פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.
RNAs חוץ-תאית, מחזורי (exRNA) מיוצרים על ידי סוגי תאים רבים של הגוף, קיימים רבים בנוזלי גוף שונים כגון, פלזמה, סרום, חלב שתן ורוק. תת-קבוצה אחת של אלה RNAs הן הרגולטורים posttranscriptional – מיקרו Rna (miRNAs). להתוות את miRNAs המיוצר על ידי סוגי תאים ספציפיים, מערכות התרבות במבחנה ניתן לקצור, פרופיל exRNAs נגזר ערכה אחת של תאים. הגורמים המופרש של גזע mesenchymal הם מעורבים שיכוך במחלות רבות ומשמשת כמערכת מודל במבחנה כאן. מאמר זה מתאר את התהליך של איסוף, טיהור של RNA קטנים, ספריית לדור רצף miRNAs חוץ-תאית. ExRNAs ממדיה תרבות שונים מ- RNA הסלולר על ידי כך נמוך דגימות קלט של RNA, שלאיראן נהלים מיטביים. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף כדי exRNA קטן רצף ממדיה תרבות, מציג בקרת איכות מחסומים בכל שלב במהלך טיהור exRNA ורצף.
חוץ-תאית ופיזור RNAs (exRNAs) הן נוכח נוזלי גוף שונים עמידים לכיוון RNases1,2. שפע גבוהה, היציבות וקלות הנגישות שלהם הם אטרקטיביים להערכה קלינית סמנים אבחון ו prognostic3. מצב התחבורה עבור exRNAs כוללים חוץ-תאית שלפוחית (EVs), שיוך lipoproteins (כגון ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה; HDL) ואת מתחמי ribonucleoprotein (כגון עם מתחמי Argonaute2)4.
תת-קבוצה של exRNAs הם מיקרו Rna (miRNAs), אשר הם קטנים ללא קידוד RNAs של 22 nt המווסתים ביטוי גנים posttranscriptional. לשעבר-miRNAs היו מעורבים תקשורת ורגולציה של הומאוסטזיס תא5. לדוגמה, ה-HDL מספק לשעבר-מיר-223 לתאי אנדותל להדחיק אדהזיה המערכת מולקולה 1 (ICAM-1) ודלקת6. מעניין, מיר-223 גם נתפסת מועבר על ידי שלפוחית חוץ-תאי של לויקוציטים לתאי סרטן ריאות, תכנות אותם לקחת על פנוטיפ פולשניים יותר7. לפיכך, transcriptome של לשעבר-miRNAs מ בנוזלי הגוף השונים, תא תרבות בינוני ישפרו הבנתנו לשעבר-miRNA איתות.
RNA קטנים רצף (seq RNA קטנים) הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי להבין את transcriptomics של RNAs קטן. לא רק דוגמאות שונות ניתן להשוות בין ביטוי באופן שונה RNAs ידוע, אבל הרומן RNAs קטן גם ועוזרת מאופיין. כתוצאה מכך, זה גם שיטה חזקה כדי לזהות באופן שונה ביטוי miRNAs בתנאים שונים. עם זאת, אחד הקשיים של seq RNA קטנים הוא הקושי ליצירת ספריות seq RNA קטנות של נוזלים קלט exRNA נמוך כמו נוזלים מוחי שדרתי, רוק, שתן, חלב, סרום ומדיה תרבות. פרוטוקול TruSeq RNA קטנים הספרייה במכינה מ אילומינה דורש כ 1 µg של RNA סך באיכות גבוהה ודורשת פרוטוקול NEBNext קטן RNA הספרייה במכינה להגדיר מ ניו אינגלנד Biolabs 100 µg ng-1 /8,רנ א9. לעיתים קרובות, RNA הכולל מדגימות אלו הם מתחת למגבלה זיהוי עבור מכשירים UV-vis קונבנציונלי.
לשעבר-miRNAs נגזר נוזלי הגוף הם סמנים prognostic ואבחון פוטנציאל טוב. עם זאת, על מנת לחקור את ההשפעות פונקציונלי או כדי לקבוע את מקור ספציפי לשעבר-miRNAs, מערכות התרבות תאים משמשים לעתים קרובות במקום. גזע mesenchymal (MSCs) נחקרו בהרחבה כי היו מעורבים שלהם EVs שיכוך במחלות רבות, כולל אוטם שריר הלב, מחלת אלצהיימר, שתל מול מארח מחלות10. כאן, נדגים הטיהור של לשעבר-miRNAs מ MSCs הנגזרות מח העצם (BMSCs) והשלבים ספציפיים השתמשו כדי לייעל הבנייה ספריית RNA קטנים, רצף וניתוח נתונים (איור 1).
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור רצף הדור הבא של exRNAs המאפשרת ניתוח דיפרנציאלית ביטוי מדגימות קלט נמוך. הקפדה על פרוטוקול ספציפי לבידוד EV ו exRNA חשוב כי שינויים קטנים אפילו (קרי, השלב ultracentrifugation או שינוי בסוג רוטור) יכולים להשפיע על transcriptome, miRNA רמות13,14‘. לפיכך, לל…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים על מר קלאוס אוטובוס, גב’ ריטה Rosendahl-iNANO לסיוע טכני שלהם. תודה מיוחדת ד ר דניאל Otzen להתרת השימוש שלו ultracentrifuge תכופים. מחקר זה נתמך על ידי קרן חדשנות דנמרק (מסדר פרוייקט).
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
Bedtools | To make the expression profile in step 6 |