Article de méthode

Microscopie 4D de levure

DOI :

10.3791/58618

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28 avril 2019

 , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'objectif de ce protocole est de caractériser la façon dont les compartiments membranaires se forment et se transforment en cellules vivantes de levure en herbe. Beaucoup de compartiments intracellulaires dans la levure sont dynamiques, et une compréhension complète de leurs propriétés exige l'imagerie de time-lapse. La microscopie multicolore de fluorescence confocale 4D est une méthode puissante pour suivre le comportement et la composition d'un compartiment intracellulaire sur une échelle de temps de 5-15 min. L'analyse rigoureuse de la dynamique des compartiments nécessite la capture de milliers d'optiques Sections. Pour atteindre cet objectif, le blanchiment photo et la phototoxicité sont réduits au minimum en scannant rapidement à très faible puissance laser, et les dimensions de pixel et les intervalles Z-step sont réglés aux plus grandes valeurs qui sont compatibles avec l'échantillonnage de l'image à pleine résolution. Les ensembles de données 4D qui en résultent sont bruyants mais peuvent être lissés par la déconvolution. Même avec des données de haute qualité, la phase d'analyse est difficile parce que les structures intracellulaires sont souvent nombreuses, hétérogènes et mobiles. Pour répondre à ce besoin, des plugins ImageJ personnalisés ont été écrits pour mettre en réseau des données 4D sur un écran d'ordinateur, identifier les structures d'intérêt, modifier les données pour isoler les structures individuelles, quantifier les cours de temps de fluorescence et faire des films des piles Z projetées. Les films 4D sont particulièrement utiles pour distinguer les compartiments stables des compartiments transitoires qui se retournent par maturation. De tels films peuvent également être utilisés pour caractériser des événements tels que la fusion de compartiments, et pour tester les effets de mutations spécifiques ou d'autres perturbations.

Introduction

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Les compartiments du système endomembrane sont en constante évolution, et leur caractérisation complète nécessite une imagerie cellulaire vivante. Décrit ici est un protocole qui emploie la microscopie confocale 4D (time-lapse 3D) pour visualiser les compartiments fluorescents étiquetés dans les levures en herbe. La méthode a été développée pour suivre la dynamique des compartiments sécréteurs dans Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Ce protocole se concentre sur S. cerevisiae, qui a un Golgi non empilé dans lequel les cisternae individuelles sont optiquement résolvables4. L'organisation inhabituelle de Golgi dans S. cerevisiae a permis la démonstration par microscopie 4D qu'une cisterna de Golgi étiquette d'abord avec les protéines tôt résidentes de Golgi, et perd alors ces protéines tout en acquérant les protéines golgi tardives résidantes3 ,5. Cette transition peut être visualisée en créant une souche dans laquelle la protéine Golgi Vrg4 est étiquetée avec gFP tandis que la protéine Golgi tardive Sec7 est étiquetée avec une protéine fluorescente rouge monomeric. Lorsque les cisternae individuelles sont suivies, la maturation est observée comme une conversion vert-rouge3. Ce type d'analyse peut fournir des informations précieuses sur la localisation des protéines et l'identité du compartiment. Par exemple, deux protéines avec des heures d'arrivée et de départ légèrement décalées peuvent parfois sembler étiqueter différents compartiments dans des images statiques, mais peuvent être vues dans des films 4D pour étiqueter le même compartiment à différents points de temps6,7 . Ainsi, la microscopie 4D révèle des phénomènes qui ne seraient pas évidents autrement.

La microscopie 4D informative des compartiments à levures peut être réalisée avec des procédures et un équipement appropriés2. Dans la mesure du possible, le marquage des protéines fluorescentes est effectué par remplacement génétique8 pour éviter les artefacts surexpression. Parce que les structures intracellulaires sont souvent très dynamiques, la formation image 4D est nécessaire pour s'assurer qu'une structure est suivie de façon fiable au fil du temps. Le protocole décrit ici utilise un microscope confocal à balayage laser équipé de détecteurs de haute sensibilité. Avec cet appareil, le volume cellulaire entier de S. cerevisiae peut être imagepar microscopie confocale approximativement tous les 1-3 s, avec 2 intervalles de s étant typiques. Les données peuvent être recueillies jusqu'à 5-15 min en fonction des densités d'étiquetage des fluorophores et de leurs propriétés photophysiques. Le principal obstacle est de minimiser le photoblanchiment. À cette fin, les intensités laser sont maintenues aussi bas que possible, la vitesse de balayage confocal e est maximisée, et les paramètres optiques sont configurés pour l'image à la limite Nyquist afin de capturer les informations pertinentes tout en évitant l'exposition excessive à la lumière. Ces paramètres sont également censés soulager la phototoxicité, un facteur qui est souvent négligé lors de l'imagerie cellulaire en direct9,10,11. Les données bruyantes qui en résultent sont traitées avec des algorithmes de correction de l'eau de Javel et de déconvolution pour faciliter la quantification des intensités de fluorescence.

Même avec des films 4D de haute qualité, l'analyse est délicate parce que les compartiments à levures ont tendance à être nombreux, hétérogènes et mobiles. En raison des limites intrinsèques de la microscopie confocale et des réglages non optimaux requis pour une imagerie 4D prolongée, les structures fluorescentes qui sont proches les unes des autres sont difficiles à résoudre. Ce problème peut être contourné en se concentrant sur le petit nombre de structures fluorescentes qui restent optiquement résolvables pendant toute la durée de la période d'étiquetage, en supposant que ces structures sont représentatives de l'ensemble de la population d'étiquettes Compartiments. Les compartiments fluorescents qui peuvent être suivis de façon fiable sont identifiés en visionnant des films de piles Z projetées et en créant une série de montages dans lesquels les sections optiques pour chaque point de temps sont disposées sur un écran d'ordinateur. Cette analyse utilise des plugins ImageJ12 personnalisés, qui permettent de suivre une structure individuelle de manière isolée.

Des méthodes récentes ont couvert l'utilisation de protéines fluorescentes dans la levure13 ainsi que la théorie et la pratique de l'imagerie confocale 4D des cellules de levure2. Ce protocole se concentre sur les principaux aspects pratiques d'une expérience d'imagerie 4D. Il comprend quelques améliorations aux procédures précédemment décrites, ainsi que des versions mises à jour du code plugin ImageJ et de la documentation. L'exemple montré se concentre sur la dynamique Golgi, mais ce protocole est tout aussi approprié pour l'imagerie d'autres compartiments à levures.

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Protocole

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1. Préparation

  1. Faire non fluorescent minimal NSD moyen2. L'absence de riboflavine devrait réduire la fluorescence verte intracellulaire de fond et la phototoxicité associée.
  2. Cultivez la souche de levure pendant la nuit à 23 oC jusqu'à la phase logarithmique en 5 mL de NSD dans un flacon déconcerté de 50 ml avec une bonne aération. Environ 3-4 h avant l'analyse, diluer la culture de levure dans NSD frais de sorte que l'OD600 final sera 0.5-0.8 au moment de l'imagerie.
  3. Préparer une solution de 2 mg/mL de concanavaline A (ConA). Si vous le souhaitez, congeler les aliquots de cette solution dans de l'azote liquide et les stocker à -80 oC.
  4. Faites tourner la solution ConA pendant 5 minutes à pleine vitesse dans un microcentrifugepour enlever les particules qui peuvent interférer avec l'imagerie. Ensuite, ajoutez 250 l de supernatant à un plat de microscopie propre de 35 mm de fond de verre de couverture. Après 15 min, laver 2-3 fois avec 2 ml de dH2O et laisser sécher.
  5. Ajoutez 250 l l de la culture de levure au plat ConA-enduit, attendez 10 min pour permettre aux cellules d'adhérer, et lavez doucement 2-3 fois avec 2 mL NSD. Couvrir les cellules de 2 ml de NSD frais.

2. Imagerie

  1. Utilisez une lentille d'immersion d'huile 63x ou 100x. Une ouverture numérique (NA) de 1,40 est suffisante, mais une lentille NA plus élevée peut également être utilisée.
  2. Format de la taille du cadre à 256 x 128 (largeur x hauteur). Si une plus grande taille de cadre est nécessaire, l'augmentation de la largeur ne réduira pas la vitesse d'analyse tant que le microscope confocal est équipé d'un scanner résonant.
  3. Ajustez le facteur de zoom pour faire la taille du pixel 80 nm.
  4. Utilisez la vitesse maximale d'analyse, qui est généralement de l'ordre de 8 kHz. Activez la numérisation Bidirectionnelle X si elle est disponible, et si les expériences de contrôle confirment que les scans des deux directions sont enregistrés.
  5. Définir l'accumulation de la ligne à 4 ou 6. Assurez-vous d'utiliser l'accumulation (somme) au lieu de la moyenne.
  6. Définir le trou d'épingle à 1,2 unités Airy. Empiriquement, lors de l'imagerie des cellules de levure vivantes, ce paramètre capture plus de photons que le choix standard de 1.0 Airy unité tout en ne causant aucune perte appréciable de résolution.
  7. Pour chaque canal de fluorescence, définir la longueur d'onde de l'excitation, assigner un détecteur de haute sensibilité, définir la plage de longueur d'onde des émissions et activer le mode de comptage des photons si disponible. Les choix de longueur d'onde dépendront des fluorophores. À titre d'exemple, excitez la fluorescence GFP à 485 nm et collectez de 495-550 nm, et excitez la fluorescence mScarlet à 555 nm et collectez de 562-625 nm.
  8. Définir l'intensité de chaque laser pour être aussi faible que possible. Ce paramètre doit être déterminé empiriquement. Une intensité appropriée se traduira par la capture d'une séquence d'image bruyante mais interprétable, avec le signal de fluorescence blanchissant pas plus de 50% à la fin d'un film de 5 min. Sur le microscope confocal utilisé ici (voir Tableau des Matériaux),cette intensité correspond à un réglage de puissance laser de l'ordre de 5%.
  9. Utilisez des filtres d'encoche ou des talonnages pour éviter de capter la lumière réfléchie du bordereau. Si le chronolimage est disponible, définir la fenêtre de gating à 0.6-10.0 ns.
  10. Activez l'imagerie brightfield et utilisez un détecteur de faible sensibilité pour la collecte de données. Définiz le gain à un niveau qui rend les cellules clairement visibles. N'utilisez pas de contraste d'interférence différentiel (DIC) parce que le prisme interfère avec la capture de données fiables sur la fluorescence.
  11. Définir l'intervalle Z-step à 0,25-0,35 m. Imager l'ensemble du volume des cellules de levure en recueillant environ 20-25 sections optiques par z-pile. Spécifiez la directionnalité de l'imagerie de telle sorte que « vers le bas » se déplace vers le bordereau de couverture.
  12. Pour un film typique, fixez l'intervalle de temps entre les z-stacks à 2 s et fixez la durée du film à 5 à 10 min. Selon le compartiment à l'étude, réduisez l'intervalle pour faire des films plus courts de dynamique relativement rapide, ou augmentez l'intervalle pour faire des films plus longs de dynamique relativement lente.
  13. Enregistrer le film comme un fichier LIF avec les images brightfield dans le dernier canal. Des profondeurs de bits plus élevées ne sont pas nécessaires à ce stade, et le pipeline de traitement est configuré pour accepter les données 8 bits Du TIFF.

3. Deconvolution

  1. Lancez le logiciel de déconvolution (voir Tableau des matériaux), à l'aide de l'algorithme classic Maximum Likelihood Estimation.
  2. Ouvrez l'ensemble de données généré à l'étape 2.13. Sélectionnez "Deconvolution Wizard". Inspectez les valeurs affichées dans l'assistant "Parameter". Les paramètres d'imagerie doivent être détectés et correctement affichés. Sous les « indices réfractifs », modifiez la valeur « Embedding med » à 1,40 pour se rapprocher du cytoplasme de levure. Sous "coverslip", sélectionnez "Launch editor" et "Estimate position" et "OK" pour définir la position de coverslip. Sélectionnez "Set all verified" et "Accept".
  3. Passez par le « magicien de la déconvolution » pour chaque canal de fluorescence. Sélectionnez "Manuel" comme mode d'estimation de fond. Inspecter le profil d'intensité de la fluorescence des données brutes pour déterminer une valeur de fond estimée, qui est généralement d'environ 0,1.
  4. Dans le menu de configuration de la déconvolution, entrez une valeur « Itérations maximales » de 40 et éteignez la correction de l'eau de Javel. Entrez une valeur SNR estimée, qui est généralement d'environ 5,0. Cliquez sur "Deconvolve".
  5. Si nécessaire, retournez au fichier de données d'origine, ajustez l'arrière-plan et les valeurs SNR, et répétez la déconvolution, jusqu'à ce que le bruit soit suffisamment enlevé sans éliminer la fluorescence authentique des structures sombres.
  6. Fusionnez les canaux de fluorescence brightfield et déconvolved. Pour les étapes de montage de films ultérieures dans ImageJ, organiser les canaux de telle sorte que le rouge est d'abord, vert (si présent) est le prochain, bleu (si présent) est le prochain, et brightfield est le dernier. Enregistrer la séquence d'image comme un fichier TIFF 8 bits.

4. Bleach Correction et génération de films

  1. Importer la séquence d'image décongestionné dans ImageJ et le convertir en une hyperpile en choisissant l'image 'gt; Hyperstacks 'gt; Stack à Hyperstack. Sélectionnez "xyzct" dans le menu déroulant, et remplissez le nombre de canaux, de tranches Z-stack et de délais (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Choisissez l'image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels.
  3. Corriger les canaux de fluorescence pour le photoblanchiment à l'aide du plugin ImageJ disponible à partir de http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Une fois que le plugin a été téléchargé et installé, choisissez Plugins 'gt; EMBLtools 'gt; Bleach Correction. Sélectionnez "Exponential Fit".
  4. Pour fusionner les canaux de fluorescence corrigés de brightfield et d'eau de Javel dans une hyperpile, choisissez l'image 'gt; Color 'gt; Merge Channels. Enregistrer l'hyperpile résultante comme un fichier TIFF 8 bits.
  5. Installez les plugins ImageJ personnalisés fournis avec ce protocole. Suivez les instructions dans le document d'accompagnement pour visualiser, modifier et quantifier la séquence d'images, et pour produire un film final des z-stacks projetés.

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Résultats

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L'exemple donné ici documente et quantifie la maturation de deux levures Golgi cisternae telles que visualisées par microscopie confocale 4D double couleur3. Une cellule de levure contient sur l'ordre de 10-15 Golgi cisternae, dont chacun mûrit sur un cours de temps d'environ 2-4 min. Maturation peut être visualisé en taguant le marqueur Golgi tôt Vrg4 avec GFP et en taguant le marqueur Golgi tardif Sec7 avec un fluorescent rouge comme mCherry ou mScarlet. Une cist...

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Discussion

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La formation image confocale 4D des organites de levure exige l'adage soigneux des paramètres multiples. La principale préoccupation est le blanchiment et la phototoxicité. Un film 4D typique consiste à collecter des milliers de sections optiques, de sorte que l'éclairage laser doit être maintenu aussi bas que possible. Les étiquettes de protéines fluorescentes Tandem peuvent être utilisées pour stimuler le signal sans augmenter l'expression de la protéine étiquetée16,...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R01 GM104010. Merci pour l'aide à la microscopie de fluorescence à Vytas Bindokas et Christine Labno à l'installation de base de microscopie intégrée, qui est soutenu par le Nih-financé Cancer Center Support Grant P30 CA014599.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plats à fond en verre de 35 mm N° 1.5MatTekP35G-0.170-14-CBoîtes d’imagerie
Concanavalin Apoudre Sigma-AldrichC2010
TroloxVector LaboratoriesCB-1000
Microscope confocal Leica SP8Leica Microsystems
Leica Application Suite X  ;Leica MicrosystemsLogiciel de microscope
Huygens Essential logiciel, version 17.04Scientific Volume ImagingLogiciel de déconvolution
ImageJNIHLogiciel de traitement et d’analyse d’images

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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