Escherichia coli-base de la synthèse protéique acellulaire : protocoles pour une technologie de plate-forme robuste, flexible et accessible

Résumé

Ce protocole détaille les étapes, les coûts et équipements nécessaires pour générer des e. coli-extraits cellulaires de base et mettre en œuvre en vitro réactions de synthèse de protéines dans les 4 jours ou moins. Pour tirer parti de la souplesse de cette plate-forme pour les applications larges, nous discutons des conditions de réaction qui peuvent être adaptées et optimisées.

Résumé

Au cours des 50 dernières années, la synthèse de protéine acellulaire (CFPS) est devenue une technologie puissante pour exploiter la capacité transcriptionnelle et translationnelle des cellules dans un tube à essai. En évitant la nécessité de maintenir la viabilité de la cellule et en éliminant la barrière cellulaire, PFC a été fondamentale aux applications émergentes en biofabrication de protéines traditionnellement difficiles, ainsi que des applications de prototypage rapide pour génie métabolique et la génomique fonctionnelle. Nos méthodes de mise en œuvre d’un e. coli-plateforme PFC permettre à nouveau aux utilisateurs d’accéder à bon nombre de ces applications. Nous décrivons ici les méthodes pour préparer l’extrait par l’utilisation de milieux enrichis, flacons déroutés et une méthode reproductible de la lyse cellulaire de base sonication accordable. Cet extrait peut ensuite servir pour l’expression de la protéine capable de produire 900 µg/mL ou plus de la protéine fluorescente de super dossier vert (sfGFP) dans seulement 5 h de montage expérimental à l’analyse des données, étant donné que les stocks de réactifs appropriés ont été préparés préalablement. Le coût estimatif de démarrage d’obtenir des réactifs est $ 4 500 qui soutiendront des milliers de réactions à un coût estimatif de 0,021 $ par µg de protéines produites ou 0,019 $ par µL de réaction. En outre, les méthodes d’expression de protéine en miroir la facilité de l’installation de réaction vue dans les systèmes disponibles dans le commerce grâce à l’optimisation des mélanges réactifs, à une fraction du coût. Afin de permettre à l’utilisateur de tirer parti de la souplesse de la plate-forme de produits forestiers certifiés pour des applications larges, nous avons identifié les divers aspects de la plate-forme qui peut être à l’écoute et optimisé selon les ressources disponibles et des résultats d’expression de protéine vous le souhaitez.

Introduction

Synthèse de protéine acellulaire (CFPS) a émergé comme une technologie qui a débloqué un certain nombre de nouvelles opportunités pour la production de protéines, génomique fonctionnelle, génie métabolique et plus encore dans les derniers 50 ans^1,2. Par rapport à la norme en vivo plates-formes expression de protéine, CFPS offre trois avantages principaux : 1) la nature acellulaire de la plate-forme permet la production de protéines qui seraient potentiellement toxiques ou étrangers à la cellule^{3,4 <....}

Protocole

1. médias préparation et croissance cellulaire

1. Jour 1
   1. Cellules d’Escherichia coli BL21*(DE3) Streak d’un glycérol stock sur une gélose LB et incuber pendant au moins 18 h à 37 ° C.
   2. Préparer 50 mL de médias LB et stériliser la solution sur un cycle de liquid pendant 30 minutes à 121 ° C. Conserver à température ambiante.
2. Jour 2
   1. Préparer 750 mL de 2 x YTP médias et 250 mL de 0,4 M de D-Glucose solution comme indiqué dans les informations supplémentaires.
   2. Versez les 2 médias de la x YTP dans une fiole dérouté stérilisés à l’autoclave de 2,5 L et la solu....

Résultats

Nous avons présenté une sonication basée sur e. coli extrait protocole de préparation qui peut être effectué sur une période de quatre jours, avec la Figure 1 montrant la ventilation procédurale au cours de chaque journée. Il n’y a malléabilité aux étapes qui peut être accomplie chaque jour avec différents points de suspension, mais nous avons trouvé ce flux de travail la plus efficace d’exécuter. En outre, les granules cellulaires (étape 1.3.18) et .......

Discussion

La synthèse protéique acellulaire est devenue une technologie puissante et propice pour une variété d’applications allant de la biofabrication de prototypage rapide de systèmes biochimiques. L’ampleur des demandes est pris en charge par la capacité à contrôler, manipuler et d’augmenter la machinerie cellulaire en temps réel. En dépit de l’impact grandissant de cette technologie de plate-forme, adaptation large est restée lente en raison des nuances techniques dans la mise en œuvre des méthodes. Grâce à cet effort, nous v.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon Luria	ThermoFisher	12795027
Tryptone	Fisher Bioréactifs	73049-73-7
Extrait de levure	Fisher Bioréactifs	1/2/8013
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1KG
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	60353-250G
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P9791-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
	KOH Sigma-Aldrich	P5958-500G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
	DTT ThermoFisher	15508013
ARNt	Sigma-Aldrich	10109541001
Acide folinique	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
NTP	ThermoFisher	R0481
Acide oxalique	Sigma-Aldrich	P0963-100G
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
NH4(Glu)	MP Biomedicals	02180595.1
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
HEPES	ThermoFisher	11344041
Eau de qualité moléculaire	Sigma-Aldrich	7732-18-5
Acide L-Aspartique	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
L-Tryptophane	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Phénylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Méthionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Fisherbrand Premium Tubes de microcentrifugation : 2,0 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Tubes de microcentrifugation Fisherbrand Premium : 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Tubes de microcentrifugation Fisherbrand Premium : 0,6 mL	Fisher Scientific	05-408-120
Kit de préparation de plasmide PureLink HiPure		ThermoFisher K210007
	Sonde QSonica	Q125-230V/50Hz	3,175 mm de diamètre
Centrifugeuse Avanti J-E Beckman	Coulter	369001
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
1L Tube de centrifugation	Beckman Coulter	A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
Nouveau-Brunswick Innova 42/42R Incubateur	Eppendorf	M1335-0000
Cytation 5	BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit	IBA	2-4998-000
pJL1-sfGFP	Addgene	69496
BL21(DE3)	New England BioLabs