Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Résumé

Présenté ici est un protocole qui combine un système de co-culture neural-endothelial in vitro et l'incorporation métabolique du sialoglycan avec des groupes fonctionnels bioorthogonals pour étendre les cellules neurales primaires de tige et d'ancêtre et étiqueter leur surface sialoglycoproteins pour l'imagerie ou l'analyse de la spectrométrie de masse des marqueurs de surface cellulaire.

Résumé

Les cellules de tige et d'ancêtre neural (NSPc) sont la base cellulaire pour les structures et les fonctions complexes du cerveau. Ils sont situés dans des niches spécialisées in vivo et peuvent être isolés et étendus in vitro,servant de ressource importante pour la transplantation cellulaire pour réparer les lésions cérébrales. Cependant, les NSPC sont hétérogènes et ne sont pas clairement définis au niveau moléculaire ou purifiés en raison d'un manque de marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Le protocole présenté, qui a été précédemment rapporté, combine un système de co-culture neural-endothelial avec une méthode métabolique d'étiquetage de glycan pour identifier le sialoglycoproteome de surface des NSPc primaires. Le système de co-culture endothéliale du NSPC permet l'auto-renouvellement et l'expansion des CNS PNS primaires in vitro,générant un nombre suffisant de NSPC. Les Sialoglycanes dans les NSPC cultivés sont étiquetés à l'aide d'un journaliste métabolique de l'acide sialique contre nature avec groupes fonctionnels bioorthogonal. En comparant le sialoglycoproteome des NSPC auto-renouvellements élargis dans une co-culture endothéliale avec la culture neuronale différenciante, nous identifions une liste de protéines membranaires qui sont enrichies dans les NSPC. Dans le détail, le protocole comprend : 1) la mise en place d'une co-culture endothéliale du NSPC et d'une culture différenciante du CNPC; 2) étiquetage avec azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz); et 3) conjugaison de biotine au sialoglycan modifié pour la formation image après fixation de la culture neurale ou de l'extraction de protéine de la culture neurale pour l'analyse de spectrométrie de masse. Ensuite, les candidats marqueurs de surface enrichis par le NSPC sont sélectionnés par analyse comparative des données de spectrométrie de masse provenant à la fois du NSPC élargi et des cultures neuronales différenciées. Ce protocole est très sensible pour identifier les protéines membranaires de faible abondance dans les matériaux de départ, et il peut être appliqué à la découverte de marqueurs dans d'autres systèmes avec des modifications appropriées

Introduction

Les cellules souches neurales sont définies comme une population de cellules multipotentes qui peut se renouveler pour maintenir une piscine de cellules souches et se différencier en neurones et en gliales. Ils sont les principaux types de cellules dans le système nerveux et peuvent offrir un grand potentiel thérapeutique en médecine régénérative par la transplantation cellulaire dans les cerveaux malades et blessés^1,2. Au fur et à mesure que le développement se poursuit, la population de cellules souches neurales devient hétérogène^3,4, et la proportion de cellules souches neurales dans le cerveau diminue progressivement⁵. D'une manière générale, les cellules souches neurales embryonnaires et d'autres cellules progénitrices neurales, appelées cellules souches et progénitrices neurales (NSPC), sont situées dans les zones germinales, la zone ventriculaire et la zone sous-ventriculaire chez la souris⁶. Dans le cerveau embryonnaire, les cellules souches neurales génèrent des neurones directement ou indirectement par l'intermédiaire des cellules progénitrices intermédiaires (CIP), et chez certaines espèces par l'intermédiaire des progéniteurs de zone sous-ventriculaire externe (ORG)^7,8. La signature moléculaire spécifique, la morphologie, l'emplacement dans la niche de cellules souches, et le potentiel de différenciation déterminent tous le rôle de chaque sous-type dans l'organogenèse du cerveau et les applications cliniques⁹. Cependant, les marqueurs de surface cellulaire actuellement disponibles ne peuvent pas discriminer et purifier sans équivoque différents sous-types de NSPC, limitant la compréhension et l'utilisation de ces sous-types.

L'identification des marqueurs de surface primaires des NSPC est limitée par trois obstacles majeurs. Le premier est le nombre limité de cellules de NSPcC dans le tissu, ce qui rend difficile la préparation d'échantillons de protéines de surface cellulaire pour l'analyse de spectrométrie de masse commune. La deuxième limitation est la difficulté à produire des sous-types de cellules pures pour générer des données de protéines membranaires spécifiques au sous-type. Enfin, le troisième défi est le faible rapport des protéines de surface cellulaire dans les protéines cellulaires entières, ce qui entrave leur sensibilité de détection par l'analyse de spectrométrie de masse.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé une approche chimioprotéomique pour enrichir sélectivement et identifier les protéines de surface cellulaire dans les NSPC primaires en étiquetant métaboliquement les sialoglycoprotéines¹⁰. Pour générer un nombre suffisant de NSPC, nous avons profité d'un protocole établi pour étendre et maintenir les NSPC embryonnaires primaires dans des états indifférenciés in vitro, en co-ccultant des NSPc avec des lignées de cellules endothéliales de cerveau de souris utilisant un support perméable insert de matrice(par exemple, transwell) système¹¹. En revanche, les NPSC cultivés seuls sans cellules endothéliales génèrent la progéniture différenciée^11,12. Ainsi, les échantillons de protéines de ces deux systèmes de culture peuvent être analysés comparativement pour identifier les protéines qui sont exprimées différemment dans les NSPC et les neurones différenciés. Comme la plupart des protéines de surface cellulaire sont modifiées par l'acide sialique¹³, précurseur sialique contre nature précurseur analogique N-azidoacetylmannosamine-tétraacylated (Ac₄ManNAz) a été utilisé pour détourner la voie métabolique intrinsèque de sorte que endogène, nouvellement les sialoglycas synthétisés sont étiquetés avec des groupes d'azido, générant une poignée chimique¹⁴. Grâce à des réactions bioorthogonal salkyne-négociées par azido, qui conjuguent la biotine aux sialoglycans, les protéines de surface cellulaire peuvent être visualisées et enrichies pour l'identification protéomique par un fluorophore couplé à la streptavidine ou une matrice^14.

Ici, nous effectuons la coloration de l'analyse de gel SDS-PAGE du sialoglycoproteome de surface des NSPC étendus dans une co-culture endothéliale et des cellules différenciantes dans un système de non-co-culture. Nous purifions également sélectivement le sialoglycoproteome de surface dans les deux systèmes de culture pour la comparaison protéomique. Notre protocole, comparé aux protocoles traditionnels de purification de surface cellulaire basé sur la centrifugation¹⁵, augmente l'efficacité d'extraction en réduisant les procédures d'extraction de protéine de surface par la conjugaison et l'affinité spécifiques d'étiquette purification. Pendant ce temps, il augmente la pureté d'extraction des protéines de surface cellulaire basée sur la prémisse que la sialylation se produit principalement aux protéines de surface cellulaire. Bien que les facteurs endothéliaux ne puissent pas bloquer complètement la différenciation des NSPC élargis, l'étude comparative entre une co-culture et une culture différenciée fournit une méthode pratique pour identifier les protéines de surface enrichies en cellules souches sans avoir besoin de analyser les protéines des PNJ purifiées par FACS¹⁶. Nous croyons que cette approche peut être appliquée aux études des protéines de surface dans d'autres systèmes avec les modifications appropriées.

Protocole

Tous les protocoles animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par l'IACUC (Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux) de l'Université de Tsinghua et exécutés conformément aux lignes directrices de l'IACUC. L'établissement d'animaux de laboratoire de l'Université de Tsinghua a été accrédité par l'AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Pour la mise en scène des embryons, la mi-journée du bouchon vaginal identifié a été calculée comme jour embryonnaire 0.5 (E0.5).

REMARQUE: Toutes les cellules sont cultivées dans l'incubateur cellulaire dans des conditions de 37 oC et 5 % de CO_2.

1. Préparation de la culture endothéliale de souris dans les inserts de soutien perméables

REMARQUE: Les cellules BEND3 sont maintenues selon les instructions du fabricant.

1. Préparer le milieu cellulaire BEND3 (BM) en ajoutant 50 ml de FBS et 5 ml de pénicilline-streptomycine dans 500 mL de DMEM et bien mélanger.
2. Aspirer le milieu du plat et laver la culture des cellules BEND3 avec 1 ml de PBS une fois. Ajouter 1 ml de 0,25 % de trypsine-EDTA dans les cellules et incuber les cellules pendant 4 min à 37 oC.
3. Ajouter 1 ml de BM dans les cellules pour neutraliser la trypsine-EDTA et pipette de haut en bas doucement pour dissocier complètement les cellules. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 15 ml et granule retifugation par centrifugation à température ambiante (RT) pendant 5 min à 400 x g.
4. Aspirer le supernatant du tube et resuspendre les cellules avec 9 ml de BM frais, puis ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans un insert de soutien perméable. Ajouter un autre 2 ml de BM frais par puits à la chambre inférieure de la matrice. Continuer à la culture des cellules pour une journée.

2. Préparation de la souris primaire Cortical NSPCs Culture

1. Préparation de la plaque de culture, du milieu de digestion de papain, et du milieu de culture adhérent corticale (AM)
   1. Enrober les plaques de 6 puits de poly-L-lysine (PLL) en ajoutant 1 ml de solution PLL par puits dans des assiettes de 6 puits. Ensuite, incuber les plaques à RT pendant 30 min.
   2. Transférer la solution PLL dans un tube conique de 15 ml. Laver les assiettes 3 fois avec de l'eau distillée double. Sécher les assiettes et les mettre de côté jusqu'à utilisation.
   3. Préparer le milieu de digestion papane en ajoutant 50 U de papaïne, 50 L de L-glutamine, et 50 L de 100 mg/mL d'acétyl-L-cystéine dans 5 mL de DMEM. Mélanger brièvement le milieu et le réchauffer à 37 oC pendant 30 min pour l'activation des enzymes.
   4. Préparer le milieu de culture adhérent des cellules corticales (AM) : ajouter 500 l de L-glutamine, 500 l de pyruvate de sodium, 500 l de 100 mg/mL N-acétyl-L-Cystéine, 500 oL de N2, 1 mL de B27 et 5 l de 100 g/mL bFGF en 50 mL de DMME. Bien mélanger le milieu et le réchauffer à 37 oC avant de l'utiliser.
2. Préparation des cellules corticales cérébrales primaires et placage subséquent
   1. Sacrifiez une souris enceinte e10.5 chronométrée par dislocation cervicale.
      REMARQUE: À E10.5, une majorité de cellules prolifèrent des NSPC dans le cortex cérébral, donnant lieu à de grands clones de descendance in vitro.
   2. Stériliser l'abdomen à 75 % d'éthanol. Utilisez des ciseaux fins et des forceps micro-serrénés pour ouvrir l'abdomen en coupant la peau et le muscle sous-jacent le long du côté droit de la ligne médiane. Retirez l'utérus de la cavité abdominale doucement avec des forceps dentelés et coupez-le de la cavité abdominale avec des ciseaux fins.
   3. Laver l'utérus avec 40 ml de HBSS préréfrigéré dans un plat Petri de 10 cm. Ensuite, transférer l'utérus dans un nouveau plat Petri de 10 cm et le laver à nouveau avec 40 ml de HBSS pré-réfrigéré.
   4. Transférer l'utérus dans un nouveau plat Petri de 10 cm avec 40 ml de HBSS préréfrigéré. Retirer les embryons de l'utérus et de la membrane amniotique, puis couper les têtes des embryons des troncs avec des microforceps de bijoux.
   5. Laver les têtes avec 40 ml de HBSS pré-réfrigéré et transférer les têtes à un nouveau plat Petri de 10 cm avec 40 ml de HBSS pré-réfrigéré. Utilisez des microforceps de bijoutiers pour éplucher la peau et le cartilage couvrant les cerveaux, puis couper les cortices cérébraux et les recueillir dans un tube conique de 15 ml avec HBSS pré-réfrigéré.
   6. Pelleter les cortices par centrifugation pendant 3 min à 4 oC et 300 x g. Aspirez le supernatant du tube, puis ajoutez le milieu de digestion de papain activé et 15 l de 4 mg/mL DNase I dans la granule de tissu.
   7. Resuspendre brièvement la pastille tissulaire par un doux tourbillonnement. Incuber le tissu à 37 oC pendant 30 min. Pendant ce temps, desserrer le tissu en faisant un bref vortex toutes les 10 minutes.
      REMARQUE: À la fin de la digestion, il ne devrait pas y avoir de morceaux de tissu visibles dans le tube.
   8. Pelleter les cellules corticales par centrifugation pendant 10 min à 4 oC et 450 x g. Aspirez le supernatant du tube et lavez la pastille cellulaire avec du DMEM pré-réfrigéré. Répétez cette étape une fois.
      REMARQUE: Pendant la digestion et le lavage, prenez garde de ne pas pipette les tissus et les granulés de cellules à peu près pour éviter d'endommager les cellules avec une forte force de tonte.
   9. Aspirez le supernatant du tube puis ajoutez 1,5 ml de HBSS pré-réfrigéré dans le tube. Dissocier la pastille de cellules corticales en cellules simples avec pipetting douce. Comptez le numéro de cellule avec un hémocytomètre.
   10. Ajouter 2 ml de AM et 2 x 10⁴ cellules corticales par puits dans des plaques de 6 puits. Incuber la plaque à 37 oC et 5 % de CO₂ pendant 3 h pour laisser les cellules se fixer à la plaque.

3. Mise en place de Neural-endothelial Co-culture et Ac₄ManNAz Labeling System

1. Un jour après le placage des cellules BEND3 dans les inserts, aspirez doucement le milieu dans la chambre inférieure d'abord, puis les inserts. Laver l'enface des inserts 3 fois avec dMEM pré-chauffé. Laver la surface extérieure des inserts en rinçant avec le DMEM préréchauffé.
2. Ajouter 1 ml de AM pré-chauffé dans un insert, puis transférer les inserts dans les puits avec des cellules corticales primaires. Incuber la co-culture à 37 oC et 5 % de CO₂ pour 12 h.
3. Dissoudre Ac₄ManNAz dans DMSO pour atteindre une concentration de stock de 200 mM. 12 h après la mise en place de la co-culture neural-endothéliale, ajouter 1 'L de stock Ac₄ManNAz par chambre inférieure et 0,5 'L de stock par insert dans la co-culture. Agiter les assiettes immédiatement et délicatement pour bien mélanger le milieu. Pour les cellules témoins, ajouter un volume égal de DMSO.
4. Culture des cellules pendant encore 5 jours à 37 oC et 5% CO₂. Préparer le AM avec 10x bFGF comme moyen de réalimentation (RM). Pendant ce temps, ajoutez 100 L de RM par insert et 200 OL de RM par chambre inférieure pour renourrir les cellules endothéliales et neurales tous les deux jours. Pendant la réalimentation, ne pas fournir Ac₄ManNAz ou DMSO dans la culture.

4. Coloration immunofluorescente des sialoglycoprotéines dans les NSPC primaires élargis et les neurones différenciés

1. Préparer Le complexe BTTAA-CuSO₄ 1 30x contenant 1,5 mM CuSO₄ et 9 mM BTTAA dans de l'eau à double distillation. Préparer un tampon fraîchement biotin-conjugué 1 contenant 50 M de biotine-alkyne, 2,5 mM d'ascorbate de sodium et 1 x Complexe BTTAA-CuSO₄ dans le PBS.
2. Retirer les inserts des plaques de co-culture. Aspirez le milieu de culture des puits inférieurs et lavez les cellules neurales une fois avec du PBS pré-chauffé.
3. Aspirez le PBS des puits. Ajouter 1 mL de solution PBS de paraformaldéhyde préréfrigérée de 4 % par puits dans les cellules et fixer les cellules à RT pendant 10 min. Ensuite, lavez les cellules 3 fois avec du PBS pré-réfrigéré.
4. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 1 ml de tampon fraîchement préparé conjugué à la biotine 1 par puits dans les cellules. Incuber les cellules à RT pendant 10 min.
5. Aspirez le tampon de réaction des puits. Laver les cellules 3 fois avec du PBS. Préparer le tampon de coloration contenant 1% FBS et 1 'g/mL Alexa Fluor 647-streptavidin. Ajouter 1 ml de tampon de coloration par puits dans les cellules et incuber les cellules à RT pendant 30 min.
6. Aspirez le tampon de coloration des puits et des cellules lavées 3 fois avec pbS pré-réfrigéré. Préparer le tampon de blocage contenant 5% de BSA et 0,3% de détergent non ionique-100 dans PBS. Ajouter 1 ml de tampon de blocage par puits dans les cellules et incuber à RT pendant 10 minutes.
7. Préparer une solution d'anticorps primaire en diluant les anticorps anti-nestin et anti-tubulin III ensemble dans le tampon de blocage à des ratios de 1:20 et 1:1,000, respectivement. Retirez le tampon de blocage des puits et ajoutez 1 ml de solution d'anticorps primaire par puits dans les cellules. Incuber les cellules à 4 oC pendant la nuit.
8. Retirez la solution d'anticorps primaire des puits. Laver les cellules 3 fois avec du PBS préréfrigéré. Préparer une solution d'anticorps secondaire en diluant Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG1, Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgG2b, et DAPI ensemble en bloquant tampon à une dilution de 1:1,000. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 1 mL de solution d'anticorps secondaire par puits dans les cellules. Incuber les cellules à RT pendant 2 h.
9. Aspirez la solution d'anticorps des puits et lavez les cellules 3 fois avec du PBS pré-réfrigéré. Ensuite, les cellules sont prêtes pour la capture d'image.

5. Purification des sialoglycoprotéines des NSPC primaires élargies et des neurones différenciés

1. Préparer Le BTTAA-CuSO 4 complexe₂ 15x de bouillon contenant 1,5 mM CuSO₄ et 3 mM BTTAA dans de l'eau double distillée. Préparer le tampon de résuspension des protéines A contenant 4 % de SDS et 10 mM EDTA dans de l'eau doubledistillée; tampon de résuspension des protéines B contenant 150 mM De NaCl, 50 mM de triéthanolamine et 1 % d'éther d'oléoyle polyoxyéthylène (p. ex. Brij97) dans de l'eau distillée double avec pH 7,4. Avant l'utilisation, mélanger le tampon A:buffer B à 1:8 (vol/vol) pour préparer le tampon de résuspension des protéines. Préparer un tampon de lavage de protéines 1 contenant 2 % de SDS dans le SDPB; tampon de lavage de protéines 2 contenant 8 M d'urée en 250 mM de bicarbonate d'ammonium (ABC); et tampon de lavage de protéine 3 contenant 2.5 M NaCl dans PBS.
2. Retirer les inserts des plaques de co-culture. Aspirez le milieu de culture des puits inférieurs et lavez les cellules neurales une fois avec du PBS pré-réfrigéré.
3. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 200 l de tampon RIPA préréfrigéré par puits dans les plaques. Incuber les assiettes sur la glace pendant 5 min. Recueillir la lyse protéique dans des tubes de 1,5 ml. Pelleter les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 4 oC et 12 000 x g.
4. Transférer le supernatant dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Déterminer la concentration en protéines avec le kit BCA selon les instructions du fabricant. Ajuster la concentration en protéines à 1 mg/ml.
5. Ajouter 100 M d'alkyne-biotine, 2,5 mM d'ascorbate de sodium et 1 x BTTAA-CuSO₄ complexe de 2 à 1 ml de lyse protéinée et bien mélanger la solution. Incuber le mix à RT pendant 1 h.
6. Transférer la solution de réaction dans 20 ml de méthanol préréfrigéré dans un tube conique de 50 ml. Bien mélanger et incuber à -30 oC pendant la nuit pour précipiter les protéines.
7. Pelleter la protéine précipite par centrifugation pendant 15 min à 4 oC et 4 500 x g. Laver le granule de protéines deux fois avec 20 ml de méthanol préréfrigéré. Aspirez le supernatant du tube. Resuspendre la pastille protéique avec 4 ml de tampon de résuspension des protéines et transférer la résuspension des protéines dans un nouveau tube conique de 15 ml.
8. Prenez 50 l l de perles de streptavidin et lavez-les 3 fois avec du PBS. Ajouter les perles lavées dans la résuspension des protéines. Incuber la solution à 4 oC pour 3 h sur un rotateur vertical à une vitesse de rotation de 20 tr/min.
9. Laver les perles de façon séquentielle avec 6 types de tampons: tampon de lavage des protéines 1, tampon de lavage des protéines 2, tampon de lavage des protéines 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC et 0,05 M ABC.
10. Après le lavage, resuspendre les perles avec 20 L de PBS et transférer les perles dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ajouter 20 l de tampon de chargement de protéines 2x dans les perles et traiter à 95 oC pendant 10 min. Les échantillons de protéines doivent ensuite être soumis à SDS-PAGE et tachés de Coomassie bleu brillant R-250 selon les instructions du fabricant. Couper les protéines dans le gel comme indiqué par Coomassie bleu brillant R-250 pour l'analyse de spectrométrie de masse.

Résultats

L'ensemble de la procédure d'expansion in vitro et d'étiquetage métabolique des NSPC embryonnaires primaires prend 6 jours (figure 1A). La qualité de la lignée cellulaire BEND3 et des NSPC primaires fraîchement isolés est la clé d'une expérience réussie. Les cellules BEND3 sont la source de facteurs solubles qui stimulent l'auto-renouvellement et la prolifération des NSPC. Il faut s'assurer que les cellules BEND3 sont exemptes de toute contamination et se div...

Discussion

Les marqueurs de surface sont couramment utilisés pour étiqueter et purifier des types de cellules spécifiques in vitro et in vivo^17,18. La découverte de marqueurs de surface contribue grandement aux recherches sur la médecine régénérative et les cellules souches en fournissant des outils moléculaires pour enrichir sélectivement une population de cellules souches à partir de tissus normaux ou pathologiques et de plats de culture, offrant une cellule purifiée. pou...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1
Pyruvate de sodium	Sigma	P5280	1 %
N2 supplément	Gibco	17502048	1 à 100
N-acétyl-L-cystéine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
Supplément de B27	Gibco	17504044	1 à 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Facteur de croissance des fibroblastes de base	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122	1 %
Sérum fœtal de veau	Gibco	10099141	10 %
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0,25 %	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldéhyde	Sigma	158127	4 %
Saccharose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
Tampon RIPA	Thermo Scientific	89900
Tampon de chargement SDS-PAGE 2x	Solarbio	P1018
Plaque 6 puits	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Souris monoclonal anti-Nestin	Étude de développement Hybridoma Bank	Rat-401	1 à 20
Souris monoclonale anti-bêta-tubuline III	Sigma	T8860	1 à 1 000
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG1	invitrogen	A-21121	1 à 1 000
Alexa Fluor 546 chèvre anti-souris IgG2b	invitrogen	A-21143	1 à 1 000
Albumine bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA kit de dosage	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxyde	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alcyne-biotine	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Outils de Chimie	1084	100 & micro ; M
9AzSia	synthétisé en laboratoire
Ascorbate de sodium	Sigma	A4034
Méthanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugué streptavidine	invitrogen	S21374	1 à 1 000
Triéthanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin  ;	invitrogen	60210
Bicarbonate d’ammonium	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 & micro ; g/mL
Urea	Sigma	U5378