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Cellule analyse de contrainte de cisaillement en direct sur Pseudomonas aeruginosa en utilisant un système automatisé de microfluidique de débit supérieur

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DOI :

10.3791/58926

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16 janvier 2019

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1Department of Chemistry, Doane University, 2Department of Biology, Doane University, 3Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Physics and Engineering, Doane University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici l’utilisation d’un bioréacteur de microfluidique un débit plus élevé couplé avec un microscope à fluorescence pour l’analyse des effets de la contrainte de cisaillement sur les biofilms de Pseudomonas aeruginosa exprimant des protéines fluorescentes vertes, y compris les instruments mettre en place, la détermination des propriétés morphologiques, taux de croissance et couverture de biofilm.

Résumé

Un débit plus élevé microfluidique in vitro bioréacteur couplé avec la microscopie de fluorescence a été utilisé pour étudier la croissance de biofilm bactérien et la morphologie, notamment Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ici, nous allons décrire comment le système peut être utilisé pour étudier la cinétique de croissance et les propriétés morphologiques tels que la rugosité de la surface et l’entropie textural de souche P. aeruginosa PA01 qui exprime une protéine fluorescente verte améliorée (PA01-EGFP ). Un protocole détaillé décrira comment faire pousser et de semences de cultures PA01-EGFP, comment définir le microscope et autorun et procéder à l’analyse d’image pour déterminer le taux de croissance et propriétés morphologiques en utilisant une variété de forces de cisaillement qui sont contrôlés par le dispositif microfluidique. Cet article fournira une description détaillée d’une technique pour améliorer l’étude des biofilms PA01-EGFP qui éventuellement peut être appliquées vers d’autres souches de bactéries, des champignons ou des algues, des biofilms en utilisant la plate-forme microfluidique.

Introduction

Ici, nous allons démontrer une méthode pour mesurer l’effet de la contrainte de cisaillement sur la formation de fluorescent biofilms Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 à l’aide d’un système automatisé de microfluidique un débit plus élevé.

Les biofilms sont des communautés de microorganismes, tels les bactéries, organisés par une substance polymérique extracellulaire qui sont attachés à un support et se trouvent généralement à l’interface entre un liquide et une surface solide1. Ces communautés de biofilm peuvent être bénéfiques pour l’environnement, tels que l’amélioration de qualité de l’eau dans les conduites d’eau et dans la biorestauration des récalcitrants composés de2,3. Toutefois, les biofilms peuvent également être très nocifs pour la santé humaine avec des conséquences fâcheuses. Par exemple, des dispositifs médicaux, tels que les implants de la hanche et du genou, sont un type de surface où l’accumulation de biofilm a été un défi et provoque des complications médicales graves4,5. Les biofilms peuvent également entrer dans les systèmes naturels de l’eau, comme les rivières et lacs et s’infiltrer dans les conduites d’eau menant à la contamination de bactéries dans l’eau potable entraînant infections6,7,8. Les biofilms formées en milieu marin adhèrent aux navires et autres substrats artificiels et présenter un problème économique et environnemental majeur comme la friction accrue conduit à augmenter la consommation de carburant9,10. Des revêtements antimicrobiens, tels que de tributylétain, ont été développés pour prévenir ces problèmes, mais sont toxiques pour les animaux marins,11.

P. aeruginosa est une bactérie Gram-négative avec hautes capacités prospères dans une variété de conditions environnementales et éducationnels12. P. aeruginosa est une cause fréquente d’infections contractées à l’hôpital et à la communauté et trouvé pour être étroitement associés aux blessures, tels que des brûlures graves et les immunodéprimés, comme dans la mucoviscidose (CF)5,12, 13, sida et cancer patients5,13. La formation de biofilms P. aeruginosa a été plus gravement connectée au CF, où les infections pulmonaires chroniques sont la principale cause de mortalité pour cette maladie5.

Une souche P. aeruginosa, PA01, référence est utilisée dans le présent rapport et est génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente verte améliorée (PA-EGFP). EGFP représente une forme mutante de GFP avec une plus grande propriétés de fluorescence qui permet l’analyse in situ biofilm à l’aide de la microscopie de fluorescence14,15,16. Ce type d’analyse de fluorescence est avantageux pour l’étude des biofilms car GFP ne gêne pas significativement la croissance cellulaire et la fonction17. Par exemple, des cellules d’Escherichia coli qui ont été marqués avec GFP a grandi bien et en permanence sans avoir subi aucun effet toxique en comparaison avec les bactéries de contrôle17. Autres rapports de justifier cette revendication18,19,20. En outre, l’utilisation d’un reporter fluorescente comme EGFP est rapide et simple, pourtant on mesurera des cellules vivantes uniquement parce que les cellules mortes cessent rapidement de réagissent en21.

Les biofilms peuvent se développer dans des conditions environnementales différentes, y compris ceux avec des débits différents. Par exemple, films peuvent croître dans des contraintes de cisaillement élevées, comme dans les rivières, où les conditions d’écoulement de l’eau mènent à une plus grande diversité microbienne22. Au contraire, l’eau stagnante dans les étangs ou les biofilms orale expérience une beaucoup plus faible cisaillement force23. En plus de la vitesse d’écoulement, d’autres facteurs qui influencent l’adhérence du biofilm, y compris la rugosité de la surface et l’hydrophobicité, composition de médias, et même le bacterial cell surface1,4,7, 24. conditions peuvent aussi causer des variations dans la structure spatiale ou la morphologie d’un biofilm. Cela comprend les facteurs environnementaux tels que la contrainte de cisaillement exercée par un fluide en mouvement ou dégradés dans la disponibilité des nutriments et de facteurs biologiques, tels que les espèces présentent dans le système, la motilité des cellules et les protéines spécifiques présentes dans l’extracellulaire substance polymérique25,26,27. Sous certaines conditions, le biofilm sera pelouse ressemblant (lisse et plat), alors que dans d’autres conditions le biofilm vont être rugueuse, moelleux, ou même champignon28. Alors que la différence qualitative entre les pelouses de biofilm et structures aux champignons peut être clairement vus dans des images microscopiques, comprendre la relation entre structure cinématographique et des processus biologiques dans le film il faut systématique et quantitative méthodes de description de la morphologie. Propriétés morphologiques suggérées pour étude par les chercheurs incluent porosité, dimension fractale, longueur de diffusion, zone microcolonie au substrat, microcolonie volume, coefficient de rugosité et entropie texturales29,30 .

Bioréacteurs sont utilisés dans l’étude de biofilms pour imiter la vie réelle des conditions31. Réacteurs d’écoulement goutte à goutte (DFR) constituent un environnement de faible cisaillement où les éléments nutritifs dans les médias passent lentement dans l’ensemble de cellules qui sont attachés à une surface au fil du temps pour former un biofilm avec une cellule haute densité32. Les réacteurs de CDC sont des bioréacteurs qui créent un environnement fluide haute contrainte de cisaillement en contrôlant un agitateur qui tourne en permanence au sein des médias remplis le réservoir33. Ces types de bioréacteurs sont simples à mettre en place, mais elles sont limitées dans le champ d’application en raison de la taille de l’échantillon relativement faible, la forte consommation des médias, de grandes quantités de déchets danger biologique produit à partir de flux de goutte à goutte de médias allant de 125 µL/min pour les réacteurs d’écoulement goutte à goutte à plus de 1 mL/min pour les réacteurs de la CDC et la nécessité d’autoclave grandes quantités de déchets et verrerie médias34. Biofilms ne poussent pas uniformément sur toute la surface dans un réacteur à flux goutte à goutte parce que la faible cisaillement des médias provoque la fuite le long des plus grands conglomérats de P. aeruginosa bactéries donc, la croissance de biofilm n’est pas très lisse et les échantillons inégales ne peut pas être facilement analysés par microscopie de fluorescence35,36 .

Certains problèmes de bioréacteur habituels sont surmontés à l’aide d’un bioréacteur à moyen débit microfluidique, où seulement les millilitres de médias sont nécessaires, et les plaques de réaction sont petites et facilement jetable après autoclavage37. En outre, selon le nombre de puits, nombre de reproductions peut être effectuée dans un seul réacteur exécuter, qui fournit une quantité suffisante de données pour effectuer une analyse statistique significative. Dans la Figure 1, les différentes composantes du système microfluidique-microscopie qui permettent des conditions contrôlées, y compris la température et débit taux38,39,40, sont affichées. Le bioréacteur est couplé avec la microscopie de fluorescence pour visualiser la fluorescence de la balise EGFP dans PA01 sous appliqué en bas par le biais de conditions de cisaillement élevé qui imitent des scénarios plus réalistes qui sont rencontrés dans l’environnement ou dans le domaine biomédical.

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Figure 1 : Les composants individuels du système microfluidique. Les composants individuels sont répertoriés de gauche à droite : 1. caméra CCD, 2. haute résolution des Microscope inversé avec scène automatisé, Module de Fluorescence automatisé et Autofocus Module, 3. scène de plaque, 4 : Imaging system Interface, 5 : manuel platine du Microscope Contrôle, 6 : Piège à vapeur, 7 : Imaging system Controller (contrôleur de température y compris), 8 : contrôleurs, 9 : contrôleur de Fluorescence, 10 : Uninterruptible Power Supply, 11 : disque dur externe de stockage de l’Image, 12 : station de travail PC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Un extrait de la plaque de la microfluidique est illustré à la Figure 2. Les plaques plus couramment utilisés sont constitués de 48 puits. Une expérience nécessite une admission et puits d’une sortie, un total de 2 puits. Cela permet pour 24 expériences simultanées qui peuvent être effectuées avec des conditions expérimentales différentes, telles que les souches bactériennes, traitements antimicrobiens et les médias varie d’un canal à l’autre et contrôlée des flux de cisaillement pour chaque colonne de six canaux. La température expérimentale est également contrôlée avec un réglage de la température tout au long de la plaque. Les canaux microfluidiques montrent que chaque canal a une région serpentine pour fournir une pression suffisante et cisaillement contrôlé.

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Figure 2: visualisation des canaux microfluidiques et fenêtre de visualisation. Deux puits d’entrée et de sortie avec les canaux microfluidiques qui les relient sont mises en évidence avec les colorants rouges et verts. Le colorant rend visible une région serpentine dans chaque canal qui crée une pression suffisante et cisaillement contrôlé au cours de l’écoulement du fluide. Chaque canal regarde un (dans le cercle rouge) peut être photographiée avec des longueurs d’onde désirées. Sont champ lumineux (en haut) et fluorescentes (en bas) des images de microscopie d’un canal unique avec un biofilm PA01-EGFP en utilisant un objectif 20 X. Echelle = 80 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Un guide étape par étape est fourni pour permettre aux utilisateurs de bioréacteurs de microfluidique qui sont couplés avec la microscopie de fluorescence à mener des expériences de biofilm roman à l’aide de cisaillement différents environnements. Cette méthode permettra l’expansion des expériences impliquant d’autres microorganismes en plus de bactéries, telles que les champignons et les algues, qui ont des applications médicales et environnementales41,42,43. L’approche détaillée décrit la culture PA01-EGFP, inoculer une plaque 48 puits mis en place le dispositif microfluidique et le logiciel, mis en place le microscope à fluorescence et démontrer l’analyse du logiciel pour obtenir la couverture de biofilm, le taux de croissance, et propriétés morphologiques comme la rugosité de surface.

Protocole

1. préparation de support

  1. Préparer les milieux minimale (MM) à 0,25 % glucose. Pour faire 1 L de MM avec 0,25 % de glucose, ajouter 200 mL de solution saline sur le M9 stérile, 2 mL de stérile 1 M MgSO4, 100 µL de stérile 1 M CaCl2et 12,5 mL de stériles 20 % (p/v) de glucose à l’eau (dH2O) à un volume final de 1 L.
  2. Transférer média requis dans une bouteille stérile à l’aide de techniques stériles. Préparer la quantité nécessaire selon le nombre de canaux utilisés. En général, chaque canal requiert 200 µL d’amorçage, 300 µL pour semis et 1300 µL pour l’expérience de 24h.
  3. Placer le flacon dans un incubateur ou le bain-marie réglé à la température expérimentale. Les médias devraient être à la température de l’expérience avant utilisation pour éviter les bulles dans les microcanaux.

2. Elaboration d’une Culture nuitée et expérimentale de PA01-EGFP.

  1. Placer 15 mL de médias expérimentaux dans un flacon stérile sidearm et inoculer avec une ou deux colonies sur une gélose de rayures PA01-EGFP. Développez la culture pendant 12 à 16 h sur une table d’incubateur/agitateur à 37 ° C et 180-220 tr/min.
  2. Mesurer l' OD600 de la culture au jour le jour. Lorsque l' OD600 est supérieur à 0,80, diluer la culture durant la nuit à l’OD final de 0,8 à l’aide de frais mm. Place la culture expérimentale dans un incubateur ou le bain-marie à 37 ° C jusqu’au moment de l’ensemencement des canaux microfluidiques. Vérifier l’OD600 à nouveau immédiatement avant le semis afin d’assurer qu’il n’a pas changé significativement depuis la cible OD600, 0,8 dans ce cas.

3. matériel démarrage

  1. Mettre en place la station système selon le guide de l’utilisateur, similaire à la configuration de la Figure 1. Pour éviter une erreur dans la connexion de l’instrument au logiciel, allumer l’instrument dans l’ordre suivant :
    Poste de travail PC
    Module de fluorescence. Assurez-vous que l’obturateur de fluorescence est activé (lumière bleue par bouton de l’obturateur sur)
    Contrôleurs de matériel
    Contrôleur de système d’imagerie (voir Table des matières)
    Caméra CCD
    Station de l’imagerie (Microscope)
    Remarque : La température de la plaque chauffante devrait être positionnée sur la température désirée expérimentale.
  2. Démarrez l’application de contrôle et entrez le numéro de la plaque situé sur l’étiquette sur le côté de la plaque.
    Remarque : Après le démarrage de l’application de contrôle il y aura deux fenêtres d’application distincts, un pour le logiciel qui contrôle le logiciel de microscopie et d’imagerie et un pour le module de commande qui contrôle la pompe et l’interface de puits-plaque. Ceci est illustré dans la Figure S1, où le menu « Multi dimensionnelle Acquisition » est ouvert sur le dessus et le Module de commande est défini pour un autorun sur le fond.

4. amorçage et ensemencement de la plaque de microfluidique

Remarque : L’amorçage, ensemencement, attachement des bactéries et la croissance sont illustrées à la Figure 3.

  1. Retirez la plaque de 48 puits microfluidique de l’emballage en prenant soin de ne touchez ne pas la surface du verre en bas de la plaque. Nettoyer la lame de verre au bas de la plaque avec un tissu de lentille, un chiffon non pelucheux ou un chiffon peu pelucheux.
  2. Pour amorcer les canaux microfluidiques, pipeter 200 µL de 37 ° C MM dans la sortie, en prenant soin d’éviter les bulles. Placer la plaque dans la scène de la plaque et essuyer l’interface avec l’éthanol, ce qui permet de sécher, avant de sceller sur la scène de la plaque.
  3. En Mode manuel sur le Module de commande, établi fluide comme LB à 37 ° C et Au cisaillement Max à 5,00 dyne/cm2. Cliquez sur les puits de sortie pour activer le flux de la sortie à l’entrée, amorçage les canaux. Après 5 min d’amorçage, interrompre le flux de préparer pour l’ensemencement. Avec précaution, retirez la plaque de la scène et pipetter médias résiduelle de la sortie, mais ne supprime pas tous les supports du cercle intérieur qui mène à des canaux microfluidiques.
  4. Pour amorcer les canaux expérimentaux, tout d’abord distribuer 300 µL de MM dans l’entrée bien suivie le pipetage 300 µL de la culture bactérienne dans la sortie dans la sortie du puits. Placer la plaque dans la scène de la plaque en veillant à essuyer l’interface avant de le placer sur la plaque.
  5. Sur le Module de commande, se concentrer sur un seul canal à l’aide de la caméra en direct d’alimentation après avoir placé la scène de la plaque sur la platine du microscope. Tout en contrôlant visuellement par le flux en direct, reprendre le flux à 1,00-2,00 dyne/cm2 pour environ 2-4 s permettre d’entrer dans le canal expérimental, les cellules, mais pas dans les circuits de serpentines. Laisser la plaque sur la scène de température contrôlée pendant 1 h pour la fixation des cellules. Au cours de l’incubation de 1 h, le logiciel du Module de commande et le Montage peut être configuré pour l’exécution automatique (étape 5).
    Remarque : La quantité de temps nécessaire pour l’amorçage varie avec les médias et l’organisme, donc il doit être étroitement surveillée par le flux en direct jusqu'à optimisé et utilisé comme un délai général. Tout au long de la plaque de l’ensemencement peut varier qui nécessiterait plus de temps d’écoulement appliquée à certaines colonnes de chaînes pour l’ensemencement complet.
  6. Après la période d’attachement, délicatement enlever la plaque de la scène et pipeter les bactéries provenant de la sortie tout d’abord éviter de déranger le canal. Avec un nouvel embout de la pipette, enlevez le média du puits d’entrée.

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Figure 3 : Aperçu expérimentale de l’amorçage, ensemencement, saisie des PA01-EGFP dans les canaux microfluidiques. L’amorçage, l’ensemencement et la pièce jointe est exposée. La première étape de l’amorçage nécessite des supports neufs introduits à la sortie. L’ensemencement consiste volumes égaux des culture médias et bactériens dans l’entrée et sortie, puits, respectivement. La culture ne doit pas passer regarde un tronçon du canal expérimental (ligne rouge) pour éviter l’obstruction des canaux serpentines. Après que la période d’incubation est terminée, les supports neufs s’écoule en permanence de l’entrée, à la chambre regarde un et dans la prise. Cela lance la fixation et la croissance du biofilm bactérien. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

5. réglage du logiciel

  1. Dans le logiciel, ouvrez «Acquisition de dimensions multiples» pour contrôler l’acquisition d’images de microscope. Sous le menu «principal», sélectionnez «Timelapse», «Plusieurs postes de Stage» et «Plusieurs longueurs d’ondes» (Figure S1A).
    1. Configurez les paramètres de sauvegarde , créer un simple Nom de Base, en s’assurant que le nom d’augmentation d’échelon de base si le fichier existe est activée. Cliquez sur Sélectionner un répertoire pour sélectionner le dossier dans lequel tous les fichiers seront sauvegardés. Inclure les détails essentiels de l’expérience dans la Description.
    2. Sous l’onglet Timelapse , réglez la durée de la période expérimentale pour 24h. Pour contrôler la fréquence des images sont acquises, définir l' Intervalle de temps , donc les images sont acquises toutes les 5 min pendant toute l’expérience. Le Nombre de Points dans le temps se règle automatiquement avec les paramètres définis.
    3. Définir des positions de scène à l’aide de la caméra en direct se nourrissent dans le microscope de champ lumineux, permettant la mise au point et la mise en place correcte. À partir de l’objectif 10 X, se concentrer sur le centre du chenal, situé au-dessus ou en dessous le numéro de canal gravé sur la plaque. Basculez vers l’objectif 20 X, trouver la zone de visualisation optimal et le plan focal dans le chenal. Ajouter la position de la liste ou remplacer la position préréglée avec les nouveaux paramètres.
    4. Sous le menu de longueurs d’onde , définissez le nombre de longueurs d’onde à 3. Pour la longueur d’onde 1 (W1), sélectionnez la FITC 100 % CAM avec un temps de pose de 10 ms. Pour les longueurs d’onde 2 (W2), sélectionnez le fond clair CAM 50 % 50 % VIS, avec un temps d’exposition minimale de 3 m pour longueur d’onde 3 (W3), défini comme le filtre Fermé tous les aucun lumière ne reste donc sur le dernier canal entre les délais d’acquisition.
  2. Lorsque vous configurez le Module de commande, vérifiez que le manuel d’exécution a été arrêté.
    1. Dans le menu Autorun modifier sous l’onglet Configuration du protocole , définissez un nouveau protocole pour 24h de temps de durée, qui coule vers l’avant à la vitesse de cisaillement désirée. Taux de cisaillement est modifiée afin d’étudier l’effet de la croissance de biofilm vitesse de cisaillement. Cliquez sur ajouter et Enregistrer sous le protocole.
    2. Sous l’onglet Configuration de la séquence , créer une nouvelle séquence en sélectionnant LB@37degrees dans le fluide par défaut pour tous les canaux. En vertu de l' Itération de l’étape 1, pour les canaux 1-12, sélectionnez le protocole avec la vitesse de cisaillement désirée et activez tous les canaux. Pour les canaux 13-24, sélectionnez le protocole avec le deuxième taux de cisaillement désirée et activez tous les canaux. Sélectionnez appliquer et Enregistrer sous la séquence.
    3. Dans le menu automatique , sélectionnez la séquence enregistrée à utiliser pour l’exécution automatique.

6. chronométré Biofilm croissance montage

  1. Distribuer un maximum de 1 300 µL de MM stérile dans l’entrée de la plaque de la microfluidique. Placer la plaque de retour sur la scène de la plaque et essuyer l’interface avec l’éthanol, ce qui permet de l’éthanol à sécher complètement, avant de la plaque d’étanchéité.
  2. Placer la plaque en scène sur la platine du microscope et s’assurer que les protocoles et découverte est correctement configurés. Sélectionnez Démarrer pour lancer l’autorun suivi rapidement en cliquant sur acquérir pour commencer la collection d’images de microscope.
  3. Ajuster la mise au point et le placement de tous les postes de phase entre les acquisitions de l’image. Sélectionnez Pause puis, en utilisant le mode de l’image en direct dans la longueur d’onde du champ lumineux, Passez à voir les positions de chaque étape. Définir les nouveaux paramètres en sélectionnant la valeur actuelle. Cliquez sur reprendre avant le temps d’acquisition planifiée suivant.

7. examiner et analyser les séquences d’images après l’expérience de croissance de Biofilm chronométré

  1. Pour passer en revue chaque canal après 24h autorun, dans le logiciel, ouvrez Examiner des données multidimensionnelles, situé sous les Outils d’analyse. Cliquez sur Sélectionnez fichier de Base | Sélectionnez le répertoire pour naviguer vers le dossier avec des séquences d’images pour l’expérience d’intérêt. Dans la liste des ensembles de données dans le dossier qui apparaît, sélectionnez le nom de base de données d’intérêt.
  2. Une fois les données d’intérêt sélectionnées, cliquez sur affichage pour passer en revue ces données. Sélectionner une longueur d’onde d’examiner ces données au titre de la fenêtre (Figure S2) de la longueur d’onde .
  3. Examen de la séquence d’images pour chaque canal en sélectionnant le numéro de canal sous Position allure utilisant les contrôles vidéo pour analyser les données pour le temps 289 points (en supposant que les images sont obtenues toutes les 5 min pour une période de 24h). Prendre note des données de croissance utilisable.
    Remarque : Dans chaque canal, surveillez le développement de bulles d’air et les sabots qui perturbent la croissance de biofilm dans le chenal, affectant les données. Toutefois, si elles se produisent plus tard dans les données d’exécution, avant ces circonstances peut-être s’avérer utiles.
  4. Après avoir examiné et sélectionner les données voulues pour analyse, créer des piles des images pour chaque canal. Sous le menu fichier , sélectionnez ouvert spécial | Construire la pile | Numérotés de noms. Dans la fenêtre de la Pile de construire , cliquez sur le bouton Sélectionner une première Image , puis sélectionnez la première image de la pile dans le dossier de fichiers ; Cliquez sur le bouton Sélectionner une dernière Image et ensuite sélectionner le fichier correspondant à la dernière image de la pile. Cliquez sur OK pour ouvrir la pile avec toutes les images de la chaîne dans l’ordre chronologique. Piles peuvent être sauvegardés sous le menu fichier , Enregistrer sous sous forme de fichiers tiff.
    Remarque : Ne créez pas de piles avec les images de pouce. Ces fichiers ne sont pas très utiles et peuvent être supprimés pour gagner de la place sur le disque dur. Aussi, les fichiers image sont enregistrés comme suit :

    BASE NAME_WAVELENGTH_sCHANNEL #_tIMAGE #.

    Par exemple, 07062018_W1FITC 100_s12_t112 est pour le canal 12, la point 112 dans le temps, l’image dans les premières données de caméra de 100 % de longueur d’onde-FITC avec le nom de base « 07062018 ».
  5. Enfin, sélectionnez Enregistrer sous dans le menu déroulant fichier pour enregistrer la séquence sous une pile de tiff. Piles aussi peuvent être superposées et sauvegardés sous forme de film. Cela s’adresse à l’étape 9.
  6. Avant de quantifier le % de surface couverte, calibrer les distances de l’image. Sous Outils d’analyse, cliquez sur Étalonner les Distances. Sélectionnez la mesure étalonnage approprié, puis cliquez sur appliquer à toutes les Images ouvertes.
  7. Bien que la pile soit sur la première image de la séquence, cliquez sur le bouton de seuil . Utilisez Seuil de déclenchement automatique pour les objets de lumière au seuil pour signal fluorescent (longueur d’onde de la FITC) et Seuil de déclenchement automatique pour les objets sombres au seuil en champ lumineux. Régler le seuil de la couverture qui représente la couverture de l’image.
    1. Pour les seuils fluorescents, utiliser un canal avec des cellules non fluorescent d’établir n’importe quel signal de fond et l’ensemble la valeur de seuil minimal d’exclure le signal détecté dans les canaux contenant ces non fluorescent cellules pour assurer la mesure de signal est ne surestimez pas le domaine de la fluorescence. Cela peut être différent d’une exécution à l’exécution est une bonne idée d’utiliser au moins un, si pas plus, ou les canaux pour les contrôles non fluorescent.
    2. Pour les seuils de champ lumineux, si toutes les cellules ne sont pas couverts par la signature de seuil orange, ajuster la valeur de seuil maximal soit via la barre d’outils coulissant ou en utilisant l' Image de seuil (qui se trouve sous les Outils d’analyse), afin que toutes les cellules sont couverts, mais n’importe quel fond est exclu.
      Remarque : Alors que ces valeurs seuils idéalement pourrait être utilisés pour toutes les images dans une pile et pour tous les canaux, les valeurs de seuil sélectionnés pour une image/canal peuvent ne pas convenir pour d’autres images ou canaux, donc que l’utilisateur peut avoir besoin d’ajuster l’intervalle de seuil périodiquement. Pour cette raison, c’est une bonne idée d’enregistrer toujours le maximum et les valeurs de seuil minimal utilisés doivent les données doivent être examinés plus tard.
  8. Afin de quantifier l’assujettissement, Des outils d’analyse, cliquez sur Afficher les statistiques de région. Assurez-vous que le Seuil d’utilisation est cochée, l' Image entière est sélectionnée et sous Les données obtenues, assurez-vous que les réglages/mesures sont sélectionnés (zone du seuil, moyenne, écart-type, min, max et seuil de % zone). Cliquez sur Journal ouvert et assurez-vous que le fichier DDE est sélectionné avant de cliquer sur OK. Sélectionnez Microsoft Excel , puis cliquez sur OK. Dans la feuille de calcul qui s’ouvre, cliquez sur les Données du journal pour enregistrer automatiquement les mesures de l’image en cours d’analyse.
  9. Laissant cette feuille de calcul ouverte, utilisez la même feuille pour recueillir toutes les données de l’analyse d’image pour une seule pile. Dans la pile, allez à la quatrième image et seuil pour les réglages optimaux. Cliquez sur Les données du journal dans l’écran Afficher les statistiques de région et les valeurs sont enregistrées dans la feuille de calcul. Répétez cette opération pour l’analyse des images toutes les 15 min.

8. autres scripts d’analyse dont la morphologie et la Surface couverture mesure à l’aide de Python de la Suite de la morphologie du Biofilm

  1. Installer une distribution de Python 3.6 qui inclut les modules scientifiques standard en utilisant une distribution standard de Python scientifique comme Anaconda, disponible à https://www.anaconda.com/download.
  2. Obtenir la Suite de la morphologie du Biofilm de GitHub dans un navigateur en naviguant jusqu'à https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, puis sélectionnez Clone ou téléchargement (bouton vert) puis sélectionnez Télécharger Zip. Décompressez le fichier et déplacer les dossiers de code dans un répertoire de travail.
  3. Mesurer le pourcentage de couverture ont en copiant la pile de l’image dans le dossier «couverture». Utiliser une fenêtre de terminal pour accéder à ce dossier et exécutez le script avec la commande

    Python bfCoverage.py tiffStackName.tif

    depuis l’interface de ligne de commande, où tiffStackName.tif est le nom du fichier contenant la pile de tiff d’images. Un fichier texte contenant les mesures de couverture, à chaque instant sera créé avec le nom tiffStackName.txt et un fichier graphique, avec un terrain de couverture comme une fonction du temps sera créée avec le nom tiffStackName.png.
  4. Utilisez la même procédure spécifiée à l’étape 8.3 pour mesurer les autres caractéristiques morphologiques : biofilm accumulation, coefficient de rugosité et textural entropie. Utilisez le script bfAcc.py pour la mesure de l’accumulation, le script roughCoef.py pour la mesure de coefficient de rugosité et le script TEvsTime.py pour la mesure de l’entropie textural.

9. autres Applications de logiciel - faire des superpositions et des films

  1. Si plusieurs longueurs d’onde sont utilisées, créer piles superposition y compris ces longueurs d’onde. Ouvrir toutes les piles d’intérêt et d’étalonner la distance comme fait à l’étape 7,6.
    1. Sous Outils d’analyse, sélectionnez Images Overlay. Définissez les sources comme les empilements d’intérêt. Dans la pile de la FITC, cliquez sur le cercle de l’arc-en-ciel et sélectionnez filtre de couleur vert à ajouter afin de souligner cette longueur d’onde.
    2. Bal permet d’ajuster la superposition pour que la pile FITC est apparente dans les images. Après ont effectué tous les réglages, sélectionnez Tous les plans pour les deux piles et cliquez sur appliquer. Sauver les superpositions de la même manière comme piles décrits à l’étape de 7,5 ou comme un film décrit à l’étape 9.2.
  2. Pour enregistrer des cheminées ou des superpositions comme un film de timelapse, sous MM Standard et à pile, cliquez sur Créer un film. Sélectionnez la source de la cheminée ou la superposition que l'on souhaite. Cliquez sur enregistrer et enregistrez sous un Microsoft vidéo 1 , avec une qualité définie entre 70 et 80.

Résultats

Figure 4 une montre la zone seuillée pourcentage au fil du temps d’un 24h à flux de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Le biofilm couverture ou pourcentage seuil surface (C [%]) était différente pour tous les paramètres de cisaillement trois. La couverture de biofilm a été le plus rapide au cisaillement de 1,0 dyne/cm2 , où la zone du seuil a augmenté de 2 à 5 % à 100 % après 200 min de croissance et atteint une phase stationnaire après 400 min. À 0,5 dyne/cm2, la couverture de biofilm a été retardée et a commencé à augmenter à 400 min pour atteindre une couverture de 100 % après 800 min. La plus faible cisaillement à 0,2 dyne/cm2 a clairement démontré l’augmentation plus lente du biofilm couverture, où le pourcentage de couverture a commencé à augmenter à 500 min mais jamais atteint au-delà de la zone du seuil de 65 %. Ces résultats indiquent cisaillement a eu une influence directe dans la couverture de surface de biofilm. Le cisaillement plus élevé semble être une condition plus optimale pour la croissance de biofilm, peut-être dû au fait que les médias ont assuré la bactérie avec plus d’éléments nutritifs afin que le biofilm peut proliférer plus vite.

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Figure 4: zone du pourcentage seuil, accumulation totale de biofilm, coefficient de rugosité et entropie textural. zone du seuil a) pourcentage (C [%]) au fil du temps à l’aide de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 sur une 24h période. Données proviennent d’un seul canal pour chaque condition de cisaillement. b) total biofilm accumulation (mesure relative) en fonction du temps à l’aide de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 sur un 24h laps de temps. Les lignes noires sont des moindres carrés s’adapte à un modèle exponentiel. Données proviennent d’un seul canal pour chaque condition de cisaillement. c) coefficient de rugosité de PA01-EGFP en utilisant les valeurs de la contrainte de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 surveillé de plus de 24 heures de données a été obtenue d’un canal pour chaque condition de cisaillement. d) texture entropie de PA01-EGFP en utilisant les valeurs de la contrainte de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Données proviennent d’un seul canal pour chaque condition de cisaillement (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 b est conforme aux résultats illustrés à la Figure 4a. L’accumulation de biofilm (N[rel]) a été mesurée basée sur l’hypothèse que le signal GFP à un point dans une image est proportionnel à la densité de cellules vivantes à cette position. Il démontre que l’accumulation totale mesure relative biofilm augmente en fonction du temps en utilisant 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2 sur une 24h période et le taux de croissance a diminué de plus haute contrainte de cisaillement à la contrainte de cisaillement plus bas. Il y a une période de temps clair donnant une croissance exponentielle d'où un taux de croissance quantitative peut être calculé.

Figure 4 c prouver le coefficient de rugosité (Ra) au flux de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Rugosité de surface, quantifiée par le coefficient de rugosité, mesure l’écart dans le profil de l’épaisseur du film. La définition formelle est

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où Tj’ai est la i-ème mesure de l’épaisseur, Tun , c’est l’épaisseur moyenne, et N est le nombre d’épaisseur mesure30. La procédure décrite dans cette enquête mesure l’épaisseur associée à des cellules vivantes. Un arrangement plat des cellules permet d’obtenir un coefficient de rugosité de zéro tandis que des variations importantes d’épaisseur par rapport à la moyenne permettra d’obtenir un coefficient de rugosité supérieur à un. Semblable à l’influence de cisaillement sur le taux de croissance et de la couverture de seuil en pourcentage du film, les biofilms expose différentes topographies au fil du temps. Dans l’ensemble, Ra diminué au fil du temps pour toutes les conditions de cisaillement indiquant que toutes les surfaces est devenue plus lisses. Cependant, en comparaison avec le plus faible cisaillement de 0,2 dyne/cm, les cisaillement des réglages élevés de 0,5 et 1,0 dyne/cm2 conduit à une surface plus lisse au fil du temps, indiquant qu’un flux de cisaillement plus rapide a contribué à la surface plus lisse et plus uniforme et le plus haut cisaillement de 1,0 dyne/cm2 au-dessous de 0,2 Run.

La douceur, la régularité ou la grossièreté d’une surface peut aussi être exprimée en texture entropie (TE). T’est une propriété utilisée dans l’analyse d’image pour mesurer le degré d’aléa dans une image bidimensionnelle. Son calcul est basé sur la matrice de co-occurrence des niveaux de gris, défini par Haralick et al., qui examine si les valeurs de pixels à un endroit sont corrélés avec des valeurs de pixel à un autre emplacement44. Un haut degré de corrélation conduira à faible entropie. Figure 4 d représente la TE à flux de cisaillement de 0,2, 0,5 et 1,0 dyne/cm2. Le T’a augmenté au fil du temps pour toutes les conditions de cisaillement mais la contrainte de cisaillement plus élevée à 1,0 dyne/cm atteint le maximum (1.0) TE plus tôt que les contraintes de cisaillement inférieures à 900 min. La plus faible cisaillement de 0,2 dyne/cm2 avait le plus bas TE (0,8) pour atteindre son maximum après 1 000 min. Toutefois, la contrainte de cisaillement intermédiaire de 0,5 dyne/cm2 atteint sa TE maximale (1.2) beaucoup plus tard que les conditions de contrainte de cisaillement élevé ou faible.

Le coefficient de rugosité et TE mesurent des caractéristiques différentes. Alors qu’un film plat aurait un coefficient de rugosité faible et faible entropie, un film avec une variation importante épaisseur aurait un coefficient de rugosité élevée mais pourrait encore être faible entropie si la variation est sinusoïdal plutôt qu’aléatoire. Dans ce cas, Run diminue avec une augmentation des contraintes de cisaillement et de temps alors que les tendances TE ne peut pas être directement liées au shear stress appliqué à la formation de biofilm au fil du temps.

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Figure S1 : Saisie de la fenêtre de logiciel de contrôle d’image. Fenêtre avec menu Multi dimensionnelle Acquisition du logiciel ouvert (en haut). Module de commande pour un AutoRun (en bas). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure S2 Capture du logiciel pour l’examen des données d’images. Fenêtre de l’application après avoir sélectionné l’ensemble des données d’intérêt en utilisant l’outil d’Examen Multi dimensionnelle données dans le menu Outils d’analyse . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La procédure d’analyse de système et image microfluidique discuté ici met l’accent sur l’exécution d’expériences biofilm microfluidiques pour déterminer les propriétés morphologiques qui ne nécessitent pas l’information complète en trois dimensions que se trouve généralement du confocal études microscopiques. Il s’agissait de microcolonie couverture de substrat (pourcentage de couverture), rugosité de la surface mesurée par le coefficient de rugosité et textural entropie. Une méthode pour estimer l’accumulation de cellules de biofilm relatif total est également présentée de quel taux de croissance dans le journal de phase peut être calculée.

Il y a plusieurs étapes faible mais significatives qui devraient être mis en évidence dans cette méthode. Essuyer l’interface avec l’alcool permet d’éviter la contamination d’autres bactéries en allant de l’expérience à l’expérience, mais aussi de bien de bien dans une expérience. D’amorçage et d’amorçage sont aussi très important parce que l’amorçage permet à l’utilisateur de déterminer quels sont les canaux permettent aux médias de circuler à travers les canaux sans aucune perturbation ou colmatage. Canaux ne devrait également pas être dérangé (c.-à-d. , ils devraient être constamment pleins de médias) Après amorçage pour augmenter les chances d’une expérience réussie avec aucune bulle d’air ou l’obstruction. L’étape de semis peut varier selon le type de bactéries et doit donc être optimisée pour la fixation des cellules. Par exemple, si les cellules ne semblent pas attacher, modifications de surface peuvent avoir à se produire sur la plaque de microfluidique avant l’ensemencement ou temps d’incubation plus longs peuvent être nécessaires. Il est également essentiel pour s’assurer que le microscope est correctement configuré pour obtenir une image de mise au point et devrait être surveillé périodiquement tout au long de l’expérience pour s’assurer que les images de qualité sont obtenues. Si le focus est désactivé, le microscope peut et doit être ajusté comme l’expérience continue. Au cours de la durée d’acquisition d’image, la dernière longueur d’onde doit être défini sur Tous fermés afin d’éviter l’exposition des filtres et l’éclairage au seul canal pendant le temps d’attente qui se produit entre les acquisitions de l’image. En outre, l’analyse d’image qui détermine la couverture de surface % a été conçu dans la maison parce que le manuel de logiciel de Montage n’a pas explicitement décrit la procédure. En outre, afin d’élargir l’analyse d’image et de déterminer d’autres caractéristiques telles que la rugosité de surface, etc.., open source code basé sur Python45 a été développé en interne et partagé sur le dépôt gitHub. Il y a aussi des limites sur la quantité de données peut être stockée et gérée sur le disque dur local, donc un disque dur externe ou le partage de données en ligne est nécessaire comme CyVerse46.

Bioréacteurs conventionnels, tels que le réacteur de la CDC et le goutte à goutte flux reactor34, nécessitent beaucoup de médias, fournissent moins la taille des échantillons et exigent une grande quantité de stérilisation de l’équipement. En revanche, les avantages de cette plateforme de débit supérieur incluent la capacité de contrôle shear, débits, et l’hypothèse que l' in vitro les expériences étroitement ressemblent à des conditions in vivo . Les inconvénients du système incluent les multiples accessoires et logiciels nécessitant une méticuleuse de configuration qui doivent être exécutées dans l’ordre correct des événements. En outre, le manuel fourni pour l’équipement n’explique pas entièrement chaque étape des expériences et les commandes de logiciels, et en conséquence, beaucoup d’erreurs se produire au cours des expériences, y compris l’obstruction des canaux, manque de croissance ou de la saisie, images de microscopie haute qualité manque ou de films. L’instrument lui-même et consommables, tels que les plaques de la microfluidique, sont aussi relativement coûteux avec un prix de plus de 200 $ par assiette et ne sont pas réutilisables. Ainsi, alors que la technique donne des résultats puissants, l’expertise technique nécessaire à son utilisation est relativement élevée et nécessite une formation répétée par des experts dans le domaine. Ce rapport tente de résoudre ce problème en fournissant un guide pour les nouveaux utilisateurs de ces bioréacteurs afin d’étudier les caractéristiques de biofilms.

Le système microfluidique, qui est en mesure d’effectuer l’analyse cellulaire, a gagné une attention considérable pour diverses modalités scientifiques, comme en microbiologie, immunologie, hématologie, oncologie et recherche sur les cellules souches. Plus précisément, la technologie a donné lieu à plusieurs publications décrivant les sujets qui sont très pertinents pour applications médicales37,47, y compris microbienne buccale adhérence48, détermination des effets des biosurfactants sur Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus49,50, héberger pathogène dans51 d’e. coli, Streptococcus de respect52et le traitement de la fibrose kystique53. Compte tenu du fait que ce système microfluidique est très polyvalent, il est prévu que des systèmes de plus en plus seront distribuées dans le monde entier.

Certaines étapes de protocole spécifique doivent être examinées attentivement. Médias peut être dilué à 50 % avec dH2O afin d’éviter les bulles et colmatage, mais n’était pas nécessaire en l’espèce. La valeur spécifique OD600 utilisée pour l’ensemencement doit être déterminée en utilisant les essais préliminaires d’une expérience de croissance pour voir ce qui fonctionne le mieux pour l’ensemble particulier de conditions d’utilisation. Bulles dans les puits avant le scellage peuvent conduire à des bulles d’air dans les canaux microfluidiques et doivent être retirés par sauté ou sucée dehors avec un embout de la pipette. Il est important de garder des bactéries sur les petits canaux de serpentines. En ayant des volumes égaux des médias dans l’entrée et la sortie au cours du processus d’amorçage, débit en raison de pressions exercées par le volume de liquide sera contrôlée donc flux est uniquement en raison de la pression appliquée par le système. Les distances d’étalonnage doivent être configurés lors de l’installation par le représentant de la compagnie. Ces paramètres sont spécifiques pour chaque caméra.

Il y a plusieurs problèmes qui se produisent lors de la recherche le seuil plus représentatif d’une image. Définir les valeurs de seuil maximal peut être difficile si l’intensité du pixel moyenne dans toutes les régions de l’arrière-plan ne concordent pas causé en sélectionnant une position d’allure qui n’est pas au centre du chenal ou de débris sur la plaque. Sous la MM Standard, cliquez sur processuset puis sélectionnez arrière-plan et Correction d’ombrage outil de correction pour ces incohérences. Toutefois, cet outil n’est généralement utile si l’utilisateur a pris des images des canaux avant d’ensemencer qu’ils peuvent utiliser comme images de référence. Ou, si l’arrière-plan/ombrage référence images ne sont pas disponibles, l’utilisateur devra exercer son jugement pour définir une valeur seuil qui couvre la zone la plus cellule sans inclure l’arrière-plan de l’image entière. En sélectionnant des zones représentatives de mesurer qui excluent les régions d’incohérence par clic Région rectangulaire, Région de l’Ellipseou Trace région pour sélectionner une région et sélectionnez Région Active plutôt que ensemble Image sur la fenêtre Afficher les statistiques de région (sous Outils d’analyse). Si vous utilisez une région représentative de seuillage de l’image du champ lumineux, la même région doit être utilisée pour la mesure de l’image correspondante de la FITC. Il est utile d’enregistrer les statistiques spatiales spécifiques (gauche, haut, largeur, hauteur, aire, périmètre) associés à cette région représentante donc on trouvera la même région et mesurée sur l’image correspondante de la FITC.

Pour éviter une accumulation de données sur le disque dur qui permettra de ralentir l’ordinateur, un disque dur externe peut être acheté pour le stockage de données. Une autre option pour le stockage des données et de faciliter le partage de données est la plate-forme de bioinformatique de CyVerse. Créer un compte sur le système de CyVerse en allant sur http://www.cyverse.org/. Une fois connecté, lancer l’environnement de découverte puis sélectionnez « Log in CyVerse ». Sélectionnez «données» et naviguez jusqu'à vous êtes le dossier. Si la pile de l’image se trouve sur l’ordinateur local, puis sélectionnez «télécharger» puis «Upload Simple de bureau». Trouver le fichier d’image pile et sélectionnez pour le téléchargement. Le fichier ou un dossier peut être partagé avec des collaborateurs s’ils ont un compte CyVerse et disposent d’autorisations. Partage du dossier data auprès du grand public exige que les métadonnées ajoutés pour chaque fichier à l’aide CyVerse normes approuvées. Cette procédure n’est pas discutée ici parce que ce n’est pas dans le cadre de ce travail.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été rendu possible grâce à des subventions de l’Institut National pour générales Medical Sciences (NIGM) (5P20GM103427), une composante de la National Institutes of Health (NIH)

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure d’ammonium, ACSVWRBDH9208-500GFait partie de la composition minimale du média
BioFlux 1000 48 puits à faible cisaillementFluxion Biosciences910-0047
Système d’imagerie microfluidique BioFlux 1000ZFluxion BiosciencesBF 1000Z
Dihydrure de chlorure de calcium, grade ACDVWR97061-904Fait partie de la composition minimale du média
Dextrose, anhydre, ACSVWRBDH9230-500GFait partie de la composition minimale du média
Sulfate de magnésium ACS GradeVWREM-MX0070-1Fait partie du milieu minimal
Phosphate de potassium monobasique, ACS GradeVWRBDH9268-500GFait partie du milieu minimal
Pseudomonas Aeurginosa GFP ATCC15692GFPLa souche bactérienne PA01 de Pseudomonas aeurinosa avec modification de la GFP a été utilisée pour cette étude.
Chlorure de sodium, ACSVWRBDH9286-500GFait partie de la composition minimale du milieu
Phosphate de sodium, monobasique, anhydre, réactifGrade VWR97061-942Fait partie de la composition minimale du milieu

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Croissance du biofilmmicroscopie fluorescencecin tique de croissancerugosit de surfaceentropie texturaleanalyse d images
Cellule analyse de contrainte de cisaillement en direct sur Pseudomonas aeruginosa en utilisant un système automatisé de microfluidique de débit supérieur
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