Détection du monoxyde d’azote dans le sang en mesurant Phosphorylation VASP plaquettaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour répondre à l’utilisation potentielle des plaquettes comme un capteur très sensible l’oxyde nitrique dans le sang. Il décrit la préparation de plaquettes initial et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés comme générateurs de l’oxyde nitrique.

Résumé

Les plaquettes sont les responsables de la coagulation sanguine correcte des composants sanguins. Leur fonction est fortement réglementée par diverses voies. Un des plus puissants agents vasoactifs, oxyde nitrique (NO), peut aussi agir comme un puissant inhibiteur de l’agrégation plaquettaire. Direct, aucun détection dans le sang n’est très difficile en raison de sa forte réactivité avec hémoglobine acellulaire qui ne limite aucun Half-Life à la gamme de milliseconde. Actuellement, aucun changement après que des interventions sont estimées uniquement ne basée sur les changements mesurés de nitrite et de nitrate (membres de la voie métabolique nitrate-nitrite-pas). Précise toutefois, ces mesures sont assez difficiles à n’interpréter par rapport aux réelles aucune modification, en raison de la nitrite de base élevées naturellement et concentrations qui sont de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que des changements attendus pas elle-même de nitrates. Par conséquent, le développement de méthodes simples et directs qui permettraient de détecter directement les N° est depuis longtemps. Ce protocole vise une utilisation potentielle des plaquettes comme une très sensible sans capteur dans le sang. Elle qualifie plasma riche en plaquettes initial (PRP) et préparations des plaquettes lavées et l’utilisation des nitrites et de cellules rouges du sang désoxygénés de pas générateurs. La phosphorylation de la VASP à sérine 239 (P-VASP^Ser239) est utilisée pour détecter la présence de no Le fait que la protéine VASP est fortement exprimée dans les plaquettes et qu’il est phosphorylé rapidement lorsqu’il est présent conduit à une occasion unique d’utiliser cette voie pour ne détecter directement aucune présence dans le sang.

Introduction

Les plaquettes sont des fragments de petites cellules discoïdes dérivés de mégacaryocytes qui sont cruciaux pour la coagulation du sang. La cascade de coagulation est initiée par diverses molécules bioactives (comme le collagène ou ADP), publiés après la blessure de la paroi vasculaire. La processus de coagulation peut être modifiée, parmi divers effecteurs de l’oxyde nitrique (NO). Non, produite naturellement par les cellules de mammifères, est l’un des signaux physiologiques plus polyvalents. Il agit comme un puissant vasodilatateur, le neurotransmetteur et le modulateur immunitaire, pour n’en nommer que quelques-uns de ses nombreuses fonctions. Dans la circulation sanguine, donc aussi aide à réguler l’étendue de la coagulation sanguine en inhibant l’agrégation plaquettaire. Une des sources plus probables du NO dans la circulation sanguine est nitrite, un ion inorganique qui a été établi pour servir de précurseur de no Réagissant avec les globules rouges (hématies), nitrite est réduit à N° et deoxyHb est oxydé en méthémoglobine (metHb)¹. N° libéré des globules rouges est vasomoteur et provoque la vasorelaxation². Cette voie de réduction de nitrite n’est un autre aucune voie de génération, agissant conjointement avec et en ne complétant la classique aucun chemin de génération par endothélial d’oxyde nitrique synthase, à des conditions d’hypoxie.

Les plaquettes eux-mêmes ne sont pas en mesure de réduire le nitrite en NO mais sont très sensibles à sa présence. Dans les plaquettes intactes, non dans le nanomolaires gamme augmente cGMP (EC₅₀ = 10 nM) et la phosphorylation de VASP (EC₅₀ = 0,5 nM)³. Dès lors, les plaquettes peuvent servir comme un excellent capteur de réduction des nitrites par les globules rouges et aucun rejet dans le sang. Il existe plusieurs méthodes permettant de mesurer directement la mesure de l’activation plaquettaire - tels qu’aggregometry et thromboélastographie (TEG)^4,5. Cependant, ces méthodes nécessitent des instruments spécialisés coûteux et assez grandes quantités de matériel. Il est également possible de surveiller les événements en aval, après on ne se détache de globules rouges, en utilisant les changements dans l’expression de la protéine de surface plaquettaire – comme la P-sélectine⁶. N’est également connu pour augmenter la quantité de GMPC dans les plaquettes⁷. Auparavant, nous avons utilisé des cGMP pour ne suivre aucun rejet dans le sang après réduction des nitrites par désoxygéné RBC⁸. Cela s’est avéré pour être une méthode très sensible ; Cependant, cGMP est une molécule de courte durée et sa détection implique une vaste main de œuvre. Une autre possibilité, décrite dans le protocole présenté, utilise la phosphorylation de la phospho stimulée par vasodilatateur (VASP)-protéine pour détecter la présence de NO dans le sang. VASP est un substrat de l’activation de protéine kinase G, qui est phosphorylé lors de l’interaction avec les N° à la voie CGT/GMPC⁹. Détectable phosphorylation VASP se produit à très faible NO concentrations, ce qui pourraient faire de plaquettes un détecteur très sensible d’aucune présence dans le sang. VASP est fortement exprimée dans les plaquettes, mais pas dans les autres cellules sanguines, qui permet de suivre sélectivement les événements impliquant les plaquettes¹⁰.

Le principal objectif du présent protocole est de décrire la méthode dans le détail pour la détection d’aucune libération dans le sang entier à l’aide de son interaction avec les plaquettes en surveillant VASP phosphorylation^11,12. La méthode décrite ne permet la détection précoce de faible aucune concentration - théoriquement dans la gamme nanomolar qui rend le présent protocole plus sensible que la détermination de cGMP, en raison de l’utilisation de techniques de transfert Western standard réalisables dans la plupart de laboratoire Paramètres.

Protocole

Remarque : Des échantillons de sang ont été prélevés à la banque de sang de NIH (CISR a approuvé le protocole : 99-CC-0168).

1. préparation des échantillons de sang

Remarque : Pour éviter l’activation plaquettaire, prélever du sang lentement et mélanger doucement avec du citrate en renversant le tube plusieurs fois.

1. Préparation de plasma riche en plaquettes (PRP)
   1. Dessiner des 30 à 50 mL de sang à l’aide d’un 20 G ou plus gros diamètre aiguille et ajouter dans un tube contenant du citrate de sodium (3,8 %) dans un ratio de 1:9 ou dextrose citrate acide (ACD) (citrate trisodique 85 mM, 66,6 mM acidecitrique, 111 mM de glucose, pH 4,5) dans un rapport de 1:6.
   2. Aliquote 5 mL de sang fraîchement prélevé dans des vides tubes coniques 15 mL. Centrifuger le sang total à 120 x g pendant 10 min à température ambiante.
   3. Soigneusement, recueillir le surnageant contenant les plaquettes (plasma riche en plaquettes, PRP) de la partie supérieure par une pipette en plastique.
      Remarque : PRP de l’étape 1.1.3 est prêt à être utilisé dans des expériences ou pour un traitement ultérieur pour préparer les laver plaquettes. Le pellet mou obtenu après centrifugation (étape 1.1.2) contient des globules rouges et les globules blancs et peut être encore purifié pour obtenir lavé des globules rouges (RBC) — voir étape 1.3. L’expérience doit être fini à moins de 2 h après avoir dessiné le sang. Lors de la collecte des PRP (surnageant), éviter la collection de buffy coat contenant leucocytes accumulés sur l’interface PRP/RBC.
2. Préparation de plaquettes lavées (facultatif)
   1. Centrifugeuse recueillies PRP à 400 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et garder les granules plaquettaires.
   2. Laver délicatement les boulettes en ajoutant 5 mL de tampon CGS (120 mM NaCl, 12,9 mM trisodium citrate et 30 mM de glucose, pH 6,5) et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à température ambiante.
   3. Remettre en suspension les granules plaquettaires avec 3 mL de tampon de Tyrode modifiée (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 millimètres glucose pH 7,4).
   4. Diluer les plaquettes (1/100 — comme exemple, 10 µL de plaquettes en 990 µL de solution de Rees-Ecker) avec la solution de Rees Ecker et comte de hémocytomètre.
   5. Ajuster la densité des plaquettes à 3 x 10⁸ cellules/mL en ajoutant Tyrode tampon.
   6. Incuber la suspension de plaquettes à 37 ° C pendant 1 h avant de commencer l’expérience.
      Remarque : Plaquettes lavées sont stables pendant 5 – 8 h à 37 ° C.
3. Préparation des globules rouges lavés (RBC)
   1. Après le prélèvement, centrifuger le culot doux, obtenu à l’étape 1.1.3 à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante.
   2. Jeter le surnageant et laver le culot de RBC avec 5 mL de PBS par centrifugation à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante. Répétez cette étape pour 3 fois.
   3. Jeter les PBS et globules rouges lavés pour d’autres expériences.

2. désoxygénation

1. Ajouter 1 mL du mélange de PRP (préparé à l’étape 1.1.4. ou 1.2.4.) et de globules rouges (préparés à l’étape 1.3.) à l’hématocrite désiré dans un biberon en polypropylène fermé avec un bouchon en caoutchouc. Par exemple, à hématocrite de 20 %, ajouter 200 µL d’hématies à 800 µL de PRP.
   Remarque : Suggérées : hématocrite de 0 % jusqu'à 40 %. Ne pas utiliser un ballon ou une bouteille en verre comme les plaquettes adhèrent à la surface du verre.
2. Insérer l’aiguille reliée au réservoir de gaz d’hélium dans la bouteille fermée et prendre la sortie de gaz en insérant une aiguille 26 G (Figure 1).
3. Lentement, agiter le flacon à température ambiante.
   Remarque : Ne laissez pas les gaz He à bouillonner à travers la préparation. Débit de gaz lente est préférable pour cette procédure, et trop rapide débit de gaz qu’il mène à l’hémolyse accrue. Le débit de gaz plus efficace doit être déterminée par essai, car elle dépend fortement de la géométrie de l’installation expérimentale.
4. Périodiquement, suivez le processus de désoxygénation en mesurant la pression partielle d’oxygène (pO₂) à l’aide d’un oxymètre.
   Remarque : Dans nos mains, 10 min de désoxygénation diminue pO₂ à 25 mm de Hg qui est requise pour la réduction des nitrites par RBCs. continuant de désoxygénation réduisit encore pO₂ à 10 mm Hg ; Cependant, il a conduit à l’hémolyse accrue et augmentation de l’hémoglobine acellulaire (Figure 2).

3. globules rouges Nitrite réduction

1. Ajouter 1 mL de PBS (pH 7,4) en 0,0345 g de NaNO₂ pour faire la solution mère de 500 mM de nitrite. Diluer 500 mM NaNO₂ à 250 µM NaNO₂ (x 25) par dilutions dans du PBS (pH 7,4).
2. À l’aide d’une microseringue, injecter des nitrites (40 µL) à travers le septum dans l’échantillon désoxygéné de PRP et globules rouges pour obtenir la concentration finale de 10 µM total 1 ml d’échantillon.
   Remarque : Dans cette expérience, les concentrations finales des nitrites utilisés est 10 µM.
3. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 10 min ou plus.
   Remarque : Ajuster la durée exacte d’incubation RBC avec nitrite nécessaire à la réduction des nitrites maximale pour différents types d’expériences.
4. Retirez le bouchon et la pipette 1 mL de l’échantillon dans un tube de microcentrifuge.
5. Centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
6. Distribuer 300 µL de la suspension de plaquettes de la partie supérieure du liquide surnageant et mélanger avec l’ACD (pH 6,5) dans un rapport de 1:9. Jeter le culot de RBC.
7. Centrifuger la suspension de plaquettes à 500 x g pendant 4 min à température ambiante.
8. Ajouter 80 µL de tampon de lyse glacee (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5 % NP-40, pH 7,4) pastilles de cocktail III (1/500) pour les plaquettes contenant des inhibiteurs de la protéase.

4. Immunobuvardage de VASP

1. 15 µg de la protéine de la charge de chaque échantillon à 2 gels de SDS-PAGE 10 % distincts.
   Remarque : Tampon de décapage sévère, qui contient le b-mercaptoéthanol, impossible de supprimer P-VASP^Ser239 et VASP anticorps de la membrane ; par conséquent, la P-VASP ^Ser239 et VASP doivent être analysés séparément.
2. Exécuter les gels à 120 V pour 1 h 30 et le transfert de la membrane de nitrocellulose.
3. Bloc non-spécifiques avec 5 % de lait écrémé.
4. Incuber la membrane avec P-VASP^Ser239 (1/500), VASP (1:1, 000) et GAPDH (1:1, 000) pour la nuit à 4 ° C.
5. Incuber les anticorps secondaire de raifort peroxydase de raifort (HRP) avec la membrane pendant 45 min à température ambiante.
6. Exposer la membrane avec un appareil imageur et quantifier la densité de la bande à l’aide de ImageJ.

Résultats

Échantillons de sang veineux ont des valeurs de₂ pO entre 50-80 mmHg. Désoxygénation de hélium diminue rapidement pO₂ à 25 mmHg dans 10 min. accrue désoxygénation temps un peu plus loin des diminutions pO₂. Cependant, augmentation du temps de désoxygénation conduit également à des niveaux sensiblement accrus d’hémoglobine acellulaire (déterminé par co-oxymétrie, vu visuellement sur la Figure 2 que la coloration rouge de plus e...

Discussion

Étant donné que les plaquettes sont facilement activées, douce manipulation plaquettes contenant des échantillons est nécessaire. Rapide de pipetage et secouant vigoureux doivent être évités. Plaquettaires tels que de la prostacycline (PGI₂) peuvent être utilisés pour prévenir l’activation des plaquettes ; Toutefois, cela pourrait affecter certaines voies de signalisation à l’intérieur des plaquettes. Pour la préparation de boulettes de plaquettes, nous ajouter ACD pour les suspensions de plaquettes et centrif...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Citrate trisodique	Approvisionnement par la banque de
Acide citrique	Approvisionnement par la banque de
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl ; chlorure de sodium	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4 ; phosphate de sodium monobasique, monohydraté	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl ; chlorure de potassium	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3 ; bicarbonate de sodium	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES ; N-[2-Hydroxyéthyl]pipérazine-N'-[-éthanesulfonique]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M) ; chlorure de magnésium	Qualité Biologie	351-033-721
CaCl2 ; chlorure de calcium	Sigma	C5080-500G
Nalgene Bouteilles HDPE à col étroit Bouteilles économiques	Nalgene	2089-0001
Septum rouge bouchon NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2- ; nitrite de sodium	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base ; Tris[hydroxyméthyl]aminométhane	Sigma	T8524-250G
NP-40 ; 4-Nonylphényl-polyéthylène glycol	Sigma	74385-1L
Ensemble de cocktails inhibiteurs de protéase III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) Anticorps		3114
Anticorps VASP	Technologie de signalisation cellulaire	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Technologie de signalisation cellulaire	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrat	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oxymètre (ABL 90 flex)	Radiomètre