bactérienne et l’étaler au fond du tube de réaction de PCR 100 µL vide. Transférer immédiatement la pointe dans le deuxième tube de réaction correspondante contenant le milieu LB.
4. Agiter doucement la pointe autour d’assurer certaines des bactéries sont transférés aux médias LB et incuber à 37 ° C pour une utilisation ultérieure.
5. Mettre en place un mélange maître PCR (10 µL par réaction).
   1. 10 réactions, combinez 10 µL de tampon Taq , 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL d’apprêt (100 µM), 0,5 µL de la Taq polymérase et ajouter 100 µL de H₂O.
   2. Utiliser les amorces suivantes : StAgR_seq_fwd2 : ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev : TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
6. Ajouter 10 µL du mélange maître PCR dans les tubes de réaction PCR marqués sans les médias LB.
7. Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 94 ° C pendant 5 min, 38 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min ; 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min.
   NOTE : Temps d’élongation (72 ° C étape) devrait être augmenté avec le nombre de cassettes d’expression gRNA. Calculer la taille théorique d’insertions à l’aide du tableau 2 et utilisez 1 min par 1 kb à 72 ° C.
8. Ajouter le colorant de chargement et d’analyser les fragments amplifiés sur un gel d’agarose à 1 %. Charger une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement (1Ko échelle d’ADN) et exécutez le gel approprié en exécutant tampon (par exemple, Buffer TLE) à 120 V pendant 30 min.
9. Calculez la taille théorique de l’amplicon avec l’aide du tableau 2 en additionnant les montants individuels des promoteurs usagés, gRNA échafaudages et nombre de séquences de la N20. Les résultats de la PCR sur colonie, identifier les clones bactériens basées sur la taille de la bande de fréquences correcte et s’ils sont susceptibles de port corrects vecteurs.
10. Ensemencer une 2,5 mL nuit LB (avec 100 ampicilline µg/mL) avec la culture correspondante de 100 µL, mises en place plus tôt. Incuber à 37 ° C pendant 12 h.
11. Extraire l’ADN de plasmide utilisant un kit de mini plasmide commerciale et d’instructions du fabricant³¹.
12. Séquencer les plasmides en utilisant les amorces suivantes : StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) et StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) par séquençage Sanger.

Results

Suivant le protocole en question fait la génération personnalisée multiplexage gRNA vecteurs possibles (Figure 1). Les résultats représentatifs des approches STAgR à l’aide de six différents gRNA cassettes sont représentés dans la Figure 2. Figure 2 A montre un résultat typique des PCR permet d’obtenir les pièces de STAgR (protocole de 3.1 à 3.3). Les six amplicons (BB, S1-S5) représentent des morceaux de l’ADN linéaire contenant les séquences individuelles gRNA N20 sur leurs extrémités. Le squelette plasmidique (BB) est maintenant étendu avec des séquences ciblage de gRNA1 et gRNA6 et possède donc les chevauchements nécessaires aux deux autres PCRs (S1 et S5) pour l’assemblage de Gibson (Figure 2A, tableau 3). Après purification, un rendement d’ADN d’au moins 1 microgramme de vecteurs et d’inserts est possible.

Après le montage de Gibson, transformation bactérienne devrait se traduire par des colonies bactériennes de 100 à 700. Figure 2 B montre une analyse représentative de 10 colonies bactériennes par colonie PCR, suite à un protocole de STAgR avec six gRNA cassettes. Électrophorèse sur gel indique que les trois clones la taille attendue amplicon pour montage complet (tableau 2). Autres clones probablement reçu STAgR vecteurs contenant d’un à cinq gRNA cassettes, considérant qu’un clone (Figure 2B, n ° 18) est vide.

Figure 1 : Vue d’ensemble de la conception d’amorce STAgR. Premier nombre gRNA ainsi que les échafaudages sont choisis, puis gRNA ordre et promoteur et en dernier, quel type de vecteur doit être utilisé. Pour chaque gRNA, une amorce spécifique vers l’avant avec la gRNA ciblant la séquence en orientation de sens et de la partie commune de « EFC-FP » ou « sam-FP » a été conçue. De même, pour générer l’abécédaire individuel inverse la séquence correspondante (RP) est fusionnée avec le complément inverse de la séquence de la N20 de la prochaine gRNA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultats représentatifs des approches STAgR à l’aide de six cassettes différentes gRNA. (A) exemple représentatif d’une PCR de cinq insertions ainsi que le vecteur STAgR_Tomato. (B) les PCR de colonie d’un 6 x réaction STAgR à l’aide de promoteurs hU6 et mU6 et gRNA canonique ainsi que les échafaudages de SAM. 22 colonies bactériennes ont été analysées, dont 7 ont montré la bande attendue indiquant l’ensemble complet. Échelle : 1 Ko de plus, nombre de paires de bases (pb). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Transmettre l’apprêt pour chaîne et vecteur
scaffold_fwd	GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
SAM_fwd	GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG
Inverser l’amorce pour la chaîne et le vecteur
hU6_rev	CGGTGTTTCGTCCTTT
mU6_rev	CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG
hH1_rev	CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA
h7SK_rev	CCGAGGTACCCAAGCGG

Tableau 1 : Séquences d’amorces pour les échafaudages gRNA et promoteurs.

Tailles des promoteurs et des échafaudages.
hU6	265 bp
hH1	225 bp
mU6	316 bp
h7SK	245 bp
gRNA échafaudage	83 bp
SAMloop + gRNA d’échafaudage	143 bp

Tableau 2 : Taille théorique de chaque cassette d’expression pour calculer les résultats PCR de colonie.

	hU6	hH1	mU6	h7SK	STAgR_Neo	STAgR_tdTomato
gRNA Scf	400 bp	360 bp	451 bp	380 bp	3722 bp	4487 bp
SAM	460 bp	420 bp	511 bp	440 bp	-	-

Tableau 3 : Grandeurs de promoteurs et d’échafaudages.

	hU6	hH1	mU6	h7SK	STAgR_Neo	STAgR_tdTomato
gRNA Scf	368 bp	328 bp	419 bp	348 bp	+ 74 bp	+ 67 bp
SAM	428 bp	388 bp	479 bp	408 bp

Tableau 4 : Dimensions calculées de STAgR pièces après PCR.

Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour STAgR ce qui permet la génération simple et rapide des plasmides d’expression gRNA de différentes tailles. Ce protocole peut être utilisé pour la production d’une étape de plasmides gRNA avec cassettes d’expression gRNA 2 – 8 (avec ou sans deux ARN MS2 Aptamères) dans le vecteur d’expression gRNA STAgR_Neo et l’utilisation de U6 humain, souris U6, 7sK humaine et humains H1 promoteurs^{28 ,32,33}. Si vous désirez plus de quatre cassettes, il est recommandé d’utiliser au moins deux types différents de promoteur/échafaudage pour accroître l’efficacité. Autres vecteurs, promoteurs et combinaisons du promoteur ainsi que plus de 8 cassettes gRNA pourraient être possibles aussi bien ; Toutefois, cela n’a pas été testé. Bien que dans notre expérience, que la méthode fonctionne de façon fiable et reproductible, nous avons déterminé les étapes critiques et stratégies de dépannage le résultat attendu pas immédiatement en cas de. Dans notre expérience certaines étapes jouent un rôle essentiel pour la réussite de la démarche : tout d’abord, il est important d’utiliser les rapports molaires correctes des inserts à l’épine dorsale de vecteur à l’étape d’assemblage Gibson (3:1). Cependant, nous avons remarqué que pour certains ensembles gRNA un ratio de 1:1 d’inserts à vector est bénéfique, même lorsque le nombre de cassette gRNA ne dépasse pas deux. Deuxièmement, la période de la réaction de l’Assemblée de Gibson devrait être suffisamment longue (au moins 45 min recommandé).

STAgR peut être utilisé avec un grand nombre de modifications. Ciblage des séquences, gRNA numéros et les échafaudages, les promoteurs et les backbones vecteur peuvent être personnalisés et librement combinées. Toutefois, chaque combinaison peut-être avoir des exigences légèrement différentes. Dans notre expérience, si moyen ou élevé nombre de cassettes gRNA (> 4) sont désiré mais pas obtenu immédiatement, généralement le meilleur moyen de surmonter ce problème est de changer l’ordre des cassettes gRNA individuels dans le vecteur. De même, combinant gRNA différents promoteurs et échafaudages améliore l’efficacité (et donc diminue le nombre requis de colonie PCRs qui doivent être marqués) quand plusieurs cassettes gRNA sont clonés. Nous avons constaté que des clones incorrectes sont habituellement générés par la conjonction spontanée de séquences répétées lors de l’assemblage de Gibson. Même si cela peut réduire l’efficacité de la méthode, cela se traduit également par la production simultanée de vecteurs avec de sous-ensembles fonctionnels gRNA²⁸.

Génération du multiplexage gRNA vecteurs contenant plus d’une cassette d’expression gRNA a signalé un certain nombre de différentes méthodes^{21,22,23,24,25, 26,27}. Tandis que certains emploient simultanée ou séquentielle de clonage de gRNA paires^22,34, d’autres dépendent de Golden Gate Assemblée et plusieurs séquentielle clonage étapes^25,35. Une approche particulière a été utilisée par Xie et al., en employant le système traitement tRNA endogène cellulaire pour couper plusieurs gRNAs sur un unique ancêtre transcription³⁶. L’advangetage de cette méthode est l’exigence d’un seul promoteur ; l’inconvénient est la nécessité de fragments d’ADN nouvellement synthétisées pour chaque combinaison de gRNA. Chaque gRNA multiplexage méthode a ses avantages et inconvénients ; STAgR alliant simplicité et efficacité, un nombre élevé de cassettes gRNA possible à faible coût.

STAgR (et autres systèmes de multiplexage) sera probablement joué un rôle important en permettant aux perturbations efficace (et simultanée) de gènes multiples in vivo, comme un pionnier dans le poisson-zèbre cerveaux²⁸. Une autre application future des vecteurs de multiplexage gRNA est la promesse pour la manipulation des programmes complets de transcriptional contrairement à l’induction ou la répression d’un simple gène. Probablement, ces approches permettra de transformer des cellules et des organes à vont à un degré beaucoup plus élevé qu’il est possible aujourd'hui.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymérase	NEB	M0530L	Polymérase pour Gibson Master Mix ainsi que pour toutes les PCR
dNTPs	Life Technology	R0191	dNTP pour toutes les PCR
dATP	Life Technology	R0141	dNTP pour Gibson Master Mix
dCTP	Life Technology	R0151	dNTP pour Gibson Master Mix
dGTP	Life Technology	R0161	dNTP pour Gibson Master Mix
dTTP	Life Technology	R0171	dNTP pour Gibson Master Mix
Agarose	VWR	443666A
DpnI	NEB	R0176S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	pour nettoyage de l’ADN
Tris HCL	Roth	9090.2	pour Gibson Master Mix
DTT	Life Technology	R0861	pour Gibson Master Mix
PEG 8000	VWR	RC-077	pour Gibson Master Mix
NAD	Cayman Chemicals Company	16077	pour Gibson Master Mix
T5 Exonucléase	NEB	M0363S	pour Gibson Master Mix
Taq DNA Ligase	NEB	M0208S	pour Gibson Master Mix
Ampicilin	SigmaAldrich	PHR1393-1G
Échelle d’ADN 1 kb Plus	Thermo Scientific	SM0311
		plasmide et d’amorce	Toutes les séquences sont disponibles sur Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).
EDTA	PanReacAppliChem	6381-92-6	pour tampon TLE
MgCl2	SigmaAldrich	M8266	pour Gibson Master Mix
Top10 bactéries chimiquement compétentes	Thermo Scientific	C404003
S.O.C. Medium	Thermo Scientific	15544034
Extrait de levure	SigmaAldrich	Y1625	pour bouillon lysogénique (LB Media)
NaCl	SigmaAldrich	S7653	pour bouillon lysogénique (LB Media)
Peptone	SigmaAldrich	91249	pour bouillon lysogénique (LB Media)
Agar-Agar	SigmaAldrich	5040	pour bouillon lysogénique (LB Media)
Taq DNA Polymerase	Quiagen	201203