Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

Résumé

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Résumé

Nous avons développé un outil pour enrichir et développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Cela peut être utile dans des cas tels que A) détecter l’existence de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, B) sonde la dynamique des réactions antigène-spécifiques, C) comprendre les réactions antigène-spécifiques influencent l’état de la maladie telles que l’auto-immunité, D) démystifier hétérogènes réponses spécifiques de l’antigène des cellules T, ou E) utilisent des cellules antigène-spécifiques pour la thérapie. L’outil est basé sur une particule magnétique que nous avons conjugué antigène-spécifiques et les signaux de costimulation des lymphocytes T, et que nous appelons comme artificiels (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Par conséquent, étant donné que la technologie est simple à réaliser, il pourra facilement être adopté par d’autres laboratoires ; ainsi, notre but ici est de décrire en détail la fabrication et l’utilisation subséquente de la vamp. Nous expliquons comment attacher les signaux de costimulation et antigène-spécifiques à la VAMP, comment les utiliser pour enrichir des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et comment développer des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Par ailleurs, nous mettrons en évidence de conception technique, les considérations liées à l’information expérimentale et biologique de notre expérience avec la caractérisation des cellules T spécifiques de l’antigène.

Introduction

Avec la montée des immunothérapies beaucoup, il y a un besoin d’être en mesure de caractériser et de contrôler les réponses immunitaires. En particulier, la réponse immunitaire adaptative est intéressant en raison de la spécificité et la longévité des cellules. Récemment, les thérapies de récepteurs chimériques-antigène des lymphocytes T ont été approuvés pour le traitement du cancer ; Cependant, les récepteurs d’antigènes sont basées hors de la cellule surface antigène commun CD19, au lieu des antigènes spécifiques du cancer¹. Au-delà de la spécificité, immunothérapies peuvent aussi souffrent du manque de contrôle et limitée à comprendre la ré....

Protocole

Toutes les souris ont été maintenues conformément aux directives approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université Johns Hopkins.

1. Chargez la protéine de Fusion des immunoglobulines dimère complexe majeur d’histocompatibilité (MHC-Ig) avec séquence peptidique antigène désirée.

Remarque : Si vous utilisez la H - 2Kb : Ig, puis suivre le protocole détaillé à l’étape 1.1 ; Si vous utilisez H-2Db:Ig, puis suivre le protocole détaillé dans l’étape 1.2.

1. Active le chargement de la séquence peptidique en H - 2Kb : Ig.
   1. Préparez les tampons nécessaires. Préparer le tampon de dénaturation....

Résultats

Pour compléter un enrichissement réussie et l’expansion des cellules T spécifiques de l’antigène, le peptide-chargé MHC-Ig et les molécules de costimulation doivent être fixés avec succès à la particule de vamp. Basé sur les 3 méthodes de fixation de la particule, nous fournir des données représentatives pour un résultat de procédure conjugaison réussie (Figure 5 a). En effet, si la densité de ligand est trop faible, alors il sera pas une stimulation efficace.......

Discussion

Nous avons créé une technologie d’isolement des lymphocytes de T antigène-spécifiques nouveaux issue des nanoparticules artificiel (VAMP) des cellules présentatrices d’antigènes. Vamp de nanoparticules ont peptide-chargés MHC sur la surface qui permet la liaison spécifique de l’antigène des lymphocytes T et activation aux côtés de costimulation activation. Vamp est également paramagnétique et donc peut être utilisé pour enrichir les rares cellules de T antigène-spécifiques en utilisant un champ magnétique. Nous avons opt.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DimerX I : Protéine de fusion humaine soluble recombinante HLA-A2 :Ig	BD Biosciences	551263
DimerX I : Souris dimérique soluble recombinante H-2D[b] :Ig	BD Biosciences	551323
DimerX I : Souris dimérique soluble recombinante H-2K[b] :Ig Protéine de fusion	BD Biosciences	550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000	GE Life Sciences	28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000	GE Life Sciences	28932257
Bêta humaine purifiée 2 Microglobuline	Bio-Rad	PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticules	Micromod	79-01-102
Super Mag NHS Perles activées, 0,2 & micro ; m	Ocean Nanotech	SN0200  ;
Microbilles anti-biotine UltraPure	Miltenyi	130-105-637
EZ-Link NHS-Biotine	ThermoFisher	20217
Sulfo-SMCC Réticulant  ;	ProteoChem	c1109-100mg
Chlorhydrate de 2-iminothiolane	Sigma-Aldrich	I6256 Sigma  ;
Microplaque 96 Well Half-Area, polystyrène noir	Corning	3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, &lambda ; 1, &lambda ; 2, & &lambda ; 3 Chaîne légère  ; Cloner   ; R26-46 ;   ;	BD Biosciences	553434
FITC souris anti-hamster arménien et syrien IgG  ; Cloner   ; G192-1	BD Biosciences	554026
B6. souris Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (PMEL transgénique) souris	Jackson Laboratory	005023
C57BL/6J (B6 de type sauvage)	Laboratory	000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, souris	Miltenyi	130-104-075
MS Columns	Miltenyi	130-042-201
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Streptavidine-Phycoérythrine, SAv-PE	Biolegend	405203
N52 disques magnétiques de 0,75 pouce.	K& J Magnetics	DX8C-N52
APC anticorps anti-souris CD8a, clone 53-6.7	Biolegend	100711
LIVE/DEAD Kit de coloration verte à cellules mortes vertes, pour une excitation de 488 nm  ;	ThermoFisher	L-34969

souris Jackson