Mise en place et l’analyse de la tumeur tranche Explants comme une condition préalable à des tests de Diagnostic

Résumé

Nous fournissons une méthode pour la génération, la culture et l’analyse systématique des tranches organotypique dérivées de tumeurs pulmonaires murine. Nous décrivons également comment optimiser pour l’épaisseur de la tranche et comment sélectionner des concentrations du médicament pour traiter les tranches de la tumeur.

Résumé

Cultures d’explants de tissu primaire organotypique, qui comprennent des tranches de coupe de précision, représentent l’architecture tridimensionnelle (3d) tissus ainsi que les interactions multicellulaires de tissu native. Tranches de tissus provoquer la coupure immédiate de tumeurs réséquées fraîchement préservent les aspects spatiaux de l’hétérogénéité de l’intratumor, ce qui les rend utiles substituts de in vivo de la biologie. Attention, optimisation des conditions de préparation et de la culture tranche tissulaire est fondamentale pour le potentiel de diagnostic prédictif de tumeur tranche des explants. À cet égard, les modèles murins sont précieuses, car elles fournissent un flux cohérent de matériel tumoral pour effectuer de répliquer et expériences reproductibles. Ce protocole décrit la mise en culture des tranches de tissu dérivées de tumeurs de poumon murine en utilisant une unité d’incubation tournante, un système qui permet une exposition intermittente des tissus à l’oxygène et de nutriments. Nos travaux antérieurs ont montré que l’utilisation des unités de l’incubation en rotation améliore la viabilité des tissus par rapport aux autres méthodes de culture, particulièrement flottant tranches et stagnante filtre prend en charge. Nous montrons ici, plus que l’épaisseur de la tranche influe sur la viabilité de tranches cultivées, ce qui suggère que l’optimisation de l’épaisseur de la tranche devrait être fait pour les types de tissus différents. Prononcez ITH en fonctions oncogéniques pertinentes, telles que la signalisation des activités, infiltration de cellules stromales ou l’expression de marqueurs de différenciation, nécessite des évaluations des tranches de tissus adjacents pour l’expression des marqueurs altérés par le traitement de la toxicomanie ou culture elle-même. En résumé, ce protocole décrit la génération de tranches de tumeur poumon murin et leur culture sur une unité rotative d’incubation et montre comment les tranches devraient être systématiquement analysés pour l’expression des marqueurs de tissu hétérogène, comme une condition sine qua non avant les études de drogue de réponse.

Introduction

Tissus de tumeurs solides, y compris le cancer du poumon, présentent une hétérogénéité génétique et phénotypique et hébergent des micro-environnements complexe^1,2. L’interaction entre les cellules tumorales et leur influence microenvironnement environnants sur drogues mécanismes de sensibilité et résistance³. Cela met en évidence la nécessité pour les modèles précliniques qui peuvent modéliser avec précision la complexité biologique et fonctions agissant dans les tumeurs natives. Précision de coupe tranches immédiatement dérivées de tumeurs fraîches constituent une ressource unique, car ils ont une capacité principale pour représenter en vivo biologie, au moins pour une courte fenêtre de temps, y compris les phénotypes spatialement distribuées dans une tumeur individuelle. Réséqués tumeurs cliniques sont l’un des quelques spécimens personnalisés peuvent être obtenus par un patient atteint de cancer, et leur usage diagnostique mérite un examen.

L’histoire de l’organotypique cultures remonte au début du 19^e siècle, lorsque les tumeurs intracrâniennes humaines étaient taillés à la main en morceaux de tissus et d’élevage à l’aide de ce qu’on appelle pendaison méthode drop. Fragments de tissus étaient attachés à un lamelle couvre-objet et autorisés à puiser dans hépariné plasma humain, après quoi les lamelles ont été inversés, scellés et cultivées pendant plusieurs semaines⁴. Découper manuellement tumeur morceaux ont été cultivées en utilisant une variété d’autres méthodes, telles que les caillots plasma⁵, dans des milieux liquides⁶, ou sur 0,45 µm de porosité de filtres de taille⁶. Le terme « organotypic » a été tout d’abord utilisé en 1954, dans une étude sur la différenciation rétinienne du poussin embryon œil⁷. Elle a été suivie d’études qui utilisaient des explants de tissus pulmonaires et cardiaques dérivées d' embryons de poussins⁸et des explants de cerveau de rats adultes⁹.

Tranchage de diverses méthodes ont été décrites, à savoir manuel choppers^10,11, Krumdieck tissu trancheuse^12,13et vibratomes^{11,14,15, 16}. La coupeuse de tissu Krumdieck génère des noyaux de tissu cylindrique, qui est ensuite coupées en tranches de tissu circulaire à l’aide d’un microtome. Un vibratome, en revanche, utilise un microtome de lame vibrante. Dans une étude sur les tranches de foie, il a été démontré que le vibratome Leica génère plusieurs sections reproductibles et cohérentes par rapport à la Krumdieck trancheuse¹⁵. Épaisseur de tranche allant de 250 à 500 µm ont été utilisés, et études font état de maintien de la viabilité et les caractéristiques morphologiques même jusqu'à 16 jours^14,10,17,18. Cependant, les tumeurs ont des profils métaboliques variables pouvant affecter les besoins en éléments nutritifs et paramètres tels que la rigidité et la matrice de composition du tissu peuvent influer sur l’aération et flux des éléments nutritifs. Il est donc probable que chaque type de tissu nécessite optimisation des conditions de tranchage et de la culture.

Méthodes culturales différentes ont été utilisées pour soutenir les cultures tranche : J’ai) culture stationnaire interphase, aussi appelée support stagnante culture dans lesquels les tranches sont placés sur le dessus un insert membrane poreuse semi immergé dans le milieu de culture. À cet égard, le haut des tranches est exposé à l’air, tandis que le fond est additionné de nutriments via l’insertion poreux^14,19; II) la méthode de la truelle, développée à l’origine d’organes entiers de la culture ou des tranches de tissu embryonnaire. À cet égard, tranches sont placés sur le dessus un drap en coton ou un filtre pris en charge par une grille en métal, et le filtre est trempé dans le milieu de culture. Pour garder les tissus humides, une mince couche de médium est ajoutée sur le dessus les tranches de^20,21,22. Ces deux premiers est soi-disant cultures interphase air liquide ; III) rouleau tube cultures, où tranches sont placées dans le côté plat d’un tube en plastique contenant le support, et rotation lente tube veille à ce que le tissu est recouvert de moyenne pendant la première partie d’un cycle, ou aéré pendant le deuxième²³; IV) unités d’incubation tournante, dans lesquelles les tranches sont exposés par intermittence au milieu avec les nutriments et l’aération. Différent de tubes roulés, dans cette méthode tranches sont placés sur le dessus de titane poreux grilles placées dans des boîtes de 6 puits avec milieu de culture²⁴.

Tranches de tissus provenant de tumeurs solides réséquées logiquement présentes un modèle attrayant ex vivo permettant de tester la réponse au traitement des agents anticancéreux, car ils permettent l’évaluation de la viabilité, ciblé l’activité parcours et profils moléculaires d’une tumeur spécifique en présence de son microenvironnement tumeur native. Toutefois, afin de déterminer si les réponses de drogue mesurées dans des tranches de tumeur sont prédictifs d’in situ les réponses, il est important de déterminer dans quelles mesure tissu tranches préserver spécifique des fonctions biologiques telles que la prolifération des cellules, la différenciation des cellules spécifiques histopathologie ou activités de signalisation oncogéniques. L’impact des contraintes mécaniques induites au cours de la préparation de tranche, tranche manutention ou adaptations induites par la culture sur la qualité et les fonctions biologiques des tranches de tissus sont des questions fondamentales, étroitement liées à la capacité de mettre en œuvre dérivées de tumeurs tranches pour diagnostic fonctionnel.

Notre projet de consortium financé par IMI PREDECT (http://www.predect.eu) énonce à l’adresse systématiquement ces questions fondamentales, en étudiant les explants tranche d’une variété de sources. En utilisant des tranches dérivés des modèles de cancer du sein, la prostate et du poumon, cet effort commun utilisé afficheurs qualitatives ainsi que quantitative hématoxyline et lectures d’éosine (H & E) - basé pour démontrer une exigence pour l’oxygène atmosphérique et filtre stagnante supports pour maintenir la viabilité des tranches cultivés jusqu'à 72 h. En outre, analyses d’immunohistochimie (IHC) sur des tranches a révélé des gradients de viabilité intra-tranche, mis en évidence que les gradients de nécrose en tranches provenant de souris non à petites cellules cancer du poumon (NSCLC), récepteurs de œstrogènes (ER), HIF1α et γH2AX ²⁵tranches de dégradés dans des tranches de cancer du sein, ou androgènes récepteurs (AR) expression dégradés dans le cancer de la prostate. Fait intéressant, les gradients de viabilité intra-tranche dans les cultures de 24h de NSCLC murin ont été secourus par culture dans une unité rotative d’incubation, et notre étude récente a montré que la viabilité a été étendue à 72 h²⁶. Particulièrement le côté supérieur est resté plus viable²⁶, soutenant que les analyses de réaction de drogue sur les tranches soient effectuées mieux sur ce côté du tissu.

Même s’il reste une question quant à la façon loin tranches de tissus peuvent récapituler in situ les fonctions de la tumeur, ils ont été largement utilisés pour tester les réactions aux agents anticancéreux, y compris les médicaments ciblés, des anticorps monoclonaux et des agents de chimiothérapie ^{10,11,13,14,18,27}. Nous avons montré récemment que murins tranches NSCLC montrent des changements dynamiques dans la prolifération et tranches d’oncogènes activités signalisation après culture comparativement pour fraîchement coupé 0 h²⁶. Cela indique qu’il est important d’examiner si les fonctions biologiques ciblés in situ sont correctement conservées pendant la culture, avant les études de perturbation. Malgré ces constatations, nous avons montré que les tranches de tumeur peuvent modéliser réponse spatiale aux thérapies ciblées, au milieu de la drogue traitements restent brèves (24h) et sont initiées au début de la mise en culture²⁶. Le protocole suivant décrit les aspects importants de validation à la mise en place et l’analyse des cultures de tranche de tumeur, avant leur application dans le dépistage des drogues pharmacologiques.

Protocole

Toutes les expériences de souris décrits dans cette étude ont été réalisés en suivant les lignes directrices de la Conseil National finlandais de Animal Experimentation et ont été approuvés par le Comité des animaux expérimentaux de l’Université d’Helsinki et de l’État Provincial Bureau du sud de la Finlande (licence numéro ESAVI/9752/04.10.07/2015).

1. les préparations avant tranchage

1. Préparez les matériaux suivants : vibratome porte-échantillon, vibratome tampon plaque de culture de 10 cm, plaque 24 puits, pipette 10 mL, plateau, garçon de pipette, sac à déchets, 70 % EtOH dans un tube de 50 mL pour désinfecter les instruments et la colle tissu.
2. Préparer le vibratome : essuyer le porte-lame avec 70 % EtOH, fixez une lame neuve et réaliser un dispositif vibrocheck conformément aux instructions fournies dans le manuel (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
   Remarque : Il est important d’effectuer l’étape du dispositif vibrocheck, car il réduit au minimum la déviation verticale de la lame et assure des tranches de bonne qualité.
3. Remplir chaque puits de la plaque 24 puits avec 1 mL de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) additionné de 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine (HBSS + P/S) ; maintenir la plaque sur la glace.
4. Préparer le milieu de culture de F12 additionné de 100 U/mL la pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, glutamax de 2 mM, 22 mM de glucose et 10 % sérum fœtal (SVF).
   NOTE : Tranche milieu de culture et de facteur de croissance des suppléments de tumeur peuvent varier selon le tissu de tumeur²⁵.
5. Préparer la quantité nécessaire de F12 moyen pour le traitement de la toxicomanie, à l’aide de la même composition, comme indiqué au point 1.4, mais en omettant la FBS.
   Remarque : Étant donné que les facteurs de croissance dans le sérum peut affecter la signalisation oncogènes dans les tranches, un milieu sans sérum est recommandé pour études de perturbation à court terme drogue sur des tranches de la tumeur. Si les cultures de tranche à long terme sont analysés, il est important d’abord évaluer l’effet du milieu sans sérum sur la viabilité des tissus et l’expression de marqueur tumoral spécifique dans les cultures non traitées tranche.

2. perception des poumons avec tumeur

1. Euthanasier une souris de tumeur-roulement par dislocation cervicale quand il montre des symptômes de la respiration difficile et perte de poids.
   NOTE : CO₂-médiation d’euthanasie est connue pour induire des conditions hypoxiques dans les poumons, qui peuvent avoir un effet sur la viabilité de la tranche ou oncogènes activités par le biais de susciter une réponse à l’hypoxie.
2. Étirer la souris euthanasiée sur un couvercle de styromousse en insérant des aiguilles 30 G à 4 pattes, pour que la poitrine est exposée.
3. Fend la peau de l’abdomen vers la poitrine et jusqu'à la région du cou. Ciel ouvert la cage thoracique et ensuite le diaphragme pour exposer les poumons et le cœur. Garder les ciseaux en position inclinée afin d’éviter des lésions tissulaires.
4. Disséquer les poumons avec tumeur avec le coeur et les placer dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de glacee HBSS + P/S ; maintenir le tube glacé et passer à l’étape suivante aussi rapidement que possible.
   NOTE : Retards dans le traitement des tumeurs du poumon peuvent modifier les fonctions oncogéniques, par exemple activités de la voie de signalisation.

3. génération de tranches de tumeur poumon de coupe de précision

1. Transférer les poumons avec tumeur HBSS + P/S dans une plaque de culture de tissu de 10 cm gardée à l’intérieur d’une hotte laminaire. Séparer les lobes du poumon à l’aide de pinces et ciseaux stériles et sélectionnez les lobes avec des tumeurs sur la surface à couper.
   NOTE : Tumeurs > 3 mm de taille ne conviennent pas pour le tranchage. Depuis les tissus pulmonaires normales entourant les compromis de grosse tumeur le découpage en raison des différences de rigidité des tissus, tissu tumoral subissant le tranchage doit être séparé loin les tissus normaux, tels qu’une région de tumeur défrichées fait face à la lame vibratome.
2. Générer une surface plate tissu de la pièce par une partie de la Coupe du tissu pulmonaire normale qui entoure la tumeur avec un scalpel stérile et plonger la lame plate dans une goutte de colle cyanoacrylate. Monter ce côté sur le porte-échantillon du vibratome sorte que la tumeur trouve la lame en position verticale. Laissez la colle sécher pendant 2 à 3 min.
   Remarque : Les tissus pulmonaires normales collées sur le porte-échantillon n’interfèrent pas avec la tumeur tissulaire tranchage et tranchage est arrêté avant d’atteindre le tissu normal. Le tissu tumoral se penche parfois à cause de la texture spongieuse du tissu pulmonaire normale collée sur le porte-échantillon, compromettre sa position verticale. Dans ce cas, coller un morceau de tissu de soutien supplémentaires pulmonaires normales à côté les tissus pulmonaires normales prémontés pour retenir la tumeur en position verticale (Figure 1 a iii).
3. Placez le porte-échantillon dans la cuve à tampon métallique et remplissez-le avec froid HBSS + P/S jusqu'à ce que le tissu est plongé dans la mémoire tampon. Placez le bac tampon métallique sur le bain de glace blanche et ajoutez la glace afin de refroidir le tissu tout en découpage.
4. Fixer la baignoire de glace blanche sur le vibratome. Sélectionnez les paramètres appropriés tranchage : amplitude allant de 2,5 à 2,8, découpage de vitesse entre 0,10-0,14 ms et une épaisseur de coupe allant de 160 – 250 µm.
   NOTE : Tranchage paramètres doivent être ajustés selon la dureté du tissu. Tissu dur est plus facile à trancher que les tissus plus doux et plus douces tissus nécessite trancher avec une vitesse plus faible (0,1 – 0,12 ms) et l’amplitude plus élevée (2,6-2,8). Une tumeur de grande 4 – 5 mm fournit généralement 15 à 20 tranches de 200 µM d’épaisseur. Pour la culture à court terme, les tumeurs murines peuvent être tranchés dans des conditions semi stériles à l’extérieur de la hotte laminaire. Cependant, tumeurs cliniques devraient toujours être tranchés à l’intérieur d’une classe II biosécurité laminaire des bois pour éviter l’exposition à des agents infectieux possibles dans le tissu humain.
5. À l’aide d’une pince stérile, recueillir les tranches dans 1 mL de HBSS dans puits séparés d’une plaque de 24 puits qui s’est tenue sur la glace, étroitement suivi de l’ordre dans lequel les tranches sont découpés en tranches. Marquez chaque puits de la plaque 24 puits selon le plan expérimental. Par exemple, mark séquentielle puits d’une plaque 24 puits comme points de temps de culture ou 0 h, contrôle du véhicule (C), drogues traitée (T) (Figure 1 b ii).
   Remarque : Ne pas déranger ou tirer le tissu de la tumeur tout en collectant une tranche, car cela modifiera l’orientation de la tumeur par rapport à l’angle de la lame, conduisant à des incohérences dans l’épaisseur des tranches ultérieures.
6. Lorsque toutes les tranches sont collectées, les transférer sur des grilles de titane (2-3 tranches par grille) placés dans la plaque de 6 puits contenant 2,5 mL de milieu de culture par puits. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne se forment entre la grille de titane et le milieu.
   1. Pour charger une tranche sur la grille, garder la plaque 6 puits en position inclinée afin qu’une partie du milieu recouvre la grille et placer la tranche dans le milieu de la grille ; utiliser forceps pour répandre la tranche si elle boucles. Charger les plaques 6 puits sur l’unité d’incubation rotatif placé dans un incubateur humidifié maintenu à 37 ° C avec l’air de 95 % et 5 % de CO₂et commencer le cycle de rotation (Figure 1 , i-ii).
      Remarque : Les grilles métalliques et les plaques 6 puits doivent être précisément poids équilibré avant d’allumer l’appareil rotatif. Il est important de placer les tranches dans le milieu de la grille afin qu’ils entièrement alternent entre l’air et les phases liquides pendant les cycles de rotation. Les tranches qui sont placés trop bas ou trop élevé ne sont pas convenablement exposés à l’oxygène ou de nutriments (Figure 1 j’ai), qui peuvent compromettre la viabilité des tissus. Il est important de suivre la position de la tranche sur la grille pendant la culture, comme la tranche peut parfois glisser vers le bas. Si cela se produit dans 1 à 2 h de l’apparition de la culture, corriger sa position et notez que cet exemple peut être endommagé. Les tranches qui sont mispositioned pour une longue période de temps devraient être jetés, comme la viabilité des tissus est significativement affectée par une mauvaise oxygénation et l’apport en nutriments.
7. Recueillir une tranche de tissus adjacente pour les tranches cultivés comme une 0 h, inculte, référence. Recueillir des tranches de référence au moins trois pour représenter le haut, milieu et au centre du tissu étant tranché. Difficulté du processus et tranches de 0 h immédiatement comme décrit en 5.1.
   Remarque : Si le nombre de tranches est limité, par exemple, si plusieurs traitements composés ou répétitions techniques sont effectuées, les comparaisons de chaque échantillon traité avec ses voisins échantillon 0 h peuvent être difficiles. Dans ce cas, utilisez la tranche de 0 h le plus proche (au moins 400 – 600 µm apart) pour évaluer la viabilité des tissus relative ou l’expression de marqueurs pertinents au début de la culture.
8. Pour la culture à long terme, reconstituer le milieu de culture tous les jours. Soulevez la grille contenant les tranches de tissu à l’aide d’une pince stérile et placez-le dans un puits vide de la plaque 6 puits ; remplacer 70 % de la moyenne avec milieu de culture frais et placez la grille dans le milieu. Continuer le cycle de rotation, comme l’a expliqué à l’étape 3.6.

4. traitement des tranches de tumeur de petites molécules inhibitrices

1. Préparer les concentrations requises de composés dans le milieu de traitement. En règle générale, une plus forte concentration de drogue 10 fois par rapport à la IC50s mesurée dans des cultures cellulaires est nécessaire pour réaliser inhibition de cible dans des tranches de tissu. Pour éviter la cytotoxicité non-spécifique, tester une gamme de concentrations afin d’obtenir une concentration minimale efficace pour chaque composé. Ici, nous avons testé 0,1 – 1 µM de la dactolisib d’inhibiteurs du PI3K/mTOR et de 0,05 à 0,5 µM de la MEK inhibiteur selumetinib sur des tranches NSCLC murines.
2. Ajouter 2,5 mL de médias avec le médicament dilué ou DMSO ou un autre contrôle de véhicule dans la plaque de 6 puits. Placer les plaques de titane dans les puits.
3. Déposer les tranches de tissu sur les grilles comme indiqué au point 3.6.
4. Effectuer des traitements de véhicule ou de la drogue pendant 24 h. Procédez avec fixation du tissu et du traitement des tranches dans des blocs de paraffine comme décrit à l’article 5.
   NOTE : Durée du traitement médicamenteux peut être optimisée selon l’objectif de l’expérience, en tenant compte de la capacité des tranches de tissu de conserver in situ des fonctions tissu analysées au cours de la période de culture.

5. fixation et transformation des tranches tissu

1. Soulever délicatement la référence inculte 0 h ou cultivée tranche sur un papier filtre imbibé dans du PBS.
   1. Pour ce faire, ajouter 2 à 3 mL de PBS dans une plaque de 10 cm, laisser le flotteur tranche dans du PBS et « repêcher » il en soulevant la tranche sur le papier filtre avec une paire de pinces.
   2. Transférer le filtre en papier dans un histocassette et ajouter une goutte de l’hématoxyline dilué (1:1 dans l’eau désionisée) sur le dessus de la tranche de tissu pour marquer visiblement la position de la tranche au cours des étapes ultérieures de traitement (Figure 1).
   3. Fermez la cassette et transférer dans une solution de formol tamponné neutre de 4 %. Fixer les tissus pendant la nuit à 4 ° C.
      Remarque : En plaçant la tranche sur le dessus du papier filtre, assurez-vous que la partie supérieure de la tranche est vers le haut ; Cela est nécessaire pour suivre le haut, au milieu et la partie inférieure d’une tranche lors de coupes et de l’analyse comme indiqué au point 6.3.
2. Le lendemain, transvaser les cassettes dans 70 % EtOH et immédiatement passer à l’étape de traitement de tissus enrobage de paraffine.
3. Avant le traitement de tissus, laver la histocasettes à 100 % EtOH 2 x pour 10 min chacun. Dans ce cas, utilisez une station micro-ondes pour le traitement des tissus. Sélectionnez le programme utilisé pour 1 mm d’épaisseur tissulaire et suivez les instructions fournies dans le manuel (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   Remarque : Lorsque vous utilisez d’autres machines de traitement des tissus, utilisez le programme approprié pour les échantillons de tissu mince.
4. Pour l’enrobage de paraffine, ouvrir un histocassette et utiliser un scalpel pour soulever délicatement la tranche du papier filtre. Jeter le papier filtre et transférer la tranche dans un moule contenant de la paraffine liquide.
   1. Appuyez sur le tissu contre le fond du moule encastrement, par exemple avec un poids plat, afin d’assurer la même section. Placez la partie inférieure de la histocasette sur le dessus du moule, laissez refroidir le moule sur une pate froid pendant 30 min et séparer le moule dans le bloc de paraffine.
      Remarque : Comme alternative à l’intégration horizontale, il est possible d’incorporer la tranche de tumeur verticalement en positionnant la tranche en position verticale. Sections verticales permettent facilement analyse des gradients de viabilité ou l’expression fonctionnelle de marqueur sur un seul article ²⁵. Analyse de gradient avec tranches horizontalement intégrée nécessite paraffine sectionnement comme indiqué au point 6.2.

6. traitement et analyse de fixés au formol et inclus en paraffine (FFIP) tissus

1. Préparer 4 coupes minces µm des blocs FFIP tissu tranche à l’aide d’un microtome. Lorsque le sectionnement, régler l’angle du bloc pour que la surface du bloc est orientée horizontalement par rapport à la lame ; Cela est nécessaire pour obtenir la même des sections dans le tissu.
2. Pour activer capture d’un gradient de potentiel viabilité induite par la culture, la migration cellulaire à travers les tranches, ou des dégradés dans l’expression de biomarqueurs dans l’ensemble des tranches, recueillir des sections des couches haut, Centre et au bas de chacun de la tranche de tissu sur les diapositives de l’objet tel qu’expliqué ci-dessous.
3. Recueillir des sections de tissu séquentielle de la tranche de tissus inclus en paraffine tout d’abord sur la partie supérieure des lames de verre. Poursuivre la collecte les sections des couches tissulaires plus profondes au milieu suivi de la partie inférieure des lames de verre (Figure 1E).
   Remarque : Pour tenir compte de trois sections sur une lame de verre, couper l’excédent de paraffine qui entourent la tranche de tissu incorporé.
4. Laisser les sections sécher pendant la nuit à 37 ° C et procéder à la coloration H & E ou immunohistochimie tel que décrit ci-dessous.
   NOTE : Perte d’antigénicité peut se produire lorsque les sections FFIP sont stockées à des températures élevées ou pendant de longues périodes de temps. Sections de paraffine sont recommandées doivent être conservés à 4 ° C, et IHC analyses doivent être effectuées dans les 6 mois après lamélisation.
   1. Pour une coloration H & E, Déparaffiner et réhydrater les sections de paraffine comme suit : xylène 3 x pendant 5 min, 100 % EtOH 3 x pendant 1 min, 96 % EtOH 2 x pendant 1 min, 70 % EtOH 1 x 1min et l’eau désionisée 2 x pendant 1 min.
   2. Incuber les sections dans une solution fraîchement filtrée hématoxyline pendant 10 min et laver sous eau courante pendant 5 min. Dip les sections dans l’alcool acide (1 % HCl dans 70 % EtOH) pour 2 heures et laver sous l’eau courante pendant 5 min, suivie d’une incubation avec 0,5 % éosine pour 2 m dans.
   3. Après l’étape de l’éosine, déshydrater les sections en immergeant les lames dans des solutions d’alcool et de xylène, comme suit : 96 % EtOH 2 x pendant 15 s, 100 % EtOH 3 x pour 30 s, xylène 3 x pendant 1 min. Enfin, incorporez les sections dans un milieu de montage à base de xylène.

7. analyse de la viabilité des tissus et l’Expression de biomarqueurs

1. Acquérir des images à haute résolution en générant des scans de la diapositive entière de H & E-lames à l’aide d’un scanner. Pour évaluer la viabilité des tissus, prendre des instantanés des scans de tissu représentant les sections supérieur, moyen et inférieur des tranches.
   1. À l’aide du logiciel de photo manipulateur, dessiner manuellement de masques sur les zones nécrotiques des tissus, suivies par la quantification des régions nécrotiques à l’aide de MATLAB.
   2. Calculer la viabilité relative des tranches labourées destinées à différents moments par rapport à la tranche de 0 h le plus proche comme fait dans notre précédente étude (Närhi et al., Figure S2B et C)²⁶. De même, évaluer les gradients de viabilité potentiel intra-tranche en quantifiant la viabilité dans la section supérieur, moyen et inférieur d’une tranche de culture et calculer la viabilité relative de chaque article à sa tranche plus proche de 0 h.
      Remarque : Alors que la simple culture de tranches NSCLC murins induit la mort des cellules nécrotiques, réponses biologiques à l’ex vivo des conditions de culture varient selon le tissu tumoral. Par exemple, gradients dans HIF1α, ER et les macrophages marqués par F4/80 ont été détectées dans la tranche de filtre pris en charge cultures dérivées d’un modèle de cancer du sein²⁵. Par conséquent, H & E - ainsi que des analyses axées sur les IHC de tranches cultivées ont besoin à prendre en considération pour chaque type de tissu.
2. Effectuer IHC sur les sections de paraffine. Le protocole suivant d’IHC est un point de départ et exige d’autres optimisation pour les autres anticorps. En bref, Déparaffiner et réhydrater les sections de paraffine comme suit : xylène 3 x pendant 5 min, 100 % EtOH 3 x pendant 1 min, 96 % EtOH 2 x pendant 1 min, 70 % EtoH 1 x pour 1 min et désionisée 2 x pendant 1 min.
   1. Pour exposer les épitopes antigéniques, effectuer la recherche d’antigène induite par la chaleur à l’aide d’acide citrique 10 mM à pH 6 dans un module de PT, suivi en bloquant avec 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) et 10 % de sérum de chèvre Normal (NGS) dans du PBS 1 x pendant 30 minutes à température ambiante (21-23 ° C).
   2. Incuber l’anticorps primaire dilué dans BSA 1 % et 5 % NGS dans du PBS 1 x, soit pour 1 – 2 h à température ambiante. Incubation avec l’anticorps secondaire anti-lapin, pendant 30 min à température ambiante, suivie de détection à l’aide de 3, 3′-Diaminobenzidine (DAB).
   3. Sections sont Eosine avec l’hématoxyline (dilué dans l’eau désionisée à 01:10) pour 30 s et le laver sous l’eau courante pendant 5 min, puis par déshydratation en immergeant les lames dans des solutions d’alcool et de xylène, comme suit : 70 % EtOH 1 x, 96 % EtOH 2 x, 100 % EtOH 3 x, xylène 3 x ( 1 min de chaque étape). Enfin, incorporez les sections dans un milieu de montage à base de xylène.
3. Acquérir des scans de la diapositive entière de lames IHC, exportez-les sous forme d’images à un rapport de grossissement de 1:4 en utilisant l’en utilisant une visionneuse d’images TIFF et effectuer les analyses quantitatives utilisant ImageJ.
   NOTE : comme une alternative au scanner, des images microscopiques à 20 X ou 40 X grossissement peut être acquis pour les analyses quantitatives. Grossissement de l’image peut être choisi selon le marqueur pour être quantifiés ; images de fort grossissement sont recommandés pour la coloration des noyaux, tandis que cytoplasmique ou marqueurs membranaires peuvent être quantifiées à l’aide de 20 images X.
   1. Dans ce cas pour la quantification de marqueurs nucléaires, NKX2-1 expression, convertissez chaque image images 16 bits à l’aide de Fidji-ImageJ et télécharger des images pour l’analyse de l’image.
   2. Personnaliser le pipeline de l’analyse d’image selon l’analyse. Dans ce protocole, utiliser le pipeline suivant pour la quantification des noyaux positifs NKX2-1 : identifier les principaux objectifs de | Mesurer l’intensité de l’objet | Filtrer les objets (valeur minimale = 0,0025) | Calculer les math. Les résultats sont représentés sous forme de pourcentages des noyaux colorés à DAB relatif au nombre total de noyaux.

Résultats

La figure 1 représente le flux de travail pour la génération, la culture et l’analyse de précision de coupe tranches dérivées de tumeurs murines de CPNPC. Pour cette démonstration, nous avons utilisé des tumeurs d’un modèle de souris génétiquement modifiées (GEMM) hébergeant l’activation conditionnelle de Kras^G12D ainsi que la perte de Lkb1 (également connu sous le nom de sérine/thréonine Kinase 11), ci-après dénommée KL. Initiation de tumeurs pulmonaires et de reproduction souris a été effectuée comme décrit dans^26,28. Figure 2 a montre l’effet de l’épaisseur de tranche de tissu sur la viabilité des tranches cultivées pendant 24 h à l’aide d’une unité rotative d’incubation. Les résultats montrent que 160 µm fines tranches contiennent des vastes zones nécrotiques sur la tranche. En outre, fines tranches de 250 µm montrent une nécrose gradient à travers la tranche par rapport à 200 µm de fines tranches. Il est probable que la viabilité globale médiocre de la plus mince µm 160 est causée par une manipulation technique pendant le positionnement des tranches sur le dessus des grilles, puisque ceux-ci sont fragiles et ont tendance à friser. En revanche, lorsque les tranches sont trop épais, qu'ils peuvent devenir sujettes aux déficiences d’oxygène ou de nutriments diffusion à travers les tranches, qui en murine NSCLC explants témoigne que la mort nécrotique dégradé²⁵. Toutefois, il est à noter que les tranches avec des épaisseurs variables peuvent être générés d’une tumeur, malgré l’utilisation des paramètres de vibratome identiques. Il est donc recommandé d’analyser plusieurs réplicats d’échantillons de tumeurs différentes. Ce qui est important, chaque type de tissu nécessite optimisation d’épaisseur de tranche de devenir viables maximale, car la texture du tissu et la dureté peuvent affecter l’oxygénation et flux des éléments nutritifs. Figure 2 b -2C illustre des analyses quantitatives de IHC d’expression NKX2-1, un marqueur de l’adénocarcinome du poumon bien différenciés (AC) dans les échantillons cultivés jusqu'à 72 h et appariés tranches 0 h. Les résultats montrent qu’expression NKX2-1 n’est pas significativement altérée en tranches cultivées par rapport à 0 h tranches incultes, ce qui suggère que le processus de la culture n’affecte pas ouvertement l’état de différenciation du tissu tumoral AC. Figure 2D démontre l’utilité des tranches de tissu de tumeur pour évaluer l’efficacité des médicaments ciblés. Nous avons montré récemment que Kras mutants murins ACs pièce forte expression de phosphorylés ERK1/2 (marquage une activité accrue de voie MAPK) par rapport aux tumeurs adénosquameux (ASC), tandis que l’expression de 4EBP1 phosphorylés (marquage activité mTOR ) est exprimé de la même façon dans les tumeurs C.A. et ASC. Pour vérifier si ces voies peuvent être efficacement ciblées sur des tranches de tissu, tranches de tissus KL AC ont été traités avec le DMSO ou titrés des quantités de composés, à savoir 0,1 – 1 µM dactolisib pour cibler la voie mTOR ou 0,05 à 0,5 µM selumetinib pour cibler la voie MAPK. Les résultats montrent que dactolisib de 1µm ou 0,5 µM de selumetinib sont efficaces pour inhiber la phosphorylation de 4EBP1 ou de ERK1/2, respectivement. En outre, une inhibition dose-dépendante des phosphoprotéines ciblées indique que les tranches de tissu peuvent également être utilisées pour valider des anticorps spécifiques à la phosphorylation.

Figure 1 : représentation schématique du flux de travail pour la mise en place et l’analyse des explants de tranche dérivées de tumeurs murines CPNPC. (A) schéma décrivant le prélèvement et la préparation des poumons avec tumeur pour trancher. Lobes du poumon sont récoltés sur une souris et un tissu tumoral est disséqué des tissus normaux. La flèche noire et un astérisque indiquent environ 4 mm et des tumeurs de 1 mm, respectivement. La pointe de flèche blanche indique le tissu pulmonaire, collé à la surface de la porte-échantillon. La flèche rouge indique à un autre morceau de tissus de soutien de poumon normal de conserver la tumeur en position verticale. (B) Vibratome tranchage et collection de tissu. Flèche blanche indique la direction de tranchage. Collection de tranches séquentielles dans une plaque de 24 puits contenant froid HBSS + P/S. Les tranches peuvent être cultivées à des moments différents (ici, 24 à 72 h) afin d’évaluer l’expression du marqueur tumoral spécifique pendant la culture (rangée du haut), ou peuvent être utilisés pour effectuer des traitements médicamenteux. C: excipient, t : traitement de la toxicomanie. (C) Placer la tranche de tissu pour la culture en utilisant les unités rotatives d’incubation. Basculer la plaque 6 puits afin que quelque moyen couvre le haut de la grille, placez la tranche de tissu au milieu de la grille sur le dessus de la moyenne et tartinez la tranche avec une pincette. Assurez-vous que les plaques 6 puits sont poids équilibré pour un cycle de rotation sans heurt. X: indique incorrecte, et : indique un positionnement correct de la tranche. (D) photographie du bloc FFIP d’une tranche de la tumeur. Flèche noire à tranche de tissus inclus en paraffine colorés à l’hématoxyline. Schematics (E) montrant l’ordre sectionnement des tranches en blocs FFIP ; ces sections peuvent être traitées afin d’évaluer la viabilité des tissus et l’expression de biomarqueur spécifique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : évaluation de l’expression de marqueur de viabilité et histotype spécifiques et pharmacothérapie ciblée sur les tranches de tissus CPNPC. Images (A) représentant H & E de tranches de NSCLC AC des épaisseurs indiquées cultivés pour des tranches fines de 24 h. 200 µm de maintiennent la viabilité mieux par rapport à 160 µm ou fines tranches de 250 µm. Bleu foncé représente H & E teinté tissu viable et rose indique pseudocolored régions nécrotiques. Bleu clair indique les régions exclues de l’analyse, soit en raison de la qualité des tissus pauvres ou présence du stroma fibreux. T1 et T2 représentent des réplicats biologiques provenant de deux différentes tumeurs. Echelle = 500 µm (B) IHC représentant les images d’expression NKX2-1 dans les tranches de AC cultivés pour les points de l’heure indiquée. La flèche indique la zone illustrée à fort grossissement. Les résultats montrent que l’expression NKX2-1 n’est pas altérée dans les tranches cultivées par rapport aux tranches de 0 h. Echelle = 500 µm et 50 µm pour des grossissements faibles et élevées, respectivement. (C) quantifier les données indiquées au point B. (D) représentant IHC images de 4EBP1 phosphorylé ou expression de la pERK1/2 en 0 h tranches, tranches traités avec le DMSO titré des quantités de dactolisib (dact, rangée du haut) ou ou phosphorylée pERK1/2 expression dans la tranche 0 h ou tranches traités avec le DMSO ou selumetinib (sel, rangée du bas). Boîtes carrées noires indiquent des zones indiquées au fort grossissement. Echelle = 1 mm ou 50 µm pour un grossissement faible ou élevé, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Divers complexes en vitro tumeur modèles, y compris les cultures 3D et organoids, ont été développés pour récapituler l’architecture et les fonctions oncogéniques de in vivo la tumeur tissulaire^29,,³⁰. Cependant, la mise en place de cultures 3D ou organoïdes implique dissociation tissulaire et croissance sélective de cellules du même type ou de la co-culture d’un select quelques types de cellules dans un milieu artificiel. En conséquence, ces modèles capturent incomplètement la complexité des interactions de l’hétérogénéité et la tumeur-stroma tumoral. Tranches d’organotypique de tumeur, d’autre part, maintient les complexités d’architecture et biologique des tissus de la tumeur in situ , sans une vaste manipulation. Cette capacité des tranches de tissu de cellules tumorales modèle dans leur microenvironnement natif le rend particulièrement attrayant pour les études précliniques. Nous avons déjà indiqué un workflow optimisé pour la création et l’analyse des tranches de tumeur de la précision de coupe, et a montré que, comparé à filtre prend en charge, une unité rotative d’incubation améliorer la viabilité à court terme murine NSCLC tranche cultures^{25 , 31}. Toutefois, qui intervient dans la rotation des unités est techniquement difficile et nécessite une surveillance constante. Nous présentons ici un protocole pour la génération de tranche pour le tissu tumoral et l’utilisation pratique d’une rotation unité d’incubation pour leur culture, ainsi qu’accompagnant les méthodes permettant de contrôler la capacité des tranches pour capturer en situ biologie tumorale, une condition sine qua non avant la drogue test de réponse.

Plusieurs étapes cruciales dans le protocole assurent l’intégrité des tissus et la viabilité des tranches tumeur. Si le tissu pulmonaire normale entoure la tumeur, le vibratome peut générer des tranches d’épaisseur incompatible ou endommager les tranches, en raison de différences dans la texture et la rigidité des tissus normaux et la tumeur. Il est donc important d’éliminer les tissus pulmonaires normales environnants avant tranchage de la tumeur. Une autre étape critique est l’épaisseur de tranchage, qui doit être soigneusement optimisé pour chaque type de tissu. En outre, une fois tranché, il est essentiel que la tranche est placée approximativement au milieu de la grille, donc pour assurer la précision intermittente immersion dans le milieu de culture et de l’exposition de l’oxygène. Enfin, il est important de suivre la position d’une tranche au cours de sa période de rotation, comme une tranche peut descendre vers le bas le milieu ; Si cela se produit, autres mesures peuvent être prises comme l’a expliqué à l’étape 3.6 du protocole.

Gérant de manière à assurer l’intégrité des tissus, s’ajoutent également des étapes critiques dans l’analyse de l’IHC à interpréter comment la tranche ressemble à du tissu natif. Notre étude antérieure a montré que les tumeurs murines NSCLC montrent l’hétérogénéité spatiale prononcé intra-tumeur oncogènes signalisation activités²⁶. Cela signifie que l’utilisation de tissus distincts dans l’espace en tranches pour les contrôles ou les échantillons traités peuvent influer sur l’interprétation des données expérimentales fiables, et donc tranches proche voisins serve de contrôles et d’échantillons de test. De plus, nous avons démontré que tandis que la prolifération ou expression d’oncogènes phosphoprotéine en tranches fraîchement coupées inculte 0 h ressemblaient à des tumeurs in situ , tranches cultivées ont montré expression altérée phosphoprotéine oncogènes, spécialement modifiés p4EBP1 pSRC, ainsi altérée prolifération analysés par IHC Ki67. Expression p4EBP1 altérée a été de même décelée dans 24h NSCLC humaine et cancer de la prostate Tranchez des cultures (Narhi et al.., supplémentaire Figure S3B-S3C, S5 et S7)²⁶. Ces constatations approuver que comparaison des tranches cultivées avec leur tranche inculte le plus proche de 0 h est essentielle pour évaluer la préservation in situ de fonctions tumorales en tranches cultivées.

Malgré l’amélioration de la viabilité d’organotypique tranches²⁵, il existe des limites avec le système de la coiffe en ce qui concerne les aspects techniques. Placer les tranches de tissus sur des grilles de titane est plus difficile par rapport pour filtrer les insertions, et une unité rotative d’incubation ne seront ne peut-être pas disponible. Comme alternative, supports de filtre stagnante peuvent être utilisés, mais dans ce cas que le côté exposés à l’air des tranches devrait être analysé, comme-à-filtre à air dégradés dans la viabilité et l’hypoxie mesurée par HIF1α expression sont forment rapidement en tranche de filtre pris en charge cultures (Davies et al., Figure 5 et Figure 7 a-7 b)²⁵. De plus, nous avons montré que les cultures de tranche de tumeur peuvent montrer prolifération altérée et des activités de signalisation oncogènes par rapport à leurs tumeurs native²⁶, peut-être à cause de la cicatrisation des réponses ou adaptation métabolique des tranches de ex vivo ³²la culture. Bien que le bruts caractéristiques morphologiques des tumeurs murines NSCLC ont été maintenus pendant la culture de 72 h, prolifératives induite par la culture peuvent affecter un classement précis des tranches cultivées. Ainsi, tranches de tissus seulement soient utilisés pour des études fonctionnelles à court terme.

Utilisation de l’unité rotative d’incubation sauve au moins partiellement dégradés d’expression de viabilité ou biomarqueurs intra-tranche, surtout pendant les premières 24 heures de culture. Une fois validé pour l’intégrité et la fonction, cela fournit du matériel de tissu pour des études fonctionnelles, telles que des études sur les traitements médicamenteux. En plus de la réponse profilage des drogues, expression cible modifiée après traitement de la toxicomanie peut également bénéficier de validation d’anticorps. Cela est particulièrement pertinent pour la détection des épitopes murins avec anticorps monoclonaux de souris, que ceux-ci tendent à forte coloration de l’arrière-plan. En outre, les anticorps bien validées sont nécessaires pour atteindre des données fiables et reproductibles dans paramètres diagnostiques et cliniques. Modulation de l’abondance ou la phosphorylation des épitopes pertinentes après traitement de la toxicomanie dans les tranches de tissus fournit donc une pratique application pratique dans la validation des anticorps. Un avantage majeur des cultures de tranche de tumeur est la possibilité de fonctions distribuées dans l’espace du modèle, y compris les activités de signalisation oncogènes ou réaction aux médicaments dans la tumeur ou des cellules stromales, qui rend un modèle attrayant ex vivo . Toutefois, les tranches tournent pendant la culture, et le processus de la culture peut également endommager les tissus particulièrement sur les bords. Il est donc difficile de superposition précisément les images IHC biomarqueur teinté de tranches de 0 h avec les régions nécrotiques détectées en tranches cultivées, qui compromet la possibilité de relier avec précision les activités spatiales de biomarqueurs à la réaction aux médicaments. En outre, réponses nécrotiques tumorale intrinsèque, induite par la culture et médicamenteuse sont indiscernables au moins dans les tranches de tissus NSCLC murines, compromettre la quantification précise des réponses de drogue spatiale. Enfin, l’utilisation de cultures de tranche de tumeur permet un chercheur à l’essai plusieurs composés sur la tumeur même, sans avoir à traiter les animaux, donc affiner, réduire et remplacer les expériences sur animaux de laboratoire.

Comme une application future, on peut adopter le protocole décrit aux échantillons cliniques tumeur solide. Autres modifications de dépendant du type de tissu ou optimisations sont probablement nécessaires, commençant par les réglages vibratome incluant la tranche épaisseur et vibration pour optimiser ces pour la texture de la tumeur ou la raideur. En outre, des besoins en éléments nutritifs et de facteur de croissance peuvent varier pour tissus tumoraux différents. À titre d’exemple, tranches de cancer du sein ont été cultivées avec l’insuline complétée dans la moyenne^13,18. Étant donné que le matériel tissulaire limité est obtenu au cours d’une intervention chirurgicale ou biopsie, optimisation des cultures de tranche de tumeur dérivée de patient peut être difficile en raison de difficultés à obtenir un nombre suffisant d’échantillons. En outre, reproductibilité des données est également contestée par prononcé l’hétérogénéité de l’échantillon de patient à patient, en particulier dans le pourcentage des cellules tumorales par rapport aux régions fibreuses ou infiltrats stromales, ainsi que des composants des tissus nécrosés. Enfin, application de tranches de tumeur dans les paramètres de diagnostics exigerait enquête l’ampleur drogues réponses dans la tranche des explants de prétraitement biopsies correspond aux réponses de post-traitement en vivo .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)	Sigma	H6648
Pénicilline Solution de streptomycine	Thermo Fischer Scientific	15140-122
Ham F-12 medium	Thermo Fischer Scientific	21765-037
Glucose	VWR	101174Y
FBS	Thermo Fischer Scientific	10270-106
Glutamine 200mM	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Adhésif cyanoacrylate (GLUture)	Abbott	32046-90-1
Leica VT1200 S microtome à lame vibrante	Leica Biosystems	14048142066
Lame de tranchage	VWR	PERS60-0138
Grilles en titane	Albamma Recherche et développement	MA0036
Incubation en tranches unité	Albamma Recherche et Développement	MD2500
10 cm Plaque de culture tissulaire	Sarstedt	83.1802
Plaque 24 puits	Sarstedt	83.1836
Plaque 6 puits	Sarstedt	83.1839
Neolus Aiguilles hypodermiques	Terumo Neolus	NN2525R
50 mL Tube faucon	Greiner  ;
PBS	Lonza	BE17-517Q
Formaldehyde	Fisher	F/1501/PB08
Cassette histo à trois volets papier	Diagnostic du cancer	DX26280
Cassettes histo	VWR	720-2199  ;
KOS Le processeur de tissus multifonctionnel pour micro-ondes	Milestone SRL	CAT307EN-003
Microtome	Thermo Fischer Scientific	HM355S
Superfrost Ultra plus slides	VWR	631-0099
BSA	Sigma	A2153
NGS	Thermo Fischer Scientific	16210-064
Acide citrique	Sigma	C1909
PT-Module	Thermo Fischer Scientific	A80400012
Hématoxyline pour H& E coloration	Merck	1.09249.0500
Hématoxyline pour contre-coloration	Dako	S3309
Eosin	Sigma	E4382
NKX2-1 anticorps	Abcam	ab133638	Numéro de lot : GR98031-12
pERK 1/2 anticorps	Cell Signaling Technologies	CST 4370	Numéro de lot : 17
p4EBP1	anticorps Signalisation cellulaire Technologies	CST 2855	Numéro de lot : 20
BrightVision poly-HRP Anticorps secondaire anti-lapin	de chèvre ImmunoLogic	VWRKDPVR-110HRP
Montage medicum pertex	VWR	MEDT41-4021-00
DAB  ;	ImmunoLogic	VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235)	Selleckchem	S1009
Selumetinib (AZD2644)	Selleckchem	S1008
Pannoramic 250 slide scaner	3DHISTECH
MATLAB	MathWorks		https://se.mathworks.com/ products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER  ;	3DHISTECH		https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6	Adobe		https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ	ImageJ		https://imagej.net/Fiji
CellProfiler	Logiciel d’analyse d’images cellulaires CellProfiler	http://cellprofiler.org/