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Expansion de nanofibres Électrofilées dimension deux nattes en trois dimensions les échafaudages

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DOI :

10.3791/58918

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7 janvier 2019

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1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

Dans cet article

Résumé

Cet article illustre la technique d’élargir une natte de nanofibres électrofilées (2D) traditionnel, de deux-dimension en échafaudage tridimensionnels (3D) par le biais de la dépressurisation du sous-critique CO2 fluide. Ces échafaudages augmentés sont en 3D, indices étroitement mimiques nanotopographic cellulaires et préserver les fonctions des molécules biologiques encapsulés dans les nanofibres.

Résumé

Électrofilage a été la technologie de choix dans la production d’un échafaud synthétique, fonctionnel en raison de la "biomimétisme" à la matrice extracellulaire et le contrôle de la facilité de composition, structure et diamètre des fibres. Cependant, malgré ces avantages, nanofibres électrofilées traditionnels échafaudages viennent avec des limitations notamment désorganisé nanofibres orientation, faible porosité, petits pores et des tapis principalement à deux dimensions. Par conséquent, il y a un grand besoin pour développer un nouveau procédé de fabrication d’échafaudages de nanofibres électrofilées qui peuvent surmonter les limitations ci-dessus. Ici, une méthode nouvelle et simple est décrite. Un tapis de nanofibres 2D traditionnel se transforme en un échafaudage 3D avec l’épaisseur désirée, la distance de gap, porosité et nanotopographic repères permettant l’ensemencement de la cellule et la prolifération par l’intermédiaire de la dépressurisation du sous-critique CO2 fluide. En plus de fournir un échafaudage pour la régénération des tissus de se produire, cette méthode fournit également la possibilité d’encapsuler des molécules bioactives, tels que des peptides antimicrobiens pour la livraison de drogue local. Les CO2 élargi nanofibres Échafaudages tenir grand potentiel dans la régénération des tissus, la cicatrisation des plaies, modélisation 3D tissus et la livraison de médicaments topiques.

Introduction

Le concept de développer un échafaud synthétique qui peut être implanté sur des patients à l’aide à la régénération et la réparation des tissus est celui qui a imprégné le domaine de la médecine régénérative pendant des décennies. L’échafaud synthétique idéale sert à induire la migration cellulaire des tissus sains avoisinants, fournit une architecture pour la vascularisation de cellule ensemencement, adhérence, signalisation, la prolifération et la différenciation, de supports, permettant une oxygénation adéquate et livraison de la nutrition et favorise l’activité immunitaire de l’hôte pour assurer le succès après implantation1. En outre, il peut être utilisé comme support pour l’enrobage des molécules antimicrobiennes pour aider à la cicatrisation de1,3,6,7,8,9. La capacité de contrôler la libération temporelle de ces molécules biologiques de l’échafaud synthétique est un autre attribut souhaitable que l'on considère quelle ingénierie échafaudages1.

Électrofilage a été une technique bien exploitée pour la production de nanofibres Échafaudages1,2,3,4,5,6. Les tentatives précédentes pour créer un échafaudage de nanofibres comme celle examinée ici ont été réalisées à des degrés divers de succès. Cependant, nanofibres traditionnels échafaudages ont limité les capacités pour atteindre ces objectifs. Échafaudages de nanofibres traditionnels ont été généralement deux dimensions tapis1,3. Ces échafaudages nonexpanded sont densément emballés avec la taille des petits pores ; Cela limite l’infiltration cellulaire, migration et différenciation car il ne favorise pas un environnement suffisamment semblable à ceux trouvés dans vivo1,7,8,9. Pour cette raison, de nouvelles techniques de préparation d’échafaudage nanofibres électrofilées 3D ont été établis en vue de modifier les failles qui viennent avec des nattes de nanofibres 2D. Ces techniques entraînent des échafaudages 3D ; Cependant, ils ont limité l’applicabilité en raison des méthodes de production nécessitant des solutions aqueuses et de lyophilisation des procédures. Ce traitement entraîne la distribution aléatoire de la nanofibres sans organisation restreinte, épaisseur appropriée et/ou porosité désirée pour offrir les nanotopographic adéquate des repères qui sont nécessaires à la prolifération et la migration cellulaire. Ces facteurs se traduisent par les précédente échafaudages de nanofibres électrofilées 3D qui n’ont pas mimétisme adéquate de la vie tissus1,7,8,9.

Plus récentes tentatives visant à développer un échafaudage élargi, 3D avec le meilleur "biomimétisme" de la matrice extracellulaire (mec) ont été réalisées à l’aide d’un traitement en solution borohydrure (NaBH4) sodium aqueux et moules prédéfinis afin d’aider à mieux contrôler la forme de l’échafaudage7,8. Toutefois, cette méthode n’est pas idéale car il nécessite l’utilisation de solutions aqueuses, les réactions chimiques et lyophilisation qui peut-être interférer avec les polymères et les biomolécules encapsulé qui sont solubles dans l’eau. Les additifs utilisés peuvent également provoquer des effets secondaires au cours de la régénération de tissus8,9. La méthode d’expansion de CO2 , décrite dans cet article, considérablement réduit le temps de traitement, élimine le besoin de solutions aqueuses et préserve le montant et la fonctionnalité de molécules biologiquement actives à une plus grande mesure que l’été méthodes établies9.

Dans des études antérieures, antibiotiques, argent, 1α, 25 dihydroxyvitamine D3et peptide antimicrobien LL-37 ont été chargés dans les échafaudages de nanofibres, individuellement ou en combinaison pour étudier le potentiel de ces échafaudages de libérer des agents à mieux aider à la cicatrisation9,10,12,13. Aux fins de démontrer cette méthode d’expansion échafaudage nanofibres, Coumarine 6, un colorant fluorescent, seront chargées dans l’échafaudage pour démontrer le potentiel d’incorporation de l’échafaud avec divers composés désirés. Cette méthode de fabrication d’échafaudage nanofibres élargi en conjonction avec des molécules bioactives encapsulés un grand potentiel dans la régénération des tissus, la cicatrisation des plaies, la création de modèles 3D de tissu et l’administration topique de médicaments.

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Protocole

Toutes les procédures en vivo décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité IACUC à l’University of Nebraska Medical Center.

1. préparer les Solutions Standard électrofilage

  1. Dans un tube de verre de 20 mL, dissoudre 2 g de poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) dans un mélange de solvants de dichlorométhane (DCM) et N, N-diméthylformamide (DMF) avec une ration de 4:1 (v/v) à une concentration de 10 % (p/v).
    Attention : Poignée DCM et DMF sous une hotte ventilée pour éviter l’exposition aux fumées. Ne pas exposer le DCM pour matières plastiques.
  2. Placer le tube de verre dans un agitateur lab jusqu'à ce que la solution devienne claire. La solution peut mélanger du jour au lendemain.
  3. Si l’intention d’intégrer des matériaux bioactifs tels que des peptides ou des médicaments dans l’échafaudage, créez une solution séparée et stocker à la 4 ° C jusqu’au moment de l’utiliser.
    1. Préparer la solution de colorant fluorescent (50 mg/mL) à l’aide de 20 mL de solution PCL.

2. mettre en place l’appareil électrofilage (Figure 1 a)

  1. Ajouter la solution PCL à une seringue de 20 mL avec une aiguille émoussée de 21 calibre attachée. S’assurer qu’il n’y a pas d’air dans la seringue et la tuyauterie associée.
  2. Placez un tambour en acier avec le collecteur de terre 12 cm de l’extrémité de l’aiguille.
  3. À l’aide de pinces crocodile, connectez l’alimentation haute tension courant continu (DC) à l’aiguille, puis assurez-vous que le collecteur est relié à la terre.
    Attention : Toujours couper l’alimentation électrique avant de manipuler n’importe quel matériel connecté.

3. électrofilage

  1. Pour les 20 mL de solution PCL, définir les paramètres de la pompe à seringue comme suit : diamètre = 20,27 mm, débit = 0,5 mL/h. vérifier si les gouttelettes sont forment à l’extrémité de l’aiguille.
  2. Si vous souhaitez l’incorporation de molécules bioactives, mis en place l’appareil pour permettre coaxiaux électrofilage (Figure 1 b). Créer une buse coaxiale personnalisée à l’aide d’aiguilles hypodermiques.
    Remarque : Ces buses sont également disponibles dans le commerce. Notez qu’une solution de colorant est prête à simuler l’ajout de ces molécules.
    1. Préparer une solution à 1 % du colorant fluorescent 6 coumarine dans l’eau. Ajouter 3 mL de teinture 1 % d’une petite seringue. Connecter la seringue à la buse coaxiale même comme la solution PCL. Une fois de plus, s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air.
    2. Pour 3 mL de cette solution, définissez les paramètres de la pompe à seringue comme suit : diamètre = 9,49 mm, débit = 0,02 mL/h. vérifier si les gouttelettes sont forment à l’extrémité de l’aiguille.
  3. Appliquer un potentiel électrique de 20 kV entre la filière (aiguille de calibre 22) et un collecteur de terre situé à 20 cm de distance de la filière. Recueillir les nattes de nanofibres alignées dans un tambour tournant à 2 000 tr/min. Recueillir les nattes de nanofibres PCL dès qu’ils atteignent une épaisseur d’environ 1 mm.

4. génération de nanofibres PCL tapis troué rangés.

  1. Fabriquer des tapis de nanofibres PCL.
    1. Dissoudre les perles PCL dans un mélange composé de DCM et DMF avec un ratio de 4:1(v/v) à une concentration de 10 % (PCL) (p/v). La solution PCL de pompe à un débit de 0,7 mL/h à l’aide d’une pompe à seringue tout en un potentiel de 20 kV est appliquée entre la filière (une aiguille de 22-gage) et un collecteur de mise à la terre situé 12 cm en dehors de la filière.
    2. Recueillir la membrane de nanofibres par un tambour rotatif avec une vitesse de rotation supérieure à 500 tr/min.
  2. Immerger les nattes de nanofibres PCL en liquide N2 pendant 5 min (i.e., devenir raide). Garder les nattes de nanofibres PCL en liquide N2 et tapis de nanofibres PCL, percez avec un coup de poing 0,5 mm de diamètre.

5. expansion des nanofibres 2D nattes avec ou sans trous rangés par sous-critique CO2 liquide (Figure 2).

  1. Placez les tapis de nanofibres PCL dans l’azote liquide pendant 5 min et couper en carrés de 1 cm x 1 cm à l’aide des ciseaux chirurgicaux tranchants submergé dans l’azote liquide pour éviter de déformer les bords.
  2. Placer le tapis de découpe dans un tube à centrifuger 30 mL avec ~ 1 g de glace sèche. Étroitement, bouchon du couvercle et permettent la glace sèche à se transformer en liquide de CO2.
  3. Une fois que le liquide a formé dans le tube, relâcher rapidement la pression en ouvrant le bouchon.
    Attention : Utilisez un équipement de protection thermique adéquat lorsque vous travaillez avec l’azote liquide et glace carbonique. Ne pas ouvrir le tube sous pression vers le visage. Le tube à centrifuger ne doit pas être utilisé à plusieurs reprises.
  4. Retirez et observer l’échafaud soufflé dans le tube. Placer l’échafaudage dans un nouveau tube à centrifuger à la glace sèche et répétez jusqu'à ce que l’épaisseur désirée est obtenue. Stériliser les échafaudages nanofibres élargi à l’oxyde d’éthylène avant l’incubation avec les cellules.

6. caractérisation des échafaudages de nanofibres élargi

  1. Caractériser la morphologie et la structure des échafaudages nanofibres élargi à l’aide de la microscopie électronique à balayage (SEM).
    1. Placer les échantillons avec ADHESIF double face aux montants métalliques et manteau avec platine pour 40 s à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique à 40 mA.
    2. Examiner les fibres à l’aide de SEM selon de précédentes études9. Recueillir les images à une tension d’accélération de 15 kV.
  2. Caractériser les profils de libération in vitro et bioactivité des peptides libérés.
    1. Poids 10 mg de nanofibres membranes avant et après l’expansion en CO2.
    2. Plonger les échantillons dans le tampon PBS et collecter 10 μL de surnageant à des moments différents (0 à 28 jours).
    3. Kit d’enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) permet de quantifier la concentration de peptide de LL-37 dans le liquide surnageant collecté.
  3. Examiner l’infiltration cellulaire in vivo et hôte de réponse.
    1. Mettre les rats Sprague-Dawley (SD) 9 - semaine vieux dans une chambre de l’anesthésie, se connecter à la vapeur d’isoflurane et anesthésier les rats. Transférer les rats à une table d’opération après que les rats deviennent une anesthésie complète sans sentiments. En permanence, anesthésier les rats à l’aide d’un cône d’isoflurane-nez avec vaporisateur pendant la chirurgie. Raser les poils du dos de rat de rasoir de l’animal et stériliser avec gommage peau iode et d’alcool. Créer des poches sous-cutanée par incisions de 1,5 cm supraspinales sites sur le dos à l’aide d’un scalpel.
    2. Insérez un échafaudage de nanofibres élargi (1,5 mm d’épaisseur) dans la poche sous-cutanée à l’aide de pincettes pour chaque incision. Refermer l’incision à l’aide d’une agrafeuse.
    3. 1, 2 et 4 semaines, euthanasier les rats avec 95 % de CO2. Doucement disséquer l’explant et les tissus environnants à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Avant l’analyse histologique, plonger le tissu dans du formol pendant au moins 3 jours et ensuite incorporer avec de la paraffine. Section le tissu avec un microtome, puis effectuez l’hématoxyline et éosine (H & E), coloration trichrome de Masson.

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Résultats

L’efficacité d’élargir pour tapis de nanofibres électrofilées 2D traditionnelle en échafaudages 3D par l’intermédiaire de dépressurisation du sous-critique CO2 liquide a été démontrée en différentes capacités : l’épaisseur des échafaudages est passée de 1 mm lorsqu’elle n’est pas traité à 2,5 mm et 19,2 mm avec une ou deux CO2 traitements, respectivement (Figure 3 a-C). La porosité-a la caractéristique de l’architecture ...

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Discussion

Ou comment transformer tapis de nanofibres électrofilées 2D traditionnelle élargies échafaudages 3D via CO2 dépressurisation a été étudiée. Tapis de nanofibres 2D traditionnels sont avec succès développé via sous-critique CO2 fluides. Les étapes essentielles sont à fabriquer des tapis de nanofibres 2D sous une condition optimisée et couper les tapis sans déformer les bords (e.g., en utilisant sharp ciseaux chirurgicaux). Cette CO2-échafaudages de nanofibres élar...

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Déclarations de divulgation

Auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institute of General Medical Science (NIGM) aux NIH (2P 20 GM103480-06 et 1R01GM123081 à J.X.), les fonds Otis Glebe Medical Research Foundation, NE LB606 et le démarrage de l’University of Nebraska Medical Centre.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
PolycaprolactoneSigma-Aldrich440744
N,N-DiméthlyformamideFisher ChemicalD-199-1
DichlorométhaneFisher ChemicalAC61093-1000
Coumarine 6Sigma-Aldrich546283
Tambour en acier rotatifpersonnaliséIl sert de collecteur pendant l’électrofilage.
Pousse-seringueFisher Scientific14-831-200filature coaxiale nécessite deux pousse-seringues simples.
RevolverLab Net InternationalH5600Rotateur de laboratoire réglable pour le mélange de solutions
Aiguille hypodermique (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Ceci fait partie de l’exemple de nozzel coaxial personnalisé illustré.
Aiguille hypodermique (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416Ceci fait partie de l’exemple de nozzel coaxial personnalisé montré.
Alimentation CC haute tensionGamma Haute tension RechercheES30
Microscope électronique à balayageFEINova 2300
ZeissAxio Imager 2
LL 37 Kit ELISAHycult BiotechHK321-02
La Microscope à fluorescence

Références

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Mots-clés

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