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Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

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DOI :

10.3791/59084

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26 février 2019

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1Department of Neuroanatomy and Molecular Brain Research, Ruhr University Bochum, 2Central Animal Facility of the Medical Faculty, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.

Résumé

La présente étude combine la transduction in utero par microscopie électronique à transmission (TEM) visant à une analyse morphométrique précis des paramètres ultrastructurales dans des structures topographiques clairement identifiés, touchés par une protéine d’intérêt qui est introduit dans l’organisme par l’intermédiaire de transfert viral. Cette approche combinée permet une transition sans heurt entre macrostructuraux ultrastructurale identification par cartes topographiques navigation suivantes dans un atlas de tissu. La microscopie électronique à haute résolution du tissu in-utero-transduites révèle l’ultrastructure fine de la neuropile et ses paramètres de plasticité, tels que les zones transversales bouton synaptique, le nombre de vésicules synaptiques et les mitochondries dans un profil de bouton, la longueur des contacts synaptiques, zones axonales transversales, l’épaisseur de la gaine de myéline, le nombre de lamelles de la myéline et des zones transversales des profils de mitochondries. L’analyse de ces paramètres révèle les idées essentielles de l’évolution de la plasticité ultrastructurale dans les domaines du système nerveux qui sont concernés par le transfert viral de la construction génétique. Cette méthode combinée peut non seulement être utilisée pour l’étude de l’effet direct des biomolécules génétiquement et/ou de médicaments sur la plasticité neuronale, mais ouvre également la possibilité d’étudier le sauvetage dans l’utérus de la plasticité neuronale (par exemple, dans le cadre de maladies neurodégénératives).

Introduction

Aucun photon ne peut pénétrer un spécimen de tissu ultraminces dans le grade de profondeur d’un électron. Cela attribue des avantages inestimables à TEM à capter des images de résolution nanométrique de structures fines par rapport à des techniques de microscopie optique. Par exemple, permet la visualisation des organites intracellulaires comme les mitochondries, mélanosomes et divers types de granules de sécrétion, les microtubules, microfilaments, cils, microvillosités et jonctions intercellulaires (surface de la cellule TEM des spécialisations), en particulier de synapses dans le système nerveux1,2,3,4. L’objectif global de la présente étude méthodologique est la reconnaissance ultrastructurale des changements dans la plasticité neuronale au cours du développement à interférence prénatale en combinant les techniques de l’état-of-the-art de transduction in utero et TEM. Virally protéines d’intérêt ont été transduites in utero dans le système nerveux central5,6,7, y compris la moelle épinière6. Par exemple, transduction in utero en combinaison avec le TEM a été utilisée pour étudier l’effet de la molécule d’adhésion cellulaire L1 sur moteur d’apprentissage plasticité chez les souris déficientes en L1, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre la L1 et protéines de récepteurs nucléaires dans les neurones cérébraux7.

L’analyse des paramètres de la neuroplasticité exige des informations précises sur la localisation des zones plus petites au sein du système nerveux. Par conséquent, il est adéquat décrire les détails ultrastructurales et leur orientation topographique exacte en ce qui concerne les autres structures. Dans la présente étude, on présente une méthode de préparatoire spécifique visant à l’étude détaillée des aires morphologiques distinctes basées sur la lumière et la microscopie électronique. Cette approche combine plusieurs techniques de manipulation des tissus, à partir de transduction in utero du cerveau de souris et de la moelle épinière et suivie de la fixation de la perfusion, enrobage moule et le traitement du tissu pour TEM. Une étape essentielle, comprise entre l’intégration et le traitement du tissu pour TEM est la documentation du tissu, en utilisant la technique de réflexion de la lumière d’interférence qui permet de documentation microphotographique et faible grossissement précise de tissu spécimens8,9,10. Incorporé à l’approche actuelle, cette technique permet aux chercheurs d’examiner les détails topographiques et structurelles des surfaces de tissus du système nerveux et des profils de tranche de spécimen avant leur préparation pour TEM.

Un cadre exceptionnel pour le cerveau entier de sectionnement correspond aux coordonnées stéréotaxiques. Ce châssis bénéficie de la reconstruction morphologique de (3D) en trois dimensions des zones dans le tissu nerveux et peut être utilisé pour l’analyse morphométrique. Les macrographs des sections visualisées sont assignés coordonnées topographiques et les sections numérotées construire des cartes dans un atlas de tissu.

Après résine de traitement, le tissu embarqué est sectionné en coupes ultrafines (< 70 nm) contenant des zones sélectionnées, selon les cartes de l’atlas de tissus mentionnés ci-dessus. Les sections ultra-minces sont soumises à des TEM d’obtenir des images haute résolution des paramètres (par exemple, section profil zones de boutons synaptiques ou fibres axonales) de la plasticité de leur contenu et des contacts aux structures voisines au sein du complexe neuropile.

Avec la méthode décrite ici, la transition sans heurt entre les macrostructures visualisées micro et nanostructures permet des études comparatives approfondies de la plasticité neuronale morphologique après in utero transduction des pays en développement nerveuse système.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux sujets ont été approuvés par les comités d’éthique animale institutionnelle des Etats fédéraux de Hambourg et Nordrhein-Westfalen, Allemagne.  Utiliser des instruments stériles, gants et manteaux aseptique pendant toute la procédure chirurgicale.

1. in Utero Transduction

  1. Préparer adeno-associated virus de type 1 (AAV1) codant pour la cible souhaitée (4 x 1011 virale particules/µL de AAV1) dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un pH de 7,4. Ajouter 0,1 mg/µL Fast Green et garder le mélange AAV1-Fast-vert à 37 ° C.
  2. Préparer une pointe fine capillaire avec la forme désirée (8 mm de longueur, avec un diamètre extérieur de 80 µm et un intérieur diamètre de 50 µm), à l’aide d’un extracteur d’une micropipette (paramètres : pression = 500, chaleur = 700, tirez = 0, vitesse = 80, temps = 200, voir la Table des matières < / c1 >). Casser l’extrémité du capillaire pour qu’il soit 4-5 mm.
  3. Monter un tube d’aspirateur (44 x 0,7 cm) avec la pointe capillaire et aspirer 15 µL du mélange AAV1-Fast-vert dans le capillaire.
  4. Gardez les animaux sujets à une température constante du corps physiologique de 37 ° C pendant toute la procédure.
  5. Placez les souris C57Bl/6 enceinte (embryonnaire jour 14,5) dans la chambre de préincubation et anesthésier la souris à l’isoflurane gazeux de 4 % (avec un débit volumétrique de 0,6 à 0,8 L/min).
  6. Injecter par voie sous-cutanée, de buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel).
  7. Placez votre souris anesthésiée sur la plaque préchauffée chirurgicale (37 ° C).
  8. Couvrir les yeux avec un lubrifiant.
  9. S’adapter à la souris avec le masque d’anesthésie (isoflurane gazeux de 1,5 % à un débit volumétrique de 0,6 à 0,8 L/min) sur la plaque chirurgicale et le rasage de la région de la peau abdominale. Essuyer la région rasée avec 3 X 75 % éthanol, puis avec betadine solution.
    Remarque : Surveiller en permanence le comportement de la respiration de la souris anesthésié. Ajuster la concentration du gaz isoflurane selon le modèle d’inhalation-exhalation de la souris.
  10. Vérifier l’absence du réflexe plantaire en serrant les phalanges de la patte arrière de la souris.
  11. Ouvrir la cavité abdominale en saisissant la peau avec une pince courbe dentelée iris (10 cm) et couper la peau le long de la mediana linea avec des ciseaux droites carbure de tungstène (10 cm), puis, en attrapant la paroi péritonéale avec droites pinces Dumont (12 cm, 0. 2 mm x 0.12 mm) et couper le mur le long de l’alba linea avec de droite Vanna ciseaux (8 cm).
  12. Placez un morceau de pellicule de paraffine fenêtrée sur l’ouverture abdominale et fixer le film sur les deux extrémités avec une pince hémostatique micro-moustique (12,5 cm, courbé).
  13. Exposer les cornes utérines avec un appareil de type cuillère pour ne pas endommager les embryons dans les cornes utérines. Appliquez quelques gouttes de PBS (37 ° C) sur les cornes utérines et inspecter les embryons pour des dommages ou des malformations à l’intérieur du sac utérin.
  14. Document de l’ordre et la position des embryons dans les cornes utérines. Tourner les embryons soigneusement à l’intérieur du sac utérin jusqu'à obtenir la position désirée pour l’injection.
  15. Injecter 1-2 µL du mélange AAV1-Fast-vert en inspectant visuellement le site d’injection (p. ex., les ventricules cérébraux) et la pénétration du colorant sous un stéréomicroscope.
  16. Documenter les embryons injectés et replacez les cornes utérines avec les embryons injectés dans la cavité abdominale.
  17. Appliquez quelques gouttes de PBS (37 ° C) dans la cavité abdominale. Fermer la cavité en suturant la paroi péritonéale (utilisation polyamide taille 0-6 sutures) et la peau (utilisation polyamide taille 0-3 points de suture), à l’aide de pinces hémostatiques à moustiques de Halsted (12,5 cm, courbé). Également utiliser un simple motif interrompu ou inox suture/agrafes pour fermer la cavité abdominale et la peau.

2. Telemacrophotography de tissus isolés

  1. Préparation des tampons
    1. Préparer les tampon de Sörensen (1 L) de dissolution g 14,95 de Na2HPO4 et 2,18 g de KH2PO4 dans 1 L d’eau distillée sous agitation à 200 tr/min. Pour la perfusion de la fin, chiots de gestation et/ou petits dans le post natal des périodes de temps, utiliser la bonne taille d’aiguilles pour injection abdominale ou intragastrique et s’assurer que la concentration de l’anesthésie au pentobarbital de sodium terminal ne dépasse pas 180 mg / kg de poids de corps.
    2. Préparer la solution de fixation de Mugnaini (5 L) en chauffant 500 mL d’eau distillée à 75 ° C et ajouter 50 g de poudre de paraformaldéhyde sous agitation à 200 tr/min, ajouter 200 µL de 5 N NaOH, ajouter 1 500 mL de tampon de Sörensen, 1 750 mL d’eau distillée et 500 mL de glutaraldéhyde à 25 %. Remplissez jusqu'à 5 000 mL d’eau distillée. Utilisez ce dernier tampon pour perfusion.
      NOTE : Préparer la solution de fixation de Mugnaini sous le capot, porter des lunettes de protection et éviter les émanations. Ajouter le bleu de méthylène (0,05 g/L) pour une meilleure visualisation de la perfusion.
  2. Isolement de perfusion et tissus de souris
    1. Transcardially perfuse les souris enceintes qui transportent les embryons transduits (dans le cas d’études de l’embryon) ou les pubs transduits nés à l’âge désiré (par exemple, le jour après la naissance 24) selon les procédures standard6,7, 11,12,13,14,15,16,17, à l’aide de pentobarbital sodique terminal intrapéritonéale anesthésie (200 mg/kg de poids corporel).
    2. Injecter la souris transcardially avec solution héparinée (500 U) à l’aide d’un 26 G, 1 aiguille et, avant la fixation, infuser les souris transcardially avec 10 mL de PBS à débusquer le sang du corps et eux perfuse transcardially avec 30 mL de 40 ° C préchauffé Mugnaini solution de fixation.
      Remarque : Chez les souris adultes, effectuer une autre perfusion rétrograde par l’intermédiaire de l' aorte abdominale14.
    3. Isoler les tissus perfusés d’intérêt (par exemple, tout le cerveau ou la moelle épinière) et postfix le tissu dans au moins 10 mL de la solution de fixation de Mugnaini pendant encore 24 h à 4 ° C.
    4. Laver le tissu dans 10 mL de PBS pendant 3 h à température ambiante.
  3. Incorporation en gel d’agarose, majoré de documentation et sectionnement
    1. Ajuster les tissus isolés (par exemple, le cerveau entier) dans un cadre exceptionnel avec une reproductibilité sectionnement angle8,9,10. Vous pouvez également utiliser un vibratome avec une épaisseur de coupe réglable.
    2. Placer le tissu nerveux dans l’armature, ajuster le tissu pour telemacrography et documenter les coordonnées.
    3. Préparer 3 % bas point de fusion d’agarose-enrobage moyen : ajouter 3 g d’agarose dans 100 mL de tampon de Sörensen et chauffer le mélange dans un bain d’eau à 90 ° C.
    4. Verser 3 % d’agarose (30 ° C) dans le cadre qui contient le tissu. Couvrir le cadre avec un bloc de métal chaud et attendre qu’il soit durcissement. Durant l’endurcissement, utiliser des dispositifs de telemacrographic pour le tissu embarqué et ses coordonnées dans le cadre de l’image.
    5. Transvaser le tissu d’agarose-encastré dans un cadre avec des écarts de coupe correspondant aux coordonnées de la première image.
    6. Couper le tissu embarqué en sections de l’épaisseur désirée (par exemple, 1,5 mm) avec un appareil avec une lame de rasoir mince et vibrante (voir Table des matières).
      Remarque : Pour améliorer le glissement de la lame de rasoir, appliquez quelques gouttes de glycérine sur le tissu incorporé.
    7. Image de chaque section de tissu dans du PBS et recueillir les images dans un dossier.

3. préparation du tissu isolée pour la microscopie électronique à Transmission

Remarque : Effectuer toutes les autres étapes de l’incubation dans des plats en verre avec couvercle refermable étroitement sur une plate-forme vibrante sous le capot.

  1. Laver les coupes de tissus pour 2 x 30 min dans du PBS. Incuber les sections en solution aqueuse le tétroxyde d’osmium à 2 % (OsO4) pendant 2 h à température ambiante.
    Mise en garde : Le tétroxyde d’osmium est toxique et peut être nocif lorsqu’il entre en contact avec la peau.
  2. Laver les sections osmicated pour 2 x 30 min dans du PBS.
  3. Incuber les sections dans l’éthanol 70 % 30 % et 50 % à température ambiante pendant 10-15 min (en option : incuber dans l’éthanol à 70 % à 4 ° C pendant la nuit).
  4. Image les spécimens osmicated dans l’éthanol à 70 % sous LED RGB léger8,9,10 (2 x 15 W) appliquées à l’échantillon de gauche et à droite à un angle de 45 °. Utiliser les plats noirs et fond noir mat pour réduire au minimum la diffusion et la réflexion de la lumière au cours de l’illumination.
    Mise en garde : Ne laissez pas la section se dessécher pendant la formation image.
  5. Créer un atlas des images section avec coordonnées par collectionner des images en série dans un dossier.
  6. Incuber les échantillons à 100 % d’éthanol (2 x 30 min) et 100 % d’oxyde de propylène (2 x 30 min) à température ambiante.
    Mise en garde : Ne pas laisser les sections à se dessécher lors du changement des solutions.
  7. Mélanger les 260 mL de résine avec 240 mL d’anhydride dodecenylsuccinic dans un récipient en verre en remuant doucement d’un verre. Contrôler périodiquement d’inhomogénéité, bulles et frottis. Remuer très doucement, à la main pendant au moins 45 min.
  8. Préparer la résine/méthyloxiane à un ratio de 1:2 et 1:1 et ajouter 3 % accélérateur (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. Incuber le tissu dans le 1:2, intégration de solution de l’étape 3,8 pendant 2 h, puis dans la solution d’encastrement 1:1 de l’étape 3,8 pendant 2 h à température ambiante sur une roue en rotation.
  10. Placez le tissu en polypropylène plat plats, couvrir le tissu avec de la résine fraîche contenant 3 % accélérateur et guérir le tissu incorporé entre 65 et 85 ° C pendant 12 à 24 heures.
  11. Refroidir le tissu incorporé à la température ambiante et enlever les spécimens enrobées dans la résine de la vaisselle en polypropylène.

4. sélection des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurale pour l’analyse Quantitative

  1. Cartographie de la zone d’intérêt
    1. Choisissez un domaine d’intérêt (par exemple, le hippocampe ou le cervelet) et localiser la zone dans l’atlas de la section en choisissant l’image de l’atlas (étape 3.5) qui contient la matière.
    2. Esquissez les frontières de la zone d’intérêt sur la section image et trouver/superposer ces frontières de la région sur le spécimen de résine.
    3. Marque de zéro les frontières de la région d’intérêt (par exemple, le hippocampe ou le cervelet) sur l’échantillon de résine, aide d’une aiguille fine jauge (26 G, 1 in).
    4. Chauffer l’échantillon de résine à 85 ° C dans un four pour ramollir la résine pour dégrossir ou, sinon, utiliser un dispositif de coupe, une lame mince ou papier de verre.
    5. La zone d’intérêt dans l’échantillon de résine avec une lame de rasoir de l’accise (voir Table des matières). Monter le spécimen sur la tenue des barres de verre acrylique du calibre requis par exemple avec (diamètre 8 mm) et d’une longueur de 1 cm avec de la colle. Taillez le spécimen monté pour semi - et coupes ultraminces.
    6. Préparer semi-fines (0,75 µm) et ultra-minces (70 nm) sections de la zone rognée en utilisant un ultramicrotome : définissez-la à 1,5 mm/s pour 0,75 µm d’épaisseur et à 0,7 mm/s pour 70 épaisseur nm.
    7. Recueillir les sections semi-fines sur des supports de verre et de tacher les sections avec 1 % toluidine bleu dans du PBS (pendant 4 min).
    8. Laver les sections plusieurs fois dans l’eau désionisée. Examiner les sections colorées sous microscope photonique à l’aide de 4 x (NA de ∞ 0.1 /-), 10 x (NA de ∞/0,17 0,22), 40 x (NA de 0.65 ∞/0,17) et 100 x objectifs (NA de 1,25 ∞/0,17).
    9. Recueillir des coupes ultrafines sur grilles de nickel. Soumettre les grilles à TEM à 180 kV et à 3, 200 x, 6, 000 x, et/ou un grossissement de 8 000 x.
  2. Analyse TEM
    1. Choisissez les paramètres ultrastructures d’intérêt pour l’analyse quantitative de TEM (par exemple, les boutons avec des vésicules et des mitochondries ou des axones myélinisés et nonmyelinated) et prendre des images de TEM de ces paramètres de moins de 3 ans, x 500, x 6 000 ou 8 000 x grossissement.

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Résultats

Pour l’anesthésie fiable et rapide des souris, nombreux paramètres de sécurité étaient considérés comme et un espace de travail optimisé de l’unité de l’anesthésie s’est avérée adéquate (Figure 1A). L’appareil est conçu pour contrôler le mélange de liquide isoflurane et l’air ambiant avec une précision requise pour une opération avec succès sur petits animaux, tels que les souris et les rats. Air et isoflurane sont mélangés dans le vaporisate...

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Discussion

Une étape cruciale de la transduction in utero est la procédure d’injection. L’injection précise dans les ventricules cérébraux ou dans un autre domaine d’intérêt nécessite l’expérience et les compétences pratiques. Le diluant l’astuce microcapillaire, moins les dommages de tissu peuvent se produire ; Cependant, c’est au détriment de l’augmentation de pression d’injection. Contrairement à l’électroporation in utero19,20,21,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient les collègues de l’animalerie à la faculté de médecine, Université de la Ruhr de Bochum, pour leurs soins de soutien et des animaux.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,4,6-Tris(diméthyl-aminométhyl)phénolServa36975
26 G x 1'' aiguilleHenke-Sass, Wolf GmbH
410 Unité d’anesthésie pour pompe à airInstruments biomédicaux (Univentor)8323102
Virus adéno-associé sérotype 1 (AAV1)UKE (Viral Core Facility)-Pour les références et les domaines cibles d’AAV1, voir : https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ et aussi : Vecteurs de livraison de gènes concepteurs : ingénierie moléculaire et évolution des vecteurs viraux adéno-associés pour un transfert de gènes amélioré. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 mars ; 25(3):489-99. Les vecteurs viraux AAV recombinants pseudotypés avec des capsides virales des sérotypes 1, 2 et 5 présentent une efficacité différentielle et un tropisme cellulaire après administration dans différentes régions du système nerveux central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. août 2004 ; 10(2):302-17. Les vecteurs de virus adéno-associés recombinants auto-complémentaires (scAAV) favorisent une transduction efficace indépendamment de la synthèse de l’ADN. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 août ; 8(16) :1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414faible gélification
Agarose Instruments biomédicaux (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9pour l’enrobage d’ensembles de réglage d’aspirateur de tissus
Sigma-AldrichA5177-5EA
Masque respiratoire souris Aluminium anodiséInstruments biomédicaux (Univentor)-
buprénorphineAmpoules Temgesicanalgésiques
Science-ProduitsGB100TF-10avec fillament
Anhydride dodécénylsucciniqueFluka44160
Pince à épiler Dumont (#3, 12 cm, droite, 0,2 x 0,12 mm)FST11203-23
rasoir électriquePhillips-
Sutures Ethicon (Ethilon, 6-0 et 3-0)LubrifiantEthicon-polyamide
Bepanthene-Fast
GreenSigma-AldrichF7252pour la visualisation des liquides injectés Commutateur d’acheminement de
gaz Connecteurs 4/2Instruments biomédicaux (Univentor8433020
pince hémostatique Mosquito halsted (12,5 cm, droite)FST13011-12
Heparin-NatriumRatiopharm25 000 I.E./5 mL
Boîte à induction pour souris
avec couvercle mobile horizontalement.
Dimensions intérieures : LxLxH : 155 mm x 115 mm x 130 mm.
Épaisseur de paroi : 6 mm		Instruments biomédicaux (Univentor)-
pince à iris (10 cm, incurvée, dentelée)FST14007-14
Ciseaux à iris (11 cm, droits, carbure de tungstène)FST14501-14
Isofluran OP Tisch, chauffé électriquement, sm
Dimensions extérieures : 257mm x110 mm x 18 mm.
Surface de chauffage : 190 mm x 90 mm
L’évacuation de l’isoflurane s’échappant
le masque respiratoire se fait vers le bas conformément à la réglementation
Biomedical Instruments (Univentor)-
isoflurane (Attane)JD medicalinhalation anesthésie
LED Lumières RGBCameoCLQS15RGBWLEDs 2 x 15 W
Microscope optique Basic DM ELeica-4x(N.A. 0.1 &infin ;/-), 10x (N.A. 0.22 &infin ;/0.17), 40x (N.A. 0.65 &infin ;/0.17), 100x (N.A. 1.25 &infin ;/0.17) objectifs
tire-pipettesScience-ProductsP-97
Pince hémostatique Mosquito (12.5 cm, incurvé)FST13010-12
Grilles en nickel, 200 maillesTed Pella1GC200
Oxyde d’osmium (VIII)-Degussa73219
Oxyde de propylèneFluka82320
Lames de rasoirSchick87-10489
Pentobarbital sodique (Narcoren)Merial GmbH-
TC01mR 1-Régulateur de température channal avec rétroactionBiomedical Instruments (Univentor)-
Technovit 4004 deux composants colleKulzer
TelemacrodeviceCanon-CanonSpiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objectif, Rallonge inférieure à 150 mm, Tube d’extension manuel Anneau de 7 mm, Anneau de 14 mm, Anneau de 28 mm, Bague d’inversion macro (58 mm), Support de copie Canon.
Thermopuller P-97SutterInstruments-lame
de rasoir vibrante fine dispositifKrup-aveclames fines Szabo
bleu toluidineSigma-Aldrich89640
Microscope électronique à transmission C20Phillips-jusqu’à200 kV
Tygon 6/4 Matériau de tuyauterie pour l’assemblage de toutes les pièces
Diamètre extérieur : 6 mm
Diamètre intérieur : 4 mm
Wa
ll épaisseur : 1 mm		Biomedical Instruments (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor ScavengerBiomedical Instruments (Univentor)8338001
Ciseaux Vannas (8 cm, droits)FSTRéférence 15009-08
Pompe à air à résine capillaires pour les yeux

Références

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139(1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169(1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84(2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

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Microscopie lectronique transmissionAnalyse des boutons synaptiquespaisseur de la gaine de my lineNavigation dans l atlas tissulaireColoration au t troxyde d osmiumCoupes l ultramicrotomeInjection de virus ad no associ sCerveau de souris embryonnaire

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