Article de méthode

Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide

DOI :

10.3791/59152

⸱

12 février 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Un protocole pour la préparation de 13C,15échantillons fongiques et plantes marquées N pour la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle et enquêtes de polarisation nucléaire dynamique (DNP) est présenté.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole montre comment uniformément 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux peuvent être produites et comment ces matériaux souples devrait être traitée pour la RMN à l’état solide et DNP sensibilité améliorée des expériences. La procédure de traitement des échantillons de la biomasse végétale est aussi détaillée. Cette méthode permet la mesure d’une série de 1D et 2D 13C -13C /15N des spectres de corrélations, qui permet l’élucidation de la structure à haute résolution des biomatériaux complexes dans leur état natif, avec une perturbation minimale. Le marquage isotopique peut être examiné en quantifiant l’intensité dans les spectres de 1D et l’efficacité de transfert de polarisation dans les spectres de corrélation 2D. Le succès de la préparation d’échantillons de polarisation nucléaire dynamique (DNP) peut être évalué par le facteur de mise en valeur de sensibilité. D’autres expériences examinant les aspects structurels des polysaccharides et protéines conduira à un modèle de l’architecture en trois dimensions. Ces méthodes peuvent être modifiés et adaptés afin d’étudier un large éventail de matériaux riches en glucides, y compris les parois naturelles des plantes, des champignons, des algues et des bactéries, ainsi que de synthèse ou conçu de polymères glucidiques et leur complexe avec d’autres molécules.

Introduction

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Glucides jouent un rôle central dans divers processus biologiques tels que le stockage de l’énergie, renforcement structurel et reconnaissance cellulaire et adhérence. Ils sont enrichis dans la paroi cellulaire, qui est une composante fondamentale dans les plantes, les champignons, les algues et les bactéries1,2,3. La paroi cellulaire est une source centrale pour la production de biocarburants et de biomatériaux, mais aussi une cible prometteuse pour des thérapies antimicrobiennes4,5,6,7,8 , 9.

La compréhension contemporaine de ces matériaux complexes a été considérablement avancée par des décennies d’efforts qui ont été consacrées à la caractérisation à l’aide de quatre méthodes biochimiques ou génétiques importants. La première méthode majeure s’appuie sur des traitements séquentiels à l’aide de produits chimiques agressifs ou enzymes pour briser les parois cellulaires en différentes portions, qui est suivie par la composition et l’analyse de liaison de sucres dans chaque fraction de10. Cette méthode apporte un éclairage sur la répartition du domaine des polymères, mais l’interprétation peut prêter à confusion en raison des propriétés chimiques et physiques des biomolécules. Par exemple, il est difficile de déterminer si la fraction extractible à l’alcali provient d’un domaine unique de molécules moins structurées ou de molécules séparées dans l’espace avec la solubilité comparable. Deuxièmement, les parties extraites ou toute les parois cellulaires peut également être mesurées à l’aide de solution NMR pour déterminer les liaisons covalentes, aussi appelées réticulation, entre les différentes molécules11,12,13, 14,,15. De cette façon, la structure détaillée des ancres covalentes peut être sondée, mais limites peuvent exister en raison de la faible solubilité de polysaccharides, le relativement petit nombre de sites de réticulation et l’ignorance des effets non covalentes qui stabilise emballage de polysaccharide, y compris la liaison hydrogène, interaction électrostatique et force de van der Waals, enchevêtrement de polymère. Troisièmement, l’affinité de liaison a été déterminée in vitro à l’aide de polysaccharides isolées16,17,18,19, mais la purification procédures peuvent modifier considérablement la structure et les propriétés de ces biomolécules. Cette méthode échoue aussi à reproduire la déposition sophistiquée et l’assemblage des macromolécules après la biosynthèse. Enfin, le phénotype, de la morphologie cellulaire et de propriétés mécaniques des mutants génétiques dont la production atténuée certain composant de la paroi cellulaire hangar lumières sur les fonctions structurelles des polysaccharides, mais les preuves moléculaires plus est nécessaire pour combler ces observations macroscopiques avec la fonction ingénierie des protéines machineries20.

Les progrès récents dans l’élaboration et l’application de la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle ont introduit une occasion unique pour résoudre ces casse-tête structurel. Expériences de RMN à l’état solide 2D/3D permettent une enquête à haute résolution de la composition et l’architecture de matériaux riches en hydrates de carbone à l’état natif sans perturbation majeure. Des études structurales ont été menées avec succès à la fois primaire et parois secondaires des plantes, la biomasse catalytiquement traitée, biofilm bactérien, le pigment fantômes chez les champignons et récemment par les auteurs, les parois des cellules intactes dans un champignon pathogène Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. le développement de polarisation nucléaire dynamique (DNP)32,33,34,35,36,,du3738 , 39 , 40 , 41 , 42 facilite considérablement l’élucidation de la structure NMR comme l’accroissement de la sensibilité par DNP nettement réduit le temps expérimental sur ces biomatériaux complexes. Le protocole décrit ici en détail les procédures de marquage isotopique du champignon a. fumigatus et préparation fongique et des échantillons de végétaux pour la caractérisation de DNP et RMN à l’état solide. Procédures d’étiquetage similaires devraient s’appliquer aux autres champignons avec milieu modifié, et les procédures de préparation d’échantillon devraient être généralement applicables aux autres biomatériaux riches en glucides.

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Protocole

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1. croissance de 13C, 15N-étiqueté Aspergillus fumigatus milieu liquide

  1. Préparation sans étiquette et 13C, milieu de croissance marquée N 15
    NOTE : Les moyen de levure Extract Peptone Dextrose (DPJ) et l’amélioration moyenne minime43 ont été utilisés pour l’entretien des cultures fongiques. Toutes les étapes après la stérilisation sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination.
    1. Préparation du milieu liquide sans étiquette : dissoudre 6,5 g de poudre de la DPJ dans 100 mL d’eau distillée, puis stériliser pendant 25 minutes à 134 ° C.
    2. Préparation du milieu solide sans étiquette
      1. Ajouter 1,5 g d’agar et 6,5 g de poudre de la DPJ dans 100 mL d’eau distillée.
      2. Stériliser le milieu pendant 25 min à 121 ° C, puis laissez refroidir à 50 ° c environ.
      3. Transférer les 13-15 mL de milieu dans chaque pré stérile plastique pétri et couvrir le plat à l’aide d’un couvercle immédiatement.
    3. Préparation de 13C, 15N marqué un milieu liquide
      Remarque : Pour préparer la solution de croissance isotope labeling, un milieu minimal contenant 13C-glucose et 15N-sodium nitrate et une solution d’oligo-éléments sont préparés séparément et ensuite mélangés avant utilisation.
      1. Préparer 100 mL de milieu minimal contenant des isotopes comme indiqué au tableau 1. Ajuster le pH à 6,6 à l’aide de NaOH (1 M) ou une solution de HCl (1M).
      2. Stériliser le milieu minimal pendant 25 min à 121 ° C.
      3. Préparation de 100 mL (1, 000 x) de solution d’oligo-éléments, dissoudre les sels énumérés au tableau 2 de l’eau distillée. Autoclave la solution pendant 25 min à 134 ° C. Refroidir et conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation à court terme. Le pH sera environ 6,5 et peut être vérifié à l’aide d’un pH-mètre.
      4. Ajouter 0,1 mL de solution d’oligo-éléments pour 100 mL de 13C, un milieu minimal marqué N 15figurant au tableau 2 avant utilisation.
  2. Croissance des matériaux fongiques
    1. Transférer une petite quantité de champignons du stockage sur une plaque de la DPJ en utilisant une boucle inoculer dans une hotte à flux laminaire. Conserver la culture à 30 ° C pendant 2 jours dans un incubateur.
    2. Une boucle d’inoculation permet de transférer un actif bord fongique croissant aux 13C, solution de marquage N15sous une hotte à flux laminaire. Conserver la culture à 30 ° C pendant 3 à 5 jours à 220 tr/min dans un incubateur à agitation.
    3. Centrifuger à 4 000 x g pendant 20 min. Retirez le surnageant et recueillir le culot.
    4. Utiliser une pince pour collecter ~0.5 g de granulés bien hydratée (> 50 % d’hydratation wt) pour les études de RMN. Perte d’hydratation à n’importe quel point s’aggravera considérablement la résolution spectrale.
      Remarque : Si nécessaire, une petite quantité (0,1 g) des mycéliums hydratés peut être séparée et complètement desséchée sous flux de gaz N2 dans une hotte ou un lyophilisateur pour estimer le niveau d’hydratation et de calculer le pourcentage en masse sèche. Généralement, un culot contenant ~0.3 g masse sèche peut être obtenue après 3 jours. Si l’expérience de NMR à effectuer est long (> 7 jours) ou si l’état des champignons doit être fixée, le matériel fongique peut être profondément figé en liquide N2 pour 10-20 min avant traitement ultérieur. Si l’expérience sera courte (3 à 6 jours), le gel peut être ignoré alors que l’échantillon peut rester fraîche.
    5. Mélanger le matériau excédentaire avec 20 % (v/v) de glycérol dans un tube à centrifuger et gardez-le dans un congélateur à-80 ᵒC pour le stockage à long terme.

2. Elaboration d’a. fumigatus pour Solid-State NMR et études de DNP

  1. Préparation d’a. fumigatus pour des expériences RMN à l’état solide
    1. Dialyser le 13C, 15N-étiqueté fongiques échantillon (étape 1.2.4.) contre 1 L de tampon de phosphate de 10 mM (pH 7,0) à 4 ° C à l’aide d’un sac de dialyse dont le poids moléculaire kDa 3.5 coupure pour enlever les petites molécules depuis le milieu de culture pour une durée totale de 3 jours. Changer le tampon deux fois par jour.
      Remarque : Par ailleurs, l’échantillon pourrait être lavé pour 6 à 10 fois à l’aide de l’eau déionisée pour enlever les résidus petites molécules.
    2. Transférer l’échantillon dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min (10 000 x g) à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Retirer le surnageant et récupérer le matériel fongique restant.
    3. Pack de 70-80 mg de l’uniforme 13échantillon C marqué et bien hydratée collez dans un ZrO2 rotor de 4 mm ou 30-50 mg à rotors de 3,2 mm pour des expériences RMN. Répétitivement squeeze l’échantillon délicatement à l’aide d’une tige de métal et absorber l’excès d’eau à l’aide de papier.
    4. Fermement, cap rotor et introduire l’échantillon dans le spectromètre pour la caractérisation de NMR à l’état solide.
      Remarque : Les rotors flambant neufs sont suggérées pour réduire les risques d’écrasement de rotor et les exemples de déversement dans le spectromètre RMN. Si nécessaire, un insert jetable de Kel-F avec vis d’étanchéité peut être utilisé pour servir de conteneur secondaire à l’intérieur du rotor.
  2. Préparation des échantillons d’a. fumigatus pour expériences DNP
    1. Préparer 100 µL de DNP solvants29,44 (également connu sous le nom la matrice DNP) dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour 13C,15N marquée des échantillons fongiques. Cette matrice DNP contient un mélange de d8-glycérol/D2O/H2O (30/60/10 % en volume).
      NOTE : Si non étiquetées échantillons doivent être analysés, puis préparer la matrice DNP utilisant 13appauvris en C d8-glycérol (12C3, 99,95 % ; D8, 98 %) et D2O et H2O pour éviter 13C signal contribution de solvants.
    2. Dissoudre 0,7 mg de AMUPol de45 à 100 µL de solvants DNP de solution-mère radical forme 10 mM. Vortex pour 2-3 min pour s’assurer que les radicaux sont entièrement dissous dans la solution.
    3. Faire tremper 10 mg des dialysés 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux tel que décrit dans les étapes antérieures (points 2.1.1 et 2.1.2) dans 50 µL de solution de AMUPol et légèrement hachez le mélange à l’aide d’un pilon et un mortier pour assurer une pénétration des radicaux dans les parois poreuses.
      Remarque : Pour réduire le taux de perte d’hydratation, le broyage peut également avoir lieu dans un tube de microcentrifuge à l’aide d’un micropestle.
    4. Ajouter un autre 30 µL de la solution radicale au culot broyé à l’hydrate davantage l’échantillon fongique.
    5. Emballer le culot dans un rotor de saphir de 3,2 mm, presser légèrement et retirer l’excès de solvant DNP. Ajouter une fiche de 3,2 mm silicone pour empêcher la perte d’hydratation. En général, 5 à 30 mg d’échantillon peuvent être transporté vers le rotor. La quantité exacte doit être déterminée par l’exigence de la sensibilité de l’expériences de RMN à effectuer.
    6. Insérer et lancer l’échantillon dans un spectromètre de DNP, mesurer un spectre DNP améliorée sous irradiation hyperfréquence et comparez-le avec le spectre micro-ondes-off. Cela conduira à une amélioration facteur εmarche/arrêt, qui devrait être de 20 à 40 pour ces matériaux complexes. Exécuter les expériences conçues pour déterminer la structure de la paroi cellulaire.

3. préparation de la biomasse végétale pour la RMN et des études DNP

  1. Préparation des matières végétales pour NMR à semi-conducteurs
    1. Produire uniformément 13plantes marquées C internes à l’aide de 13CO2 fournitures dans une chambre ou 13C-glucose milieu de croissance comme décrit plus haut46,47 ou acheter directement des matériaux marqués de sociétés de marquage isotopique.
      NOTE : 13C-glucose utilisable uniquement en croissance sombre pour éviter l’introduction de 12C de la photosynthèse.
    2. Couper l’uniformément 13C marqué matériel végétal en petits morceaux (généralement 1-2 mm de dimension) à l’aide d’une lame de rasoir de laboratoire.
      Remarque : Selon le but, les parois des cellules extraites sont parfois utilisés pour la caractérisation structurale et les protocoles détaillés sont signalés dans les précédentes études21,46.
    3. Si l’échantillon a été préalablement séché, ajouter 100 µL d’eau à 30 mg de matières végétales dans un tube de microtubes de 1,5 mL, vortex, équilibrer à température ambiante pendant 1 jour. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min et enlever l’excès d’eau à l’aide d’une pipette.
    4. Si l’échantillon n’était jamais séché à tout moment, directement utiliser l’échantillon sans autre traitement.
    5. Emballer le matériel végétal qui en résulte dans 3,2 mm ou 4 mm ZrO2 rotors pour des expériences RMN à l’état solide.
  2. Préparation des matières végétales pour études DNP
    1. Préparer 60 µL solution de 10 mM AMUPol radical comme étapes décrites 2.2.1 et 2.2.2.
    2. Couper l’uniformément 13C marqué matière végétale à être étudiés en petits morceaux (1-2 mm de dimension) à l’aide d’une lame de rasoir de laboratoire et peser 20 mg des matières végétales.
    3. Main-broyer les morceaux de plante en petites particules (~ 1-2 mm de la taille) à l’aide d’un mortier et un pilon. Les poudres finales ont un aspect homogène.
    4. Ajouter 40 µL de la solution mère de DNP préparées à l’étape précédente (étape 2.2.2) pour le matériel végétal et broyer légèrement pendant 5 min pour homogène mélange avec le radical.
    5. Ajouter un autre 20 µL de la solution mère à hydrater davantage le matériel végétal après broyage.
    6. Emballer l’échantillon de plante équilibrée dans un rotor de saphir de 3,2 mm pour des expériences DNP. Mettez une cheville de silicone pour éviter la perte d’hydratation.

4. des expériences de RMN à l’état solide standard pour la caractérisation initiale des biomatériaux riches en glucides

Remarque : Un bref aperçu de l’expériences RMN est fourni dans cette section. Cependant, l’élucidation de la structure nécessite généralement une vaste expertise. Par conséquent, des efforts de collaboration avec les spectroscopistes NMR est recommandé.

  1. Mesure 1D 13C Cross polarisation (CP), 13polarisation directe C (DP) avec 2 s et 35-s recycler les retards et 1H -13C INEPTE48,49 spectra afin d’obtenir une compréhension générale de la dynamique distribution de composants cellulaires (Figure 1 a). Les parois cellulaires sont en général la partie relativement rigide et pièce dominantes signaux dans le spectre de CP.
  2. Mesurer une série d’expériences de corrélation 2D standard 13C -13C pour les affectations de résonance des signaux 13C. Commencez par recentré insuffisante50,51 pour obtenir la connectivité de carbone, qui ont besoin d’être assisté par une série d’expériences à travers l’espace comme 1,5-ms RFDR52 (Figure 1 b) et cordon de 50 ms/DARR53 des expériences.
    Remarque : Si il est intéressant de trouver un échantillon riche en un composant spécifique, par exemple, le primaire ou secondaire parois, puis plusieurs segments ou plusieurs usines devrez peut-être être mesuré séparément pour rechercher l’exemple avec la composition optimale.
  3. Mener des expériences de corrélation 2D 15N -13C qui peuvent être mesurées pour faciliter les affectations de résonance des protéines et des glucides azotées.
    Remarque : La cession de résonance est en général beaucoup de temps. Une méthode est actuellement développée pour faciliter la cession de la résonance des signaux de glucides pour les scientifiques sans expérience préalable.
  4. Mesurer les expériences plus spécialisés pour déterminer les proximités spatiales (Figure 1 c, d), l’hydratation et la mobilités des biomolécules complexes pour déterminer la structure tridimensionnelle des matières riches en glucides comme systématiquement décrits précédemment22,29.

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Résultats

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L’isotope labeling sensiblement augmente la sensibilité de NMR et rend possible pour mesurer une série de 2D 13C -13C et spectres de corrélation15N 13C - d’analyser la composition, l’hydratation, la mobilité et de l’emballage de polymères, qui seront intégrés à construire un modèle tridimensionnel de l’architecture de la paroi cellulaire (Figure 1). Si l’étiquetage uniforme réussit, un ensemble complet de 1D 13...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comparé à des méthodes biochimiques, NMR à semi-conducteurs a des avantages comme une technique non destructive et haute résolution. RMN est également quantitative à l’analyse de la composition, et contrairement à la plupart des autres méthodes analytiques, ne fait pas ont les incertitudes introduites par la solubilité limitée de biopolymères. Mise en place du protocole actuel facilite les études futures sur les riches en glucides de biomatériaux et polymères fonctionnalisés. Toutefois, il est à noter que l’analyse de do...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation, par le biais de NSF OIA-1833040. Le laboratoire National de champ magnétique élevé (NHMFL) est pris en charge par la National Science Foundation, par le biais de DMR-1157490 et l’état de Floride. Le système MAS-DNP au NHMFL est financé en partie par les NIH S10 OD018519 et NSF CHE-1229170.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ammonium Molybdate TétrahydratéAcros Organics12054-85-2
AMUPolCortecnetC010P002
Balance analytiqueOhausB730439218Modèle PA84C
Bioclave 16 LVWR470230-598
Cabinet de biosécuritéLabconco corporation302319100
Acide boriqueVWRBDH9222magasin à 15-30 ° ; C
Chlorure de cobalt (II) hexahydratéHoneywell |Fluka60820&ge ; 98 %
Sulfate de cuivre(II) pentahydratéBDHBDH9312&ge ; 98 %
Incubateur à secousses Corning LSEThermo Fisher Scientific7202152
D2OSigma Aldrich15188299,9 atomes % D
d6-DMSOSigma Aldrich15187499,9 atomes % D
d8-glycérolSigma Aldrich447498&ge ; 99 atomes % D
Tube de dialyse 3,2 kDaSigma AldrichD2272132724
Phosphate dipotassiqueVWRBDH9266&ge ; 98 %
GlycérolSigma AldrichG5516&ge ; 99.5 %
Heraus Megafuge 16R CentrifugeuseThermo Fischer Scientific750004271Maximum RCF 25 830 x g
HR-MAS Kit d’insertion jetableBrukerB4493Kel-F
Sulfate de fer(II) HeptahydrateAlfa Aesar14498&ge ; 99+ %
de sulfate de magnésium heptahydratéVWR10034998stocker à 18-26 ° ; C
Chlorure de manganèse(II) tétrahydratéAlfa Aesar11563&ge ; 99 %
Phosphate monopotassiqueVWR470302-254&ge ; 99 %
pH-mètreMettler ToledoB706689216
Tétrasodium EthylènediaminetétraacétateAcros Organics13235-36-9&ge ; 99,5 %
Sulfate de zinc heptahydratéAlfa Aesar33399&ge ; 98 %
12C3, d8-glycérolLaboratoire d’isotopes de CambridgeCDLM-866012C3, 99,95 %; D8, 98 %
13C6-glucoseSigma Alrdrich364606&ge ; 99 % (CP)
15N-nitrate de sodiumSigma Aldrich364606&ge ; 98 % 15N, &ge ; 99 (cp)
Rotor RMN saphir 3,2 mmCortecnetB6939
Bouchon silicone 3,2 mmBrukerB7089
Kit rotor MAS 4 mmBrukerH14355Zircone

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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