Microscopie 4D de levure

Résumé

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Résumé

L'objectif de ce protocole est de caractériser la façon dont les compartiments membranaires se forment et se transforment en cellules vivantes de levure en herbe. Beaucoup de compartiments intracellulaires dans la levure sont dynamiques, et une compréhension complète de leurs propriétés exige l'imagerie de time-lapse. La microscopie multicolore de fluorescence confocale 4D est une méthode puissante pour suivre le comportement et la composition d'un compartiment intracellulaire sur une échelle de temps de 5-15 min. L'analyse rigoureuse de la dynamique des compartiments nécessite la capture de milliers d'optiques Sections. Pour atteindre cet objectif, le blanchiment photo et la phototoxicité sont réduits au minimum en scannant rapidement à très faible puissance laser, et les dimensions de pixel et les intervalles Z-step sont réglés aux plus grandes valeurs qui sont compatibles avec l'échantillonnage de l'image à pleine résolution. Les ensembles de données 4D qui en résultent sont bruyants mais peuvent être lissés par la déconvolution. Même avec des données de haute qualité, la phase d'analyse est difficile parce que les structures intracellulaires sont souvent nombreuses, hétérogènes et mobiles. Pour répondre à ce besoin, des plugins ImageJ personnalisés ont été écrits pour mettre en réseau des données 4D sur un écran d'ordinateur, identifier les structures d'intérêt, modifier les données pour isoler les structures individuelles, quantifier les cours de temps de fluorescence et faire des films des piles Z projetées. Les films 4D sont particulièrement utiles pour distinguer les compartiments stables des compartiments transitoires qui se retournent par maturation. De tels films peuvent également être utilisés pour caractériser des événements tels que la fusion de compartiments, et pour tester les effets de mutations spécifiques ou d'autres perturbations.

Introduction

Les compartiments du système endomembrane sont en constante évolution, et leur caractérisation complète nécessite une imagerie cellulaire vivante. Décrit ici est un protocole qui emploie la microscopie confocale 4D (time-lapse 3D) pour visualiser les compartiments fluorescents étiquetés dans les levures en herbe. La méthode a été développée pour suivre la dynamique des compartiments sécréteurs dans Pichia pastoris et Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Ce protocole se concentre sur S. cerevisiae, qui a un Golgi non empilé dans lequel les cisternae indivi....

Protocole

1. Préparation

1. Faire non fluorescent minimal NSD moyen². L'absence de riboflavine devrait réduire la fluorescence verte intracellulaire de fond et la phototoxicité associée.
2. Cultivez la souche de levure pendant la nuit à 23 oC jusqu'à la phase logarithmique en 5 mL de NSD dans un flacon déconcerté de 50 ml avec une bonne aération. Environ 3-4 h avant l'analyse, diluer la culture de levure dans NSD frais de sorte que l'OD₆₀₀ final sera 0.5-0.8 au moment de l'imagerie.
3. Préparer une solution de 2 mg/mL de concanavaline A (ConA). Si vous le souhaitez, congeler les aliquots de cette solution dans de l'azote liquide et les....

Résultats

L'exemple donné ici documente et quantifie la maturation de deux levures Golgi cisternae telles que visualisées par microscopie confocale 4D double couleur³. Une cellule de levure contient sur l'ordre de 10-15 Golgi cisternae, dont chacun mûrit sur un cours de temps d'environ 2-4 min. Maturation peut être visualisé en taguant le marqueur Golgi tôt Vrg4 avec GFP et en taguant le marqueur Golgi tardif Sec7 avec un fluorescent rouge comme mCherry ou mScarlet. Une cist.......

Discussion

La formation image confocale 4D des organites de levure exige l'adage soigneux des paramètres multiples. La principale préoccupation est le blanchiment et la phototoxicité. Un film 4D typique consiste à collecter des milliers de sections optiques, de sorte que l'éclairage laser doit être maintenu aussi bas que possible. Les étiquettes de protéines fluorescentes Tandem peuvent être utilisées pour stimuler le signal sans augmenter l'expression de la protéine étiquetée^16,.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plats à fond en verre de 35 mm N° 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Boîtes d’imagerie
Concanavalin A	poudre Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Microscope confocal Leica SP8	Leica Microsystems
Leica Application Suite X  ;	Leica Microsystems		Logiciel de microscope
Huygens Essential logiciel, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Logiciel de déconvolution
ImageJ	NIH		Logiciel de traitement et d’analyse d’images